馬立艷 孫 偉 夏 帥 蘇建榮*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100050；2.首都醫(yī)科大學(xué)研究生院，北京 100069)

既往研究[7]顯示，與肺炎克雷伯菌致病相關(guān)的毒力因子包括莢膜多糖、菌毛和鐵載體等。參與調(diào)控莢膜多糖合成的毒力基因黏液表型調(diào)節(jié)基因A(regulator of mucoid phenotype A，rmpA)位于肺炎克雷伯菌的毒力質(zhì)粒(large virulence plasmid ofKlebsiellapneumoniae，pLVPK)上，與肺炎克雷伯菌黏附宿主細(xì)胞和生長(zhǎng)增殖相關(guān)。鐵載體是一種低相對(duì)分子質(zhì)量的鐵螯合劑，由細(xì)菌在乏鐵條件下分泌，促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖、加重感染，是肺炎克雷伯菌毒力增強(qiáng)的重要原因之一。其中，氣桿菌素和受體由iucABCD-iucA基因簇編碼，也位于pLVPK毒力質(zhì)粒上，是HvKP產(chǎn)生的最重要的鐵載體[8]。

因此，本研究選取侵襲性腹腔感染部位分離的CRKP菌株為研究對(duì)象，通過基因分型、篩查耐藥基因和致病基因的攜帶情況、檢測(cè)生物膜形成能力和鐵載體生成能力，闡述CRKP的毒力特征。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2016至2019年首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院侵襲性腹腔感染部位分離的CRKP菌株38株，剔除同一患者相同部位重復(fù)分離的菌株。CRKP定義為肺炎克雷伯菌對(duì)美羅培南、亞胺培南或厄他培南中介或耐藥，或產(chǎn)生碳青霉烯酶[9]。所有菌株保存于-80 ℃無菌脫脂牛奶中。

1.2 試劑與儀器

菌株鑒定使用法國(guó)生物梅里埃公司的VITEK MS飛行時(shí)間質(zhì)譜儀及其配套試劑；藥敏試驗(yàn)使用法國(guó)生物梅里埃公司的VITEK 2 Compact及其配套藥敏卡片AST334，鄭州安圖生物工程股份有限公司的E-test條，以及英國(guó)OXIOD公司的藥敏紙片；腦心浸液、LB等培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)OXIOD公司；結(jié)晶紫、鉻天青S(chrome azurol sulfonate,CAS)、無水哌嗪、三氯化鐵、三甲基十六烷基溴化胺(hexadecyl trimethyl ammonium, HDTMA)等試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒和PCR試劑為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀和分光光度計(jì)為美國(guó)Bio-Rad公司的產(chǎn)品；PCR儀器為美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的ABI 7500；測(cè)序儀為美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的3730XL。藥敏質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853，按照臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)制定的抗微生物藥物敏感試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)M100-S30文件中的折點(diǎn)進(jìn)行判讀。

1.3 生物膜形成實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[10]，挑取分純培養(yǎng)的CRKP菌落1～2個(gè)，制備2.0～3.0×108CFU/mL的菌懸液，用腦心浸液稀釋100倍，取200 μL加入96孔板，每孔CRKP的終濃度為5×105CFU/mL，腦心浸液作為陰性對(duì)照，肺炎克雷伯菌ATCC700603作為陽(yáng)性對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)18～20 h。200 μL PBS洗板3次，加入甲醇200 μL固定生物膜15 min，室溫干燥10 min。0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的結(jié)晶紫100 μL染色5 min，300 μL無菌水洗板。待室溫干燥后，加入33%(體積分?jǐn)?shù))的乙酸，搖床震蕩10 min充分溶解生物膜。每株菌重復(fù)3次試驗(yàn)，取均值計(jì)算595 nm處的吸光度A595。

1.4 鐵載體生成實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[11]，將1.5 mL 1 mol/L FeCl3溶液加入到7.5 mL 2 mol/L CAS溶液中，混勻后加入到6 mL 10mol/L HDTMA溶液中，然后將30 mL水溶無水哌嗪(pH值5.6)加入到上述溶液中，定容至100 mL，制成CAS定量檢測(cè)液。將待測(cè)菌株在含有4 mol/L去鐵胺的LB培養(yǎng)基中孵育48 h，離心收集上清，用0.22 μm 濾膜過濾，濾后上清與CAS定量檢測(cè)液等體積混合。LB培養(yǎng)液作為參照同步操作，含4 mol/L去鐵胺的LB培養(yǎng)液作為鐵離子螯合的質(zhì)控。每株菌重復(fù)3次試驗(yàn)，取均值計(jì)算待測(cè)菌株在630 nm處的吸光度A630。

1.5 拉絲試驗(yàn)

用無菌環(huán)挑取過夜孵育的CRKP菌落，拉絲長(zhǎng)度>5 mm即為拉絲試驗(yàn)陽(yáng)性。

1.6 致病基因和耐藥基因檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[5,12]，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)方法檢測(cè)致病基因rmpA2和iucA，碳青霉烯酶基因blaKPC-2、blaNDM-1、blaIMP-4、blaVIM-1和blaOXA-48。所有PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳，陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序并與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析。

