鄭勤妮，莊 麗，任麗娟，萬永虎

流行性感冒(簡稱流感，Influenza)是由流行性感冒病毒(簡稱流感病毒，Influence virus)甲(A)、乙(B)和丙(C)3型流感病毒引起的急性呼吸道傳染病[1]。流感病毒屬正黏病毒科，單股負(fù)鏈、分節(jié)段的RNA病毒。具有傳染性強(qiáng)、傳播快、發(fā)病率高的特點。由于病毒極易發(fā)生變異，每年流感都會發(fā)生不同規(guī)模的流行，全球每年病死人數(shù)高達(dá)50萬[2]。上世紀(jì)以來，先后引起4次全球流感大流行的均是甲型流感病毒，造成數(shù)千萬人死亡和嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。H3N2亞型流感病毒于1968年7月中旬首發(fā)于我國香港特區(qū)，并引起全球流感大流行，之后一直在人群中存在、流行并不斷發(fā)生變異，甚至造成聚集性暴發(fā)疫情的發(fā)生[6]。NA基因的主要功能是切斷流感病毒與宿主細(xì)胞之間的連接，利于子代病毒的釋放，進(jìn)而感染其他細(xì)胞，在流感病毒復(fù)制周期中扮演著重要角色[7]。在藥物壓力和進(jìn)化選擇壓力作用下，NA基因的藥物靶點可能發(fā)生氨基酸位點替換，引起抗原漂移，導(dǎo)致流感暴發(fā)或流行[8]。此外，抗原漂移也會對現(xiàn)用疫苗的免疫效果產(chǎn)生一定的影響。貴州省近年來H3N2亞型毒株出現(xiàn)頻率較高，季節(jié)性流感流行以H3N2亞型流感病毒為優(yōu)勢型別。另外，僅由H3N2亞型流感病毒引起的暴發(fā)疫情就有30余起，給人群造成一定的健康威脅和經(jīng)濟(jì)損失。然而流感病毒的變異在人群中常表現(xiàn)為流感的流行和暴發(fā)，為了解2017—2019年貴州省H3N2亞型流感病毒流行特征和遺傳變異情況，本研究對2017—2019年貴州省H3N2亞型流感的流行特征和NA基因遺傳變異特征進(jìn)行分析，以期為流感病毒的科學(xué)防控提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集 按全國流感監(jiān)測方案，貴州省13家流感監(jiān)測哨點醫(yī)院發(fā)熱門診采集發(fā)病3 d內(nèi)的ILI(體溫≥38 ℃，伴咳嗽或咽痛之一)病人上呼吸道鼻咽拭子標(biāo)本，4 ℃保存并48 h內(nèi)送至流感網(wǎng)絡(luò)實驗室，不能在48 h內(nèi)送到的置-70 ℃保存。

1.2 主要試劑和儀器 病毒核酸提取試劑盒(西安天隆DNA/RNA自動提取試劑盒)、核酸檢測試劑(TakaRa ONE Step RNA PCR Kit)購自中山達(dá)安生物科技有限公司。MDCK細(xì)胞培養(yǎng)液(美國HYCLONE)、流感病毒培養(yǎng)分離液(北京友康恒業(yè)生物科技)、流感病毒血清學(xué)鑒定試劑盒(中疾控季流實驗室提供)、ABI7500熒光定量PCR儀(美國ABI公司，器號：287880380)、32孔核酸自動提取儀(西安天隆)、生物安全柜(器號：130044040909)。PCR用瓊脂糖購自北京東方榮盛生物科技有限公司，測序/引物合成送生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 核酸提取和PCR檢測 吸取200 μL咽拭子標(biāo)本，按照西安天隆DNA/RNA自動提取試劑盒說明書，利用32孔核酸自動提取儀(西安天隆)自動提取純化系統(tǒng)提取核酸。按照中山達(dá)安流感病毒核酸測定試劑盒的說明書，按PCR反應(yīng)液A 17 μL，PCR反應(yīng)液B 3 μL，待測樣本核酸5 μL配置25 μL的反應(yīng)體系，并設(shè)置好RT-PCR反應(yīng)程序(50 ℃ 15 min，1個循環(huán)；95 ℃ 15 min，1個循環(huán)；94 ℃ 15 s, 55 ℃ 45 s 收集熒光，40個循環(huán))，在ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行流感病毒的核酸檢測及分型。H3N2亞型流感病毒的陽性標(biāo)本進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4 H3N2亞型流感病毒的MDCK細(xì)胞分離及血清學(xué)鑒定 核酸檢測為H3N2亞型流感病毒的陽性標(biāo)本，取1 mL標(biāo)本液接種于事先準(zhǔn)備好的MDCK細(xì)胞上(MDCK細(xì)胞密度為長滿培養(yǎng)瓶底90%左右，且細(xì)胞代次連續(xù)培養(yǎng)不超過20代)，從第2 d起每天觀察MDCK細(xì)胞病變情況，24 h內(nèi)細(xì)胞病變的為非特異性，24 h以后的病變?yōu)樘禺愋约?xì)胞病變。收集病毒培養(yǎng)液進(jìn)行血清學(xué)鑒定。

