王進，張晶晶,2,3，李曉晨，寧喜斌,2,3，羅磊，蔣敏，李曉暉,2,3*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品及加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306) 3(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室，上海，201306)

奶疙瘩是新疆哈薩克族的傳統(tǒng)乳品，由牛奶或羊(馬)奶自然發(fā)酵后去水干燥而成，按制作工藝分可分為酸凝和酶凝兩種，其氣味獨特、工藝簡單且富含多種營養(yǎng)[1-2]。我國傳統(tǒng)奶酪乳酸菌種類多樣，已分離出植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)等具有良好益生特性和風味特征的菌株[3-7]。ZHENG等[8]對新疆哈薩克族傳統(tǒng)奶酪研究，發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬(Lactobacillus)與乙醇、丁酸、乙酸和丙氨酸相關(guān)；鏈球菌屬(Streptococcus)主要為乙偶姻、乳酸乙酯和2-甲基丁酸乙酯的貢獻菌屬。GUARRASI等[9]對2種發(fā)酵型乳酸菌和9種非發(fā)酵乳酸菌產(chǎn)風味化合物研究發(fā)現(xiàn)，乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)和 2-丁醇、丁酸、己酸及其相應(yīng)的酯類物質(zhì)有關(guān)；干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌主要產(chǎn)2,3-丁二酮、2-羥基-丁酮。除乳酸菌之外，乳制品中其他細菌如丙酸桿菌、腸桿菌、無氧芽胞桿菌屬和酵母菌等也有助于風味和色澤的形成。目前，對于新疆不同原料奶疙瘩細菌多樣性與氣味特征的探究鮮有報道。

近年來，以Miseq為代表的第二代高通量測序技術(shù)具有通量高、取樣量少和操作簡單等優(yōu)點，可對樣品中不同微生物種群組成進行快速分析。固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜(solid-phase microextraction-GC-MS，SPME-GC-MS)聯(lián)用技術(shù)通常用來檢測不同樣品中揮發(fā)性物質(zhì)，目前高通量測序結(jié)合SPME-GC-MS已廣泛應(yīng)用于奶酪[10-11]、發(fā)酵肉制品[12]、酒醅[13]、腌制品[14]等微生物群落多樣性和揮發(fā)性物質(zhì)的研究。本研究對新疆地區(qū)牛奶疙瘩、酸奶疙瘩和羊奶疙瘩樣品，采用Miseq高通量測序技術(shù)分析其細菌群落，同時結(jié)合SPME-GC-MS分析不同奶疙瘩的揮發(fā)性物質(zhì)差異，以期為后續(xù)挖掘奶疙瘩的優(yōu)良菌種資源和提升奶疙瘩風味提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

奶疙瘩樣品于2019年3月和6月采集自新疆地區(qū)。每種奶疙瘩各采集10份，編號為牛奶疙瘩(NNL_1)、牛奶疙瘩(NNL_2)、羊奶疙瘩(YNL)和酸奶疙瘩(SNGD)。樣品見圖1。

主要試劑有TaqDNA polymerase、dNTPs、DL2000TM DNA Marker，大連寶生物有限公司；蛋白酶K，Merck集團；溶菌酶，Sigma集團。

1.2 儀器與設(shè)備

Illumina Miseq高通量測序平臺，美國Illumina公司；R930機架式服務(wù)器，美國DELL公司；電子秤，永康市艾瑞貿(mào)易有限公司；7890-5977A氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國 Agilent 公司；探頭PT100，東陽市三星溫度儀表有限公司；手動SPME進樣器、萃取纖維頭50/30 μm，DVB/CAR/PDMS，美國Supelco公司；DF101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌，鞏義予華儀器有限責任公司；DEN-400拍打式均質(zhì)機，北京德世科技有限公司。

A-牛奶疙瘩(NNL_1);B-牛奶疙瘩(NNL_2); C-羊奶疙瘩(YNL);D-酸奶疙瘩(SNGD)圖1 新疆奶疙瘩樣品Fig.1 Samples of Xinjiang cheese