將僅檢出碳青霉烯酶基因blaKPC-2的菌株作為KPC組，同時(shí)檢出blaKPC-2和致病基因rmpA2和iucA的菌株作為KPC+rmpA2+iucA組，兩組之間進(jìn)行生物膜形成能力和鐵載體生成能力的比較。

通過調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)男性大學(xué)生的自我效能感顯著高于女性，因?yàn)闊o論在高校還是社會(huì)中，男性在體力、智力、耐力、心理素質(zhì)等方面明顯優(yōu)于女性，在社會(huì)各行業(yè)中對(duì)男大學(xué)生的需求日益增多，間接提升了高校男性大學(xué)生的自信能力，進(jìn)而影響自我效能感。參與過志愿和基層服務(wù)的高校大學(xué)生與未參與過志愿和基層服務(wù)的高校大學(xué)生在自我效能感方面具有顯著差異，說明在從事志愿和基層服務(wù)時(shí)，高校大學(xué)生所學(xué)的理論知識(shí)和技能得到實(shí)踐，在語言溝通、人際交往、統(tǒng)籌協(xié)調(diào)能力等方面得到了提升，使得這些從事過志愿和基層服務(wù)者的高校大學(xué)生通過服務(wù)他人的過程中自我滿足感和幸福感得到升華，進(jìn)而影響其自我效能感。

1.7 多位點(diǎn)序列分型

根據(jù)肺炎克雷伯菌多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing, MLST)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bigsdb. web.pasteur.fr/klebsiella/primers_used.html)提供的引物序列和反應(yīng)條件擴(kuò)增7對(duì)管家基因(gapA、mdh、phoE、tonB、infB、pgi、rpoB)，將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與MLST數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確定ST型別。根據(jù)是否為ST11型分為ST11組與非ST11組。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)菌株及其耐藥特征

共收集38株CRKP，對(duì)至少一種碳青霉烯類抗菌藥物耐藥，包括亞胺培南、厄他培南或美羅培南，MIC范圍為4～128 μg/mL。對(duì)替加環(huán)素和黏菌素的MIC50分別為1.0 μg/mL和0.25 μg/mL。在38株CRKP菌株中，碳青霉烯酶的檢出率為84.2%(32/38)。僅攜帶blaKPC-2的菌株檢出率最高，為76.3%(29/38)，其中ST11組的檢出率高于非ST11組，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。只攜帶blaNDM-1的菌株次之，為5.3%(2/38)，1株CRKP同時(shí)攜帶blaKPC-2和blaNDM-1，未檢測(cè)到blaOXA-48、blaVIM-1和blaIMP-4型碳青霉烯酶。ST11為主要克隆株，占比78.1%(25/38)，其次為ST37型，占比10.5%(4/38)，此外還檢出2株ST258和1株ST147，另有6株未知型別，詳見表1。

表1 CRKP菌株的耐藥特征Tab.1 Resistance characteristics of CRKP strains n(%)

2.2 致病基因的檢測(cè)情況

38株CRKP中，共23株檢測(cè)到rmpA2或iucA，其中21株同時(shí)攜帶rmpA2和iucA。ST11組同時(shí)攜帶rmpA2和iucA菌株的檢出率為60.0%，非ST11組同時(shí)攜帶rmpA2和iucA菌株的檢出率為46.2%，兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在ST37型和ST258型的菌株中未檢測(cè)到rmpA2或iucA。在21株同時(shí)攜帶rmpA2和iucA的菌株中，14.3%(3/21)的菌株拉絲試驗(yàn)陽(yáng)性,詳見表2。

表2 CRKP菌株的致病基因檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Distribution of virulence genes harbored by CRKP strains n(%)

2.3 不同組別生物膜形成能力比較

38株CRKP均可形成生物膜，A595位于0.1～0.8之間，形成生物膜的能力均較弱。與非ST11組相比，ST11型CRKP組形成生物膜的能力略高，兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。KPC組與KPC+rmpA2+iucA組生物膜形成能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

圖1 不同組別間生物膜形成能力的比較Fig.1 Comparison of biofilm formation in different CRKP groupsCRKP: carbapenem-resistant klebsiella pneumoniae.

2.4 不同組別鐵載體生成能力比較

38株CRKP均可生成鐵載體，鐵載體生成能力ST11組高于非ST11組，KPC+rmpA2+iucA組高于KPC組，兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

圖2 不同組別間鐵載體生成能力的比較Fig.2 Comparison of siderophore production in different CRKP groupsCRKP: carbapenem-resistant klebsiella pneumoniae.