1.5 序列測定及生物信息學(xué)分析 從核酸陽性流感樣病例標(biāo)本MDCK細(xì)胞分離的H3N2亞型流感毒株中隨機(jī)選取21株H3N2亞型毒株，其中2017年度8株、2018年度2株及2019年度11株，提取病毒RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增H3N2亞型流感毒株的NA基因，擴(kuò)增引物為：uNA-I-M13F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGCAAAAGCAGGAG-T，N2-I-M13R:CAGGAAACAGCTATGACCC-GACATGCTGAGCACTYCCTGAC；N2-II-M13F:TGTAAAACGACGGCCAGTGAACTTGTRCAG-TRGTAATG，uNA-II-M13R:CAGGAAACAGCTATGACCAGTAGAAACAAGGAG。反應(yīng)體系30 μL，其中PrimeScript 1 Step EnzymeMix 1.2 μL，2X1 Step Buffer 15 μL，上游引物和下游引物各1.2 μL，RNA 5 μL，RNase Free dH2O 6.4 μL；反應(yīng)條件50 ℃ 30 min，1個循環(huán)；94 ℃ 2 min，1個循環(huán)；94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s，72℃ 1 min，38個循環(huán)；72 ℃ 7 min，1個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行測序，用MEGA7.0軟件和Clustal W2軟件進(jìn)行同源性、遺傳進(jìn)化和耐藥位點分析。

2 結(jié) 果

2.1 2017—2019年貴州省H3N2亞型流感病毒流行特征 2017—2019年貴州省流感網(wǎng)絡(luò)實驗室共采集ILI 46 065份，全部進(jìn)行RT-PCR檢測，共檢測出H3N2亞型流感病毒陽性標(biāo)本2 096份，陽性率為4.55%。其中暴發(fā)疫情、不明原因肺炎、國家級哨點醫(yī)院監(jiān)測標(biāo)本檢出H3N2亞型流感病毒陽性標(biāo)本分別為224、6和1 875份，分別占總陽性的10.69%、0.29%和89.46%。由此可見，不同監(jiān)測周期H3N2亞型流感病毒陽性數(shù)主要來源于國家級哨點醫(yī)院的檢測標(biāo)本，其次為暴發(fā)疫情來源。2017年H3N2亞型流感病毒陽性數(shù)為797例，陽性率為5.12%，而2018年流感流行期H3N2亞型流感陽性數(shù)急劇下降，陽性數(shù)為122例，陽性率降到0.8%，可能是人群接種了疫苗或因感染而產(chǎn)生H3N2亞型流感病毒抗體。但隨著人群抗體效價的降低和病毒本身的變異，2019年H3N2亞型流感病毒感染陽性數(shù)又上升到1 177例，陽性率為7.66%(表1)。從圖1中可以看出，H3N2亞型流感病毒在2018年活動明顯減弱。2017—2019年監(jiān)測中，H3N2亞型流感病毒具有明顯的季節(jié)分布，主要在1-3月和10-12月份較為活躍，這與全國H3N2亞型流感病毒的流行相吻合，2017年7-9月份出現(xiàn)H3N2亞型流感病毒流行小高峰，這可能與貴州省獨特的地理氣候或病毒變異有關(guān)。

