薛 松， 黃高鉑， 楊曉飛， 張 野， 李 彧

1 西安市人民醫(yī)院 泌尿外科， 西安 710000； 2 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝膽外科， 西安 710061；3 空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院)傳染科， 西安 710038；4 陜西省人民醫(yī)院 感染性疾病科， 西安 710068

惡性腫瘤患者外周血和腫瘤微環(huán)境中的CD8+T淋巴細(xì)胞由于長期接受腫瘤抗原刺激造成免疫檢查點分子表達(dá)水平升高，細(xì)胞應(yīng)答和效應(yīng)功能明顯減弱，造成CD8+T淋巴細(xì)胞功能衰竭，不能清除腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致疾病進(jìn)展和腫瘤轉(zhuǎn)移[1-2]。針對程序性死亡受體-1(programmed death-1, PD-1)、程序性死亡配體(programmed death-ligand 1, PD-L1)等免疫檢查點分子的抑制劑已應(yīng)用于多種惡性腫瘤的臨床治療中，取得了良好的臨床療效[3-4]。但調(diào)控免疫細(xì)胞中PD-1表達(dá)的機(jī)制尚未完全闡明。阻斷IL-6信號通路可通過抑制PD-1/PD-L1信號通路增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤活性[5]，IL-6介導(dǎo)的信號通路參與了肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)病[6]。但I(xiàn)L-6是否能夠通過調(diào)控HCC患者PD-1表達(dá)從而影響CD8+T淋巴細(xì)胞功能尚不清楚。因此，本研究觀察PD-1在HCC患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞中的表達(dá)，并利用體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)研究IL-6對HCC患者CD8+T淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)的影響，初步探討HCC患者CD8+T淋巴細(xì)胞的功能狀態(tài)及其在HCC發(fā)病中的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究嚴(yán)格按照《赫爾辛基宣言》原則進(jìn)行，招募于2019年1月—2019年9月期間在陜西省人民醫(yī)院或空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院)就診的HCC患者(HCC組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～60歲；(2)診斷符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)》[7]的要求；(3)入組前未接受過手術(shù)、介入、放療、免疫及靶向等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并重要臟器(心臟、肝臟、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng))功能障礙；(2)合并其他惡性腫瘤；(3)合并其他精神障礙；(4)合并獲得性免疫缺陷綜合征；(5)合并自身免疫性疾病。同時，招募19例年齡和性別匹配的健康對照者(HC組)。

1.2 方法

1.2.1 實驗試劑和材料 Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購自美國Sigma公司；IL-6、IFNγ和TNFα ELISA試劑盒購自武漢華美生物公司；抗人IL-6中和抗體購自美國InvivoGen公司；抗人CD3-PerCP、抗人CD8-APC Cy7、抗人PD-1(CD279)-FITC購自美國BD公司；CD8+T淋巴細(xì)胞分選試劑盒購自德國美天旎公司；CCK-8試劑盒購自武漢碧云天公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和TB Green實時定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司；兔抗信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)、兔抗STAT3(phospho Y705)、兔抗Src、兔抗Src(phospho Y418)、兔抗GAPDH、山羊抗兔IgG均購自美國Abcam公司。FACS Calibur流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品；ABI 7500型熒光定量PCR儀為美國Applied Biosystem公司產(chǎn)品。

1.2.2 外周血單個核細(xì)胞(PBMC)和血漿分離 清晨、空腹采集所有入組志愿者EDTA抗凝外周血10 mL，4 ℃、1000 r/min離心10 min后收集上層血漿凍存?zhèn)溆?，下層血?xì)胞使用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液，采用密度梯度離心法分離PBMC，以107個/mL的濃度凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 流式細(xì)胞檢測CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1的表達(dá) 取106個PBMC，使用抗人CD3-PerCP、抗人CD8-APC Cy7、抗人PD-1-FITC對其進(jìn)行染色，使用FACS Calibur流式細(xì)胞儀對染色后的細(xì)胞進(jìn)行檢測，使用FlowJo V10軟件進(jìn)行分析。