1.3 實驗方法

1.3.1 細菌群落的高通量測序分析

參考尚雪嬌等[15]的方法并做調(diào)整。每種樣品分別取10份混勻后，使用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒提取樣品細菌DNA。共計4個DNA樣本送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，采用338F-806R引物擴增16S rDNA V3～V4區(qū)進行高通量測序分析。采用QIIME軟件平臺調(diào)用UPARSE進行兩步對序列用于操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)進行分析，確定細菌OTU代表性序列的微生物分類水平并統(tǒng)計每個樣本的群落組成、結(jié)構(gòu)和組間差異的統(tǒng)計學(xué)和可視化分析。

1.3.2 奶疙瘩的SPME-GC-MS檢測

樣品的前處理：參考鄭曉吉等[16]的方法并做調(diào)整。每種樣品分別取10份混勻后，稱取3種樣品各25 g加入無菌均質(zhì)袋(20 cm×27 cm)中，加入無菌生理鹽水225 mL，均質(zhì)3 min。稱取樣液15 g放于樣品瓶中(27.5 mm×95 mm)，加蓋密封60 ℃水浴平衡10 min，吸附提取50 min。結(jié)束后將SPME纖維插入GC進樣口解吸5 min，檢測揮發(fā)性組分。

GC-MS條件：起始溫度30 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至120 ℃，以15 ℃/min升至250 ℃，保持3 min。進樣口溫度為250 ℃。離子源溫度230 ℃，質(zhì)譜掃描范圍為50～350m/z。

實驗數(shù)據(jù)經(jīng)計算機檢索與NIST11庫對照進行組分鑒定，對匹配度>800的物質(zhì)予以分析。采用峰面積歸一法確定揮發(fā)性組分的相對含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用上海美吉生物云平臺、IBM SPSS Statistics 20軟件對數(shù)據(jù)進行處理和Pearson相關(guān)性分析，采用Origin 6.0軟件制圖和Cytoscape軟件進行網(wǎng)絡(luò)可視化制圖。

相對氣味活度值(relative odor activity value,ROAV)的計算[17]：通常選閾值較低，但百分含量較高的化合物組分，首先定義對樣品貢獻最大的組分為ROAVmax=100，其他香氣組分則按公式(1)計算：

(1)

式中：Ci和Ti分別為各揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量(%)和相對應(yīng)的感覺閾值(μg/L)；Cmax和Tmax分別為對樣品總體氣味貢獻最大組分的相對含量(%)和相對應(yīng)的感覺閾值(μg/L)。所有組分ROAV≤100，而且ROAV越大的組分對樣品總體氣味的貢獻也就越大。所有物質(zhì)的計算結(jié)果需要滿足0≤ROAV≤100，一般把ROAV≥1的化合物作為主要的貢獻組分，0.1≤ROAV<1的組分對所測樣品的總體氣味具有重要修飾作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 新疆奶疙瘩的細菌多樣性分析

2.1.1 α多樣性指數(shù)分析

本研究共采集了4種新疆奶疙瘩樣品，對其進行高通量測序，根據(jù)微生物多樣性分析結(jié)果，選取菌群差異較大的3個樣品進行揮發(fā)性物質(zhì)分析。

對不同樣品在97%一致性閾值下的α多樣性指數(shù)進行統(tǒng)計，結(jié)果見表1。所有樣品的Coverage指數(shù)均>0.99，說明測序結(jié)果可信。SNGD的Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)均最高，其物種豐富度和群落多樣性水平相對較高。