表1 2017—2019年貴州省H3N2亞型流感病毒監(jiān)測情況Tab.1 Surveillance of H3N2 subtype influenza viruses in Guizhou Province from 2017 to 2019

圖1 2012—2019年貴州省H3N2亞型流感病毒時間分布Fig.1 Phylogenic tree of the H3N2 virus NA gene in Guizhou Province, 2017-2019

2.2 2017—2019年貴州省H3N2亞型流感病毒NA基因分子特征

2.2.1 2017—2019年H3N2亞型流感病毒NA基因同源性分析 2017—2019年貴州省H3N2亞型NA基因核苷酸同源性為97.5%～100%；其中2017年H3N2毒株之間同源性為97.9%～99.6%，2018年為98.2%，2019年98.7%～100%，可見2017年H3N2毒株之間差距較大；2017年與2018年同源性為97.4%～99.5%，2017年與2019年同源性為97.4%～99.2%，2018年與2019年同源性為98.2%～99.9%，提示隨著時間的延長，變異在不斷的積累，毒株之間差距逐漸增大；貴州省所有毒株與2017年WHO推薦的疫苗株相比同源性為97.7%～98.4%，與2018年推薦的疫苗株的同源性為98.4%～99.5%，與2019年推薦的疫苗株的同源性為97.7%～98.9%，可見貴州省H3N2毒株與2018年推薦的疫苗株的同源性最高，匹配性可能更好，提示對于我省而言，不一定最新的疫苗株保護(hù)效果就最好(表2)。

表2 2017—2019年貴州省H3N2亞型流感病毒NA基因核苷酸同源性分析Tab.2 Nucleotide homology analysis of the NA gene of H3N2 subtype influenza virus from 2017 to 2019 in Guizhou Province

2.2.2 2017—2019年H3N2亞型流感病毒NA基因遺傳進(jìn)化分析 對2017—2019年貴州省21株H3N2亞型流感病毒的NA基因核苷酸序列構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，結(jié)果顯示貴州省21株H3N2亞型流感病毒主要分為2大分支(圖2)。2017年遵義市、安順西秀區(qū)、黔西南州興義和貴陽市南明區(qū)部分毒株聚集為一個大分支，與福建省分離的毒株遺傳距離最短，親緣關(guān)系最近，2017年貴陽市南明區(qū)部分毒株、黔南州都勻、六盤水市鐘山區(qū)的毒株和2018年與2019年所有毒株處于另一個大分支上，且隨著時間的推移在不斷地朝著遠(yuǎn)端進(jìn)化；2018年的毒株遺傳距離相差較遠(yuǎn)；2019年的毒株聚為2簇，分別處于2個小分支，處于進(jìn)化的最頂端，提示2018年和2019年的毒株可能就由2017年的這部分毒株遺傳演化而來，也提示2017年H3N2毒株可能發(fā)生了較大程度的變異，且部分毒株沒有演化流行下來。2017—2019年WHO推薦的疫苗株也處于后面一個大分支，但是當(dāng)年度推薦的疫苗株與流行株遺傳距離相對較遠(yuǎn)，保護(hù)效果可能不佳，且隨著時間的推移，毒株遺傳演變的增快，應(yīng)及時更新更加匹配的疫苗株或根據(jù)我國或是南方省份來推薦更加合適的疫苗株。

●代表疫苗株；△代表貴州省2017年的毒株；□代表貴州省2018年的毒株；◇代表貴州省2019年的毒株。圖2 2017—2019年貴州省H3亞型流感病毒NA基因遺傳進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic tree of the H3N2 virus NA gene in Guizhou Province, 2017-2019