1.2.4 CD8+T淋巴細(xì)胞分選和培養(yǎng) 取107個PBMC，使用CD8+T淋巴細(xì)胞分選試劑盒按說明書要求分選CD8+T淋巴細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)對分選后的細(xì)胞進(jìn)行純度鑒定，純化比例>95%。參考既往文獻(xiàn)[8]報道中的操作，使用抗人IL-6中和抗體(終濃度為20 ng/mL)刺激分選的CD8+T淋巴細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞和上清進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.5 細(xì)胞增殖試驗 將分選的CD8+T淋巴細(xì)胞接種于96孔板，每個志愿者的CD8+T淋巴細(xì)胞設(shè)立4個復(fù)孔，每孔中加入2×105個純化的CD8+T淋巴細(xì)胞，其中2個孔加入終濃度為20 ng/mL的抗人IL-6中和抗體培養(yǎng)(為實驗組)，另外2個孔加入等量的培養(yǎng)液(為對照組)，培養(yǎng)12 h后收集上清和細(xì)胞。使用CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒按說明書要求對細(xì)胞增殖檢測。以O(shè)D450 nm表示細(xì)胞增殖水平。

1.2.6 ELISA檢測細(xì)胞因子含量 對血漿中IL-6、培養(yǎng)上清中IFNγ和TNFα使用ELISA試劑盒進(jìn)行檢測。

1.2.7 實時定量PCR 對抗人IL-6中和抗體處理后的CD8+T淋巴細(xì)胞提取總RNA，按TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求逆轉(zhuǎn)錄cDNA，采用TB Green實時定量PCR法對CD8+T淋巴細(xì)胞中穿孔素、顆粒酶B和顆粒溶素mRNA的相對表達(dá)量進(jìn)行檢測。引物序列見表1。

表1 實時定量PCR引物序列

1.2.8 Western blot 取抗人IL-6中和抗體處理后的CD8+T淋巴細(xì)胞，加入含有Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail的2×SDS buffer，于冰上裂解細(xì)胞15 min，再于95 ℃孵育10 min后，于12 000 r/min離心2 min，收集上清。BCA法進(jìn)行蛋白定量。配置SDS-PAGE(5%濃縮膠、10%分離膠)，以30 μg/泳道上樣、電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉/TBST封閉，洗滌后加入兔抗STAT3、兔抗STAT3(phospho Y705)、兔抗Src、兔抗Src(phospho Y418)、兔抗GAPDH，4 ℃孵育過夜，洗滌后加入山羊抗兔IgG室溫孵育2 h，洗滌后加入ECL，曝光。

1.3 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)陜西省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(批號：省醫(yī)倫2017-082號)和空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(批號：TDLL-201505-013)，所有入組志愿者均簽署知情同意書。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 HCC組和HC組一般資料見表2。兩組在性別比例、年齡之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)。

表2 入組志愿者一般資料

2.2 兩組患者血漿IL-6表達(dá)水平的比較 HCC組血漿IL-6的水平較HC組[(99.67±20.92)pg/mL vs (81.05±16.76)pg/mL]顯著升高(t=3.427，P=0.001 1)(圖1)。

圖1 HC組和HCC組血漿IL-6水平比較

2.3 兩組患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞比例與PD-1陽性比例的比較 HC組和HCC組CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞以及PD-1在CD8+T淋巴細(xì)胞中表達(dá)的典型流式散點圖見圖2a。外周血CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞的比例在HC組和HCC組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(26.37%±6.59% vs 29.43%±6.99%，t=1.618，P=0.111)(圖2b)，但HCC組患者中PD-1+CD8+細(xì)胞的比例(3.79%±1.36%)則顯著高于HC組(2.20%±0.47%)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.335，P<0.000 1)(圖2c)。

