陳玥 梁穎思 周露

(廣東省食品檢驗(yàn)所(廣東省酒類(lèi)檢測(cè)中心)，廣東白云 510080)

1 前言

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)為革蘭氏陰性桿菌，是一種嗜鹽性細(xì)菌。食用含有該菌的食物可導(dǎo)致食物中毒，常見(jiàn)于魚(yú)、蝦、蟹、貝類(lèi)和海藻等海產(chǎn)品及鹽漬食品中。副溶血性弧菌一直是食源性疾病的主要致病因子，在亞洲國(guó)家和美國(guó)等地區(qū)尤為嚴(yán)重，在日本和東南亞，近50%的食物中毒事件是由副溶血性弧菌引起的[1]；在美國(guó)，每年因副溶血性弧菌污染導(dǎo)致約8萬(wàn)人患病、100人死亡[2]。

我國(guó)沿海地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖和捕撈產(chǎn)業(yè)發(fā)達(dá)，動(dòng)物性水產(chǎn)品食源性污染應(yīng)引起重視。廣東省疾病預(yù)防控制中心監(jiān)測(cè)顯示，2017—2018年有45起感染事件由副溶血性弧菌引起，感染病例840人，是廣東省食源性致病感染的主要病原菌[3]。受人類(lèi)活動(dòng)影響，一些嗜鹽性弧菌環(huán)境適應(yīng)性增強(qiáng)，甚至出現(xiàn)耐藥性[4-5]，2006—2019年，廣州市市售動(dòng)物性淡水產(chǎn)品副溶血性弧菌總體檢出率達(dá)21.84%[6]，因此，副溶血性弧菌檢驗(yàn)?zāi)芰τ葹橹匾?/p>

對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員進(jìn)行能力驗(yàn)證是檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)內(nèi)部質(zhì)量控制的重要措施，根據(jù)CNAS-CL09：2013《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在微生物檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》[7]，通過(guò)實(shí)施能力驗(yàn)證評(píng)估檢驗(yàn)人員能力和確認(rèn)其資格，是確保實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)質(zhì)量滿足要求的重要手段之一。因此，為提高對(duì)食品中副溶血性弧菌的檢測(cè)能力，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室的競(jìng)爭(zhēng)力，本實(shí)驗(yàn)室參加了由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心策劃的副溶血性弧菌檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證活動(dòng)。本文總結(jié)了這次副溶血性弧菌能力驗(yàn)證的分離與鑒定過(guò)程，旨在為副溶血性弧菌的相關(guān)檢測(cè)提供參考。

2 材料

2.1 儀器

Milli-Q Reference超純水機(jī)(德國(guó)默克化工技術(shù)有限公司)；PL6001E電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；HWS-24電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技儀器有限公司)；LRH-250F生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；SW-CJ-2F超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；AC2-4S1生物安全柜(新加坡ESCO公司)；SX-700高壓滅菌鍋(日本TOMY公司)；MALDI-TOF/TOF 4800基質(zhì)輔助激光吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(法國(guó)梅里埃公司)；7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀系統(tǒng)(美國(guó)ABI公司)。

2.2 試劑

3%氯化鈉堿性蛋白胨水(廣東環(huán)凱公司)；3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂(廣東環(huán)凱公司)；硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖(thiosulfate citrate bile salts sucrose，TCBS)瓊脂培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱公司)；副溶血性弧菌生化鑒定盒(廣東環(huán)凱公司)；革蘭氏染色液(北京陸橋公司)；弧菌顯色培養(yǎng)基(法國(guó)科馬嘉公司)；CHCA基質(zhì)(法國(guó)梅里埃公司)；副溶血性弧菌免核酸提取核酸檢測(cè)試劑盒(卡尤迪生物)。

2.3 實(shí)驗(yàn)樣品

樣品編號(hào)為20-T923、20-S871的2份真空包裝白色凍干塊狀樣品(中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心)。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 檢驗(yàn)依據(jù)

2名人員根據(jù)中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心提供的《食品中副溶血性弧菌(定性)能力驗(yàn)證參試指導(dǎo)書(shū)》，對(duì)2份樣品進(jìn)行前處理，并按照GB 4789.7-2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》[8]進(jìn)行后續(xù)的副溶血性弧菌分離、純化、鑒定。同時(shí)使用副溶血性弧菌免核酸提取試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?進(jìn)行快速檢測(cè)，并以VITEK MS快速檢測(cè)分析分離出的可疑菌落，最終綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行報(bào)告。