2.1.2 屬水平群落結(jié)構(gòu)分析

由圖2可知，在屬水平上NNL_1的主要群落組成為：Lactobacillus(16.03%)，Streptococcus(15.25%)，Lactococcus(乳球菌屬，6.14%)，Kurthia(庫特氏菌屬，9.80%)，Enterococcus(腸球菌屬，7.55%)，Leuconostoc(明串珠菌屬，6.99%)，norank_f__Muribaculaceae(6.97%)和Klebsiella(克雷伯氏菌屬，3.86%)。NNL_2主要群落組成為：Streptococcus(52.55%)，Lactococcus(13.30%)，Anoxybacillus(厭氧芽孢桿菌屬，17.12%)，Thermus(棲熱菌屬，6.19%)。YNL的主要群落組成為：Streptococcus(58.20%)，Lactobacillus(13.97%)，Lactococcus(18.05%)。SNGD主要群落組成為：Acetobacter(醋酸桿菌屬，22.78%)，Lactobacillus(9.95%)，norank_f__Muribaculaceae(9.1%)，Rhodococcus(紅球菌屬)和Acinetobacter(不動桿菌屬)占比在4%～5%，Bacteroides(擬桿菌屬)、Brevundimonas(短波單胞菌屬)、Gluconobacter(葡糖桿菌屬)和Arthrobacter(節(jié)桿菌屬)占比都在2%～3%。

表1 新疆奶疙瘩中細菌α多樣性Table 1 α Diversity indexes of bacterial communities in Xinjiang cheeses

圖2 新疆奶疙瘩中屬水平分布柱狀圖Fig.2 Relative abundances of bacterial communities at the genus level in Xinjiang cheeses

2.2 新疆奶疙瘩樣品揮發(fā)性物質(zhì)分析

新疆奶疙瘩中主要揮發(fā)性物質(zhì)包括酯類、醇類、酮類、醛類、酸類和其他類共8大類，總計68種。結(jié)果見表2。癸酸乙酯為3種奶疙瘩樣品共有組分(ROAVmax=100)。癸醛為3種不同原料奶疙瘩中共有的關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)(ROAV>1)。丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和2-十一酮對牛奶疙瘩(NNL_1)香氣起重要修飾作用(0.1≤ROAV<1)；丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯為羊奶疙瘩(YNL)中關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)(ROAV>1)；辛酸乙酯、庚醛、壬醛、3-甲基丁醛和1-辛烯-3-醇對羊奶疙瘩氣味起重要修飾作用(0.1≤ROAV<1)；丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、十二酸乙酯、壬醛、1-辛烯-3-醇和3-甲基丁醇對酸奶疙瘩(SNGD)香氣起重要修飾作用(0.1≤ROAV<1)。

奶疙瘩中酯類化合物主要有乙酸乙酯、乙酸己酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯等，與李露等[18]對新疆奶疙瘩揮發(fā)性研究結(jié)果較一致。這類C2～C8酯類化合物大多揮發(fā)性較強，閾值較低，能夠賦予奶酪甜味、水果味及花香味，而且能夠很好地掩蓋奶酪中脂肪酸和胺類物質(zhì)所產(chǎn)生不愉快的氣味。3種共有醛類化合物為庚醛、壬醛、癸醛。庚醛賦予奶疙瘩水果味；癸醛賦予奶疙瘩油脂味和青草味；壬醛賦予奶疙瘩脂肪味。醛類化合物的形成途徑通過脂肪酸代謝、氨基酸轉(zhuǎn)氨基作用或Strecker降解，易被還原成相應(yīng)的醇，因此在奶酪中含量較少。

醇類化合物的形成主要通過甲基酮和醛類還原、乳糖代謝、氨基酸代謝以及脂肪酸的降解。3-甲基丁醇是由奶酪成熟過程中蛋白質(zhì)分解形成的亮氨酸通過Strecker降解，經(jīng)轉(zhuǎn)氨、脫羧、還原形成具有花香味和酒香味。苯乙醇是由苯丙氨酸經(jīng)酵母菌代謝形成具有玫瑰花香味，僅在SNGD樣品中被檢出，可能與奶疙瘩發(fā)酵制作時酵母菌的作用有關(guān)。