2.4 HCC患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞在抗人IL-6中和抗體處理后細(xì)胞增殖、PD-1表達(dá)以及分泌細(xì)胞因子的變化 CCK-8結(jié)果提示，抗人IL-6中和抗體對CD8+T淋巴細(xì)胞增殖無明顯影響(t=1.285，P=0.206)(圖3a)，但PD-1+細(xì)胞占CD8+T淋巴細(xì)胞的比例在抗人IL-6中和抗體處理后顯著下降(3.33%±1.12% vs 2.67%±0.91%，t=2.177，P=0.035)(圖3b)?？谷薎L-6中和抗體處理后CD8+T淋巴細(xì)胞分泌IFNγ的水平顯著升高[(10.82±1.37)pg/mL vs (13.50±3.82)pg/mL，t=3.170，P=0.002 8](圖3c)，但TNFα在抗人IL-6中和抗體處理與未處理組中分泌水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義[(96.66±15.78)pg/mL vs(103.20±16.06)pg/mL，t=1.385，P=0.173](圖3d)。

注：a，典型流式散點圖；b，CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例；c，PD-1+CD8+細(xì)胞比例。

注：a，細(xì)胞增殖；b，PD-1+CD8+細(xì)胞比例；c，IFNγ水平； d，TNFα水平。

2.5 HCC患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞在抗人IL-6中和抗體處理后穿孔素、顆粒酶B和顆粒溶素mRNA以及STAT3和Src蛋白磷酸化的變化 取上述刺激后的CD8+T淋巴細(xì)胞，分別提取mRNA和蛋白，實時定量PCR結(jié)果提示，抗人IL-6中和抗體處理后CD8+T淋巴細(xì)胞中穿孔素和顆粒酶B mRNA的相對表達(dá)量均顯著升高(t值分別為6.161、14.140，P值均<0.000 1)(圖4a、b)，但顆粒溶素mRNA的相對表達(dá)量在抗人IL-6中和抗體處理和未處理的CD8+T淋巴細(xì)胞之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.493，P=0.143)(圖4c)。對Western blot結(jié)果進(jìn)行半定量分析發(fā)現(xiàn)，抗人IL-6中和抗體處理后總STAT3和總Src的水平均無顯著變化，對Src的磷酸化亦無明顯影響，但STAT3磷酸化水平在抗人IL-6中和抗體處理后顯著降低(P<0.000 1)(圖4d、e)。

3 討論

在免疫功能紊亂和腫瘤發(fā)生發(fā)展之間，細(xì)胞因子/趨化因子、免疫細(xì)胞和免疫分子所構(gòu)成的免疫網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮重要作用。HCC的發(fā)生與不同病因(包括慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病等)造成的慢性炎癥和纖維化密切相關(guān)，以TNFα和IL-6為代表的炎癥細(xì)胞因子及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不但可誘導(dǎo)HCC發(fā)生，還能促進(jìn)炎癥，加重肝損傷[9]。同時，促炎細(xì)胞因子亦可調(diào)控T淋巴細(xì)胞表面免疫檢查點分子PD-1的表達(dá)，參與機(jī)體免疫和炎癥應(yīng)答調(diào)控[10]。因此，本研究探討了促炎因子IL-6對HCC患者CD8+T淋巴細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用和初步機(jī)制。結(jié)果顯示，HCC患者外周血IL-6水平以及CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1水平均顯著升高，阻斷IL-6介導(dǎo)的信號通路可降低HCC患者CD8+T淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)，增加IFNγ分泌和穿孔素、顆粒酶B mRNA相對表達(dá)量，提示抑制IL-6可能增強(qiáng)了HCC患者CD8+T淋巴細(xì)胞的功能。