3.2 檢驗(yàn)步驟

3.2.1 前處理

按照中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心提供的ACAS-PT909《食品中副溶血性弧菌(定性)作檢測(cè)業(yè)指導(dǎo)書(shū)》指導(dǎo)的方法，首先分裝60 mL和225 mL的3%氯化鈉堿性蛋白胨水；樣品開(kāi)啟后，立即加入5 mL的3%氯化鈉堿性蛋白脈水進(jìn)行水化；待溶解后，吸出放入無(wú)菌瓶中，再反復(fù)用余下的3%氯化鈉堿性蛋白胨水清洗西林瓶?jī)?nèi)壁，回收清洗液放入上述無(wú)菌瓶中，此溶液即是待測(cè)樣品原液。操作各環(huán)節(jié)應(yīng)保證無(wú)菌和充分混勻。本次凍干的能力驗(yàn)證品復(fù)原后等于60 mL的待測(cè)食品樣品。同時(shí)將質(zhì)控菌株ATCC 17802副溶血性弧菌作為陽(yáng)性對(duì)照加入225 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水，并設(shè)置空白對(duì)照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.2.2 GB 4789.7-2013定性檢測(cè)法鑒定菌株

增菌培養(yǎng)：使用振蕩器震蕩使得原液充分混勻，以無(wú)菌操作分別取樣品原液25 mL，加入3%氯化鈉堿性蛋白胨水225 mL，用均質(zhì)器均質(zhì)，制備成1∶10的樣品勻液，并置于培養(yǎng)箱36℃培養(yǎng)18 h。

分離：將2袋增菌液，分別用接種環(huán)沾取1環(huán)增菌液，于TCBS平板和弧菌顯色培養(yǎng)基平板上劃線分離，培養(yǎng)箱36℃培養(yǎng)24 h。

純培養(yǎng)：在TCBS平板和弧菌顯色培養(yǎng)基平板上分別挑取3個(gè)可疑菌落，劃線接種3%氯化鈉胰蛋白脈大豆瓊脂平板，于培養(yǎng)箱36℃培養(yǎng)24 h。

鑒定：從上一步的培養(yǎng)基中挑取單菌落進(jìn)行鏡檢、氧化酶試驗(yàn)、嗜鹽性試驗(yàn)及三糖鐵瓊脂穿刺，再根據(jù)情況使用生化試劑盒進(jìn)行確定鑒定。

3.2.3 MALDI-TOF MS鑒定菌株

樣品增菌、分離、純培養(yǎng)與國(guó)標(biāo)法同步進(jìn)行，從純培養(yǎng)的3%氯化鈉胰蛋白脈大豆瓊脂平板上挑取新鮮單菌落，厚薄均勻地涂布于VITEK MS靶板上，并立即在靶孔加上HCCA基質(zhì)液(1μL/孔)，以防氣溶膠污染。待基質(zhì)晾干后，轉(zhuǎn)移至質(zhì)譜儀中，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行菌株質(zhì)譜采集及特征性鑒定，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

3.2.4 Real-time PCR法鑒定菌株

樣品增菌、分離與國(guó)標(biāo)法同步進(jìn)行，接種可疑菌落至5 mL腦心浸出液肉湯 (brain heart infusion broth，BHI)中，36℃培養(yǎng)24 h，所得菌液即可進(jìn)行鑒定。依照副溶血性弧菌免核酸提取核酸檢測(cè)試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)對(duì)BHI菌液進(jìn)行鑒定。

PCR反應(yīng)條件：第一階段：95℃，5 s，10個(gè)循環(huán)；55℃，5 s，1個(gè)循環(huán)。第二階段：95℃，1 min，1個(gè)循環(huán)。第三階段：95℃，5 s，40個(gè)循環(huán)；60℃，30 s，40個(gè)循環(huán)。

4 結(jié)果與分析

4.1 分離和提純

樣品20-S871和20-T923在TCBS和弧菌顯色平板上分離劃線培養(yǎng)，并挑取可疑菌株進(jìn)行分離提純和生化鑒定(編號(hào)為1-6)。菌落形態(tài)表現(xiàn)詳見(jiàn)表1。