2.3 微生物與揮發(fā)性物質(zhì)的關(guān)系分析

通過計算豐度前7的優(yōu)勢菌屬和ROAV≥0.01的揮發(fā)性物質(zhì)相對含量之間的Pearson相關(guān)系數(shù)，選取相關(guān)性顯著(P<0.05)的部分，構(gòu)建了7個菌屬與11種揮發(fā)性物質(zhì)的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖，如圖3所示。Streptococcus、Lactobacillus和Lactococcus在牛奶疙瘩和羊奶疙瘩中占比較高，與癸酸乙酯、己酸乙酯和2-十一酮呈正相關(guān)。Acetobacter在酸奶疙瘩中占比最高，與壬醛、癸醛和1-辛烯-3-醇呈正相關(guān)，與2-十一酮、癸酸乙酯、己酸乙酯呈負相關(guān)，是造成酸奶疙瘩的風味與其他奶疙瘩的風味差異明顯的原因。Streptococcus和Lactococcus與3-甲基丁醛呈正相關(guān)。Kurthia、Enterococcus、Leuconostoc等非發(fā)酵型細菌與辛酸乙酯、癸酸乙酯、庚醛、癸酸和2-十一酮正相關(guān)，參與了奶酪成熟過程中風味的形成。

表2 三種新疆奶疙瘩中揮發(fā)性物質(zhì)Table 2 Volatile compounds in three Xinjiang cheeses

續(xù)表2

序號中文名稱氣味描述[19-21]閾值[22-25]/(μg·L-1)NNL_1YNLSNGD相對含量/%ROAV相對含量/%ROAV相對含量/%ROAV62苯乙烯—— — —0.46 —631,3,5-環(huán)戊二烯——0.54 ———64對二甲苯堅果味4 900——0.33 <0.01 0.16 <0.01 65丁基羥基甲苯杏仁味,苦澀味0.17 —10.70 —1.83 —661,2,4-三甲基苯——2.08 —1.47 —67甲基4,6-癸二烯基醚————0.21 —683-叔丁基-4-羥基苯甲醚——1.19 ———

圖3 新疆奶疙瘩中優(yōu)勢細菌屬與揮發(fā)性物質(zhì)相關(guān)性分析Fig.3 Correlation network analysis between dominant bacterial communities and key volatile compounds in Xinjiang cheeses注：綠色和黃色節(jié)點分布代表微生物和風味物質(zhì)；節(jié)點間連線 的顏色深淺表示兩者Pearson相關(guān)系數(shù)的大小，紅色線表示正相關(guān)， 藍色表示負相關(guān)

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用Illumina Miseq高通量測序平臺對4個奶疙瘩樣品中的細菌多樣性進行測序，4個奶疙瘩樣品中牛奶疙瘩和羊奶疙瘩中主要優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬，酸奶疙瘩中主要優(yōu)勢菌屬為醋酸桿菌屬和乳桿菌屬。利用SPME-GC-MS聯(lián)用技術(shù)鑒定出奶疙瘩的揮發(fā)性物質(zhì)共有酯類、醇類、酮類等化合物68種。牛奶疙瘩中以酯類和酮類化合物為主，具有酒香味、果香味和青草味；羊奶疙瘩中以酯類和芳香及雜環(huán)類化合物為主，具有酒香味、果香味、甜香味和青草味；酸奶疙瘩中以酯類化合物為主，具有酒香味、果香味、青草味和奶香味。乳桿菌屬、鏈球菌屬和醋酸桿菌屬等可能影響奶疙瘩中酯類、酸類和醛類化合物含量，從而影響奶疙瘩的整體氣味。本研究為深入了解奶疙瘩中優(yōu)勢細菌種群結(jié)構(gòu)，發(fā)掘傳統(tǒng)奶疙瘩中的優(yōu)良乳酸菌資源、開發(fā)奶疙瘩發(fā)酵劑提供參考。