3 討論

在我國(guó)，CRKP最常見的基因型別為ST11型，該克隆株傳播性強(qiáng)，是臨床重癥感染的主要病原菌，部分菌株僅保留了對(duì)黏菌素、替加環(huán)素的敏感性[13-14]。而攜帶rmpA、rmpA2和鐵載體基因的pLVPK質(zhì)粒，是一種可移動(dòng)的、大約170 000 bp的毒力元件，可與碳青霉烯酶耐藥基因整合。2017年，Gu等[5]對(duì)呼吸機(jī)相關(guān)肺炎中分離的CR-HvKP菌株進(jìn)行了分子流行病學(xué)研究，證實(shí)ST11型CRKP獲得了pLVPK質(zhì)粒后具有高毒力、高耐藥、高傳播的特點(diǎn)，成為臨床抗感染治療的重大威脅。此后，中國(guó)不同地區(qū)也相繼報(bào)告，河南省和山東省較高，CR-HvKP檢出率分別為25.4%和25.8%，提示CR-HvKP可能已經(jīng)在國(guó)內(nèi)引起了播散[15]。

既往研究[2，16]顯示，與經(jīng)典型肺炎克雷伯菌相比，HvKP往往表現(xiàn)高黏性表型，因此通常將拉絲試驗(yàn)陽(yáng)性作為HvKP的診斷標(biāo)準(zhǔn)。但是，Lin等[17]研究發(fā)現(xiàn)，高黏性與毒力并無直接相關(guān)性，拉絲試驗(yàn)陰性的菌株也可能引起嚴(yán)重的感染，引起糖尿病小鼠更高的病死率。近期兩項(xiàng)中國(guó)學(xué)者的研究[17-18]顯示，HvKP中僅28.9%或30.9%的菌株拉絲試驗(yàn)陽(yáng)性，與Zhang等[19]研究中10.9%CR-HvKP菌株拉絲試驗(yàn)陽(yáng)性相似，本研究中的陽(yáng)性率為14.3%，因此，拉絲試驗(yàn)作為鑒定HvKP的方法并不可靠。大蠟螟LD50和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)鑒定HvKP更為確切，但因其操作復(fù)雜，并不適合在臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展。本研究中，88.0%的ST11型菌株中僅檢測(cè)到blaKPC-2，60.0%的ST11型菌株同時(shí)攜帶rmpA2和iucA，rmpA2和iucA在攜帶blaKPC-2的ST11型菌株中檢出率明顯增高。Gu等[5]也證實(shí)，毒力基因iucABCD、rmpA2和iut是ST11型CR-HvKP特有，而經(jīng)典型ST11型CRKP則不具有。因此，目前將菌株的表型、基因型和毒力實(shí)驗(yàn)相結(jié)合鑒定CR-HvKP是相對(duì)可靠的方法，但需要進(jìn)一步研究篩選出高毒力菌株的特征性生物標(biāo)志物。

生物膜的形成不僅造成抗菌藥物治療效果不佳，還容易引起感染復(fù)發(fā)，進(jìn)一步加重CRKP菌株感染的治療難度。而一旦生物膜形成，可能會(huì)造成CRKP在醫(yī)院環(huán)境中定植、播散。本研究中，不同ST型別間、攜帶耐藥基因和致病基因的不同組別間生物膜形成能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)所用CRKP菌株形成生物膜的能力均較弱，可能與獲得性耐藥導(dǎo)致毒力受損有關(guān)，如生物膜形成相關(guān)蛋白的低水平表達(dá)，具體的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。與HvKP常常引起健康人社區(qū)獲得性感染不同，CRKP通常與侵入性操作、免疫功能受損等有關(guān)，造成毒力相對(duì)較低的耐藥株也可引起嚴(yán)重的侵襲性感染。此外，在體內(nèi)抗菌藥物選擇壓力下，細(xì)菌往往比體外試驗(yàn)更易形成生物膜。

鐵載體，尤其是氣桿菌素，幫助細(xì)菌從宿主體內(nèi)環(huán)境獲得鐵離子，明顯提高肺炎克雷伯菌在腹水和血清中的生存率，是HvKP重要的致病機(jī)制，往往引起嚴(yán)重的臨床感染。既往對(duì)肝膿腫分離HvKP菌株的研究[8,19]證實(shí)，鐵載體是高毒力的特征性標(biāo)志物，但是這些研究所用的菌株對(duì)臨床常用抗菌藥物均表現(xiàn)良好的敏感性。本研究選取侵襲性腹腔感染部位分離的CRKP菌株，結(jié)果顯示，同時(shí)攜帶blaKPC-2、rmpA2和iucA的菌株，鐵載體產(chǎn)生的能力明顯升高，提示rmpA2和iucA是CR-HvKP重要的毒力因子。僅攜帶blaKPC-2的菌株雖然產(chǎn)生鐵載體的能力較低，但是在乏鐵環(huán)境中仍然可以分泌鐵載體維持自身生長(zhǎng)繁殖。

綜上所述，同時(shí)攜帶KPC-2型耐藥基因、rmpA2和iucA毒力基因的ST11型CRKP，使抗感染治療形勢(shì)更為嚴(yán)峻，需要采取嚴(yán)格的醫(yī)院感染防控措施和/或進(jìn)行主動(dòng)篩查，以防止其在醫(yī)療機(jī)構(gòu)內(nèi)播散流行。