2.2.3 2017—2019年H3N2亞型流感病毒NA基因耐藥分子位點分析 NA 蛋白E119V、Q136K、D151A、I222V、H274Y、R292K、N294S共7個位點的突變可導(dǎo)致神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥物的耐藥，貴州省所測定的毒株均未在上述位點發(fā)生突變，提示貴州省H3N2毒株對神經(jīng)氨酸酶抑制劑仍然敏感。

3 討 論

流感病毒2個主要的表面蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)可識別靶細(xì)胞受體并與受體結(jié)合，具有與宿主細(xì)胞融合的活性，并能誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體[1]。H3N2亞型流感病毒基因包括8個基因片段，NA是由第6個片段所編碼，其作用是切斷流感病毒與宿主細(xì)胞之間的連接[9]。NA基因發(fā)生變異，能引起抗原漂移，從而導(dǎo)致流感的局部流行[10]。NA具有酶活性，這種活性對病毒脫離宿主細(xì)胞，釋放子代病毒感染其他細(xì)胞起到重要的作用[8，11]。NA誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體能提供保護(hù)作用，同時針對NA酶活性的抑制可以作為治療流感病毒的藥物使用。免疫選擇壓力的強(qiáng)弱對流感病毒變異快慢起到一定的作用，在人群免疫壓力和病毒自身的變異下，NA易發(fā)生抗原漂移，引起病毒抗原性的改變，使以往人群在流感病毒感染后機(jī)體內(nèi)所產(chǎn)生的特異性抗體，不能阻止新病毒的侵入，從而引起流感的暴發(fā)或流行[12-14]。另外環(huán)境因素也與流感的變異以及流行趨勢密切相關(guān)。潮濕低溫的氣候季節(jié)適合流感病毒的存活和傳播[15]。2017年貴州省H3N2亞型流感病毒陽性率為5.12%，然而2018年急劇下降到0.8%，2019年陽性率又急劇上升為7.66%，這可能是因為人群接種疫苗或因感染而產(chǎn)生H3N2亞型流感病毒抗體，隨著人群抗體效價的減弱而后又易感染導(dǎo)致的結(jié)果。另外，2017年7-9月份出現(xiàn)H3N2亞型流感病毒流行小高峰，這可能與貴州省低溫陰雨綿綿的氣候及病毒變異有關(guān)。時間分布方面，2017—2019年貴州省H3N2亞型流感病毒主要分布在春冬兩季，這與全國相一致[16]。

2017—2019年貴州省H3N2亞型NA基因核苷酸同源性為97.5%～100%，隨著時間的延長，變異的不斷積累，毒株之間差距逐漸增大。貴州省所有毒株與WHO 2018年推薦的疫苗株的同源性最高，匹配性更好，說明最新推薦的疫苗株保護(hù)效果不一定最好。NA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，2017—2019年21株H3N2亞型流感病毒主要分為2大分支，2017年的部分毒株與福建省分離的毒株遺傳距離最短，親緣關(guān)系最近；而2017年部分毒株和2018—2019年所有毒株處于另一個大分支上，且隨著時間的推移在不斷地朝著遠(yuǎn)端進(jìn)化。2018年的毒株遺傳距離相差較遠(yuǎn)，2019年的毒株聚為2簇，處于進(jìn)化的最頂端。說明2018—2019年的毒株可能就由2017年的這部分毒株遺傳演化而來，也說明2017年H3N2毒株可能發(fā)生了較大程度的變異，且部分毒株沒有演化流行下來，這可能也是2017年全年均有流行的部分原因。當(dāng)然對于流感病毒的流行原因不僅僅局限于NA基因，HA基因和其他內(nèi)部基因可能對病毒致病力、毒力和傳播能力方面也能產(chǎn)生一定的影響[9,17]，導(dǎo)致病毒流行的原因是一個綜合的結(jié)果，有必要在其他基因方面做進(jìn)一步的研究。但整體上，密切關(guān)注H3N2流感病毒的基因變異，對預(yù)測H3N2亞型流感病毒的流行具有重要的意義。