IL-6是固有免疫應(yīng)答中重要的細(xì)胞因子之一，主要由單核巨噬細(xì)胞分泌，發(fā)揮促炎作用。IL-6還能調(diào)控巨噬細(xì)胞極化，在HCC發(fā)生過程中，IL-6/STAT3信號通路可抑制M1型巨噬細(xì)胞、活化M2型巨噬細(xì)胞，從而促進(jìn)HCC細(xì)胞活性、增殖、遷移和侵襲[11]。因此，無論是經(jīng)典的IL-6信號通路還是IL-6跨信號通路(trans-signaling)均可通過不同的機(jī)制(包括： 抑制p53抑癌基因、 增強(qiáng)β-連環(huán)蛋白活性、保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受DNA損傷所致的凋亡、直接促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖等)誘導(dǎo)HCC發(fā)生發(fā)展[12]。IL-6/STAT3信號通路還可通過調(diào)控肝臟腫瘤干細(xì)胞活性誘導(dǎo)針對索拉非尼耐藥的肝癌細(xì)胞[13]，降低IL-6的表達(dá)則可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對索拉非尼的敏感性[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者外周血IL-6的水平較健康志愿者顯著升高，進(jìn)一步提示IL-6參與了HCC的發(fā)生發(fā)展，但其中的機(jī)制仍有待深入研究。

注：a，穿孔素mRNA；b，顆粒酶B mRNA；c，顆粒溶素mRNA；d，總STAT3、磷酸化STAT3、總Src、磷酸化Src Western blot檢測；e，條帶灰度比較。

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，HCC患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞所占比例與健康對照者的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。但是，HCC患者CD8+T淋巴細(xì)胞中PD-1水平顯著升高，PD-1作為重要的免疫檢查點分子，已證實在腫瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病中發(fā)揮重要的免疫調(diào)控作用[15]，PD-1的表達(dá)升高可能誘導(dǎo)CD8+T淋巴細(xì)胞功能衰竭，使HCC疾病惡化。在炎癥性關(guān)節(jié)病中，以IL-6為代表的促炎細(xì)胞因子可增加膜型和可溶型PD-1的表達(dá)[10]。在腫瘤微環(huán)境中，抗IL-6中和抗體和抗PD-1/PD-L1抗體亦可發(fā)揮協(xié)同作用，打破腫瘤微環(huán)境中的免疫耐受，抑制腫瘤生長[16-17]。這提示IL-6和PD-1之間可能存在相互作用。新近的研究[18]發(fā)現(xiàn)，在HCC發(fā)病過程中，IL-6可通過抑制受體型蛋白酪氨酸磷酸酶O促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞中PD-L1表達(dá)。由于本研究發(fā)現(xiàn)HCC患者IL-6和PD-1的表達(dá)均升高，因此，本研究利用抗人IL-6中和抗體處理HCC患者分選的CD8+T淋巴細(xì)胞，觀察抑制IL-6對CD8+T淋巴細(xì)胞的影響，并分析其初步機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制IL-6可增強(qiáng)HCC患者CD8+T淋巴細(xì)胞的功能，主要表現(xiàn)為PD-1的表達(dá)降低、IFNγ分泌增加、穿孔素和顆粒酶B mRNA的相對表達(dá)量增加。這一結(jié)果與在病毒感染中所發(fā)現(xiàn)的IL-6促進(jìn)病毒特異性細(xì)胞毒性CD8+T淋巴細(xì)胞增殖和分化的結(jié)果[19-20]不盡相同，這可能與不同的疾病類型有關(guān)。因此，進(jìn)一步對IL-6的下游信號通路進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制IL-6主要影響HCC患者CD8+T淋巴細(xì)胞中的JNK-STAT3信號通路，而對Src信號通路無顯著影響。但值得注意的是，本研究納入的樣本量相對較少，且腫瘤免疫網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控非常復(fù)雜，本研究結(jié)果仍需擴(kuò)大樣本量并進(jìn)行體內(nèi)動物實驗加以證實。

綜上，本文研究表明HCC患者中IL-6和CD8+T淋巴細(xì)胞中PD-1的表達(dá)升高，抑制IL-6可能通過降低PD-1表達(dá)、增加IFNγ分泌和升高穿孔素及顆粒酶B水平發(fā)揮增強(qiáng)HCC患者CD8+T淋巴細(xì)胞的作用。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：薛松、黃高鉑負(fù)責(zé)實驗操作，文章撰寫；楊曉飛負(fù)責(zé)患者入組，資料分析；李彧、張野負(fù)責(zé)課題設(shè)計，患者入組，資料分析；李彧負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫論文并最后定稿。