表1 選擇性分離培養(yǎng)基上菌落形態(tài)

4.2 生化鑒定結(jié)果

將分離提純后的6個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，編號(hào)為3的菌落為革蘭氏陽(yáng)性菌，呈棒狀；其余的均為革蘭氏陰性菌，呈棒狀。氧化酶試驗(yàn)、三糖鐵瓊脂穿刺及嗜鹽性試驗(yàn)初步鑒定后(見(jiàn)表2)，經(jīng)生化試劑盒鑒定，樣品20-S871檢出副溶血性弧菌；樣品20-T923未檢出副溶血性弧菌，生化結(jié)果詳見(jiàn)表3。

表2 氧化酶試驗(yàn)、三糖鐵瓊脂穿刺及嗜鹽性試驗(yàn)結(jié)果

表3 生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.3 Real-time PCR法鑒定結(jié)果

在此項(xiàng)鑒定實(shí)驗(yàn)中，陽(yáng)性對(duì)照2的FAM通道的CT值為21.280，樣品1和樣品2的FAM通道的CT值分別為8.961和9.046，均小于28，且有對(duì)應(yīng)的指數(shù)增長(zhǎng)擴(kuò)增曲線，即鑒定為副溶血性弧菌陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)圖譜見(jiàn)圖1。

4.4 MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果

使用直接涂抹法進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示6株菌株均可鑒定到種水平，且可信度均達(dá)99.9%。結(jié)果詳見(jiàn)表4。

表4 6種菌鑒定結(jié)果

5討論

在本次能力驗(yàn)證，樣品編號(hào)為20-S871的檢出副溶血性弧菌，20-T923的未檢出副溶血性弧菌，結(jié)果滿意，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員具備檢測(cè)副溶血性弧菌的能力。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，挑取的初期增菌液較多，導(dǎo)致菌落幾乎蔓延至整塊TCBS平板，分離出的單菌落較少，若樣品中存在多種干擾菌株則容易出現(xiàn)漏檢情況。建議通過(guò)結(jié)合使用TCBS和弧菌顯色培養(yǎng)基，篩選出目標(biāo)菌株。鑒于存在易混淆變異菌株干擾或不典型目標(biāo)菌株[9-11]的可能，如在TCBS平板上出現(xiàn)顯色相近的一類(lèi)海洋弧菌、創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌等，或在弧菌顯色平板上出現(xiàn)非典型淡紫色菌落，應(yīng)挑取可疑菌落進(jìn)行生化鑒定，日常檢驗(yàn)中需要憑借經(jīng)驗(yàn)結(jié)合實(shí)際情況，使用多種方法對(duì)菌落進(jìn)行確證。

使用傳統(tǒng)檢測(cè)方法鑒定副溶血性弧菌需要5 d，通過(guò)結(jié)合PCR-熒光探針?lè)ㄟM(jìn)行確證，可以直接判斷樣品中是否存在目標(biāo)菌株，使檢測(cè)時(shí)限將縮短到2～3 d，對(duì)日常檢測(cè)工作具有積極影響。MALDITOF MS具有高特異性、高靈敏度、高通量、速度快等優(yōu)點(diǎn)[12-13]，近年來(lái)應(yīng)用于對(duì)致病菌進(jìn)行快速識(shí)別技術(shù)，得到了快速發(fā)展。在本次實(shí)驗(yàn)中，MALDI-TOF MS的鑒定結(jié)果的可信度高、檢測(cè)效率高。通過(guò)多種方法輔助鑒別，保證了本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

近年來(lái)副溶血性弧菌的檢測(cè)方法呈現(xiàn)多樣化，如以免疫層析法[14]為代表的免疫學(xué)檢測(cè)法；以多重PCR法[15-16]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法[17-18]為代表的分子生物學(xué)檢測(cè)法等。熟悉各檢測(cè)方法的不同特征和優(yōu)缺點(diǎn)，結(jié)合實(shí)際情況實(shí)現(xiàn)快速鑒別，可以節(jié)省檢測(cè)時(shí)間，提高食品檢驗(yàn)工作效率。