魏曉雅 陳健 李婷婷 劉德星 岳巧云

(中山海關(guān)技術(shù)中心 廣東中山 528403)

1 前言

動(dòng)物源性食品與人類生產(chǎn)生活息息相關(guān)，是民生的重要消費(fèi)品。各國(guó)政府都針對(duì)動(dòng)物源性食品安全監(jiān)管制定了嚴(yán)厲的政策法規(guī)，但仍有少數(shù)不法分子在利益驅(qū)動(dòng)下，通過(guò)各種手段進(jìn)行摻雜造假，如2013年席卷歐洲的“馬肉事件”、明星火鍋店“牛血冒充鴨血”事件、“淡水虹鱒魚冒充三文魚”事件等，給食品安全的監(jiān)管工作帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)，也對(duì)動(dòng)物源性食品的種類鑒別工作提出更高的要求，尤其是對(duì)深加工食品的成分準(zhǔn)確和快速鑒定方法提出了迫切需求。

在深加工食品的加工過(guò)程中，切割、攪拌，食品添加劑、防腐劑，高溫高壓等處理都會(huì)改變?cè)牧系男螒B(tài)、味道和口感，這導(dǎo)致深加工食品原材料的物種鑒別變得非常困難。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)深加工食品物種鑒別的常見(jiàn)方法有：顯微觀察法、光譜分析法、質(zhì)譜分析法、免疫分析法、電泳分析法等，這些方法因假陽(yáng)性率高、性價(jià)比低、特異性差、靈敏度低等不能廣泛應(yīng)用，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，DNA條形碼技術(shù)在深加工食品的物種鑒定工作中具有更廣闊的的前景[1]。

DNA條形碼(DNA barcoding)是利用生物本身所具有的一段或幾段易擴(kuò)增的、標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、相對(duì)較短的DNA片段來(lái)進(jìn)行物種鑒定的技術(shù)[2]，DNA條形碼技術(shù)不受動(dòng)物源性加工食品原始可識(shí)別形態(tài)特征的限制，技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，目前已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物源性加工食品類物種鑒定，如陳健[3]利用DNA條形碼技術(shù)檢測(cè)36份調(diào)理肉制品的成分，發(fā)現(xiàn)其中29份樣品成分與標(biāo)識(shí)成分不符；Quinto[4]利用DNA條形碼技術(shù)測(cè)定54份美國(guó)境內(nèi)零售商出售的野生動(dòng)物肉制品成分，發(fā)現(xiàn)18.5%的野生動(dòng)物肉制品存在虛假標(biāo)簽的問(wèn)題；石盼盼[5]利用DNA條形碼技術(shù)發(fā)現(xiàn)河南省范圍內(nèi)大型超市牛肉產(chǎn)品摻雜豬肉和雞肉的情況比較嚴(yán)重。

在動(dòng)物源性加工食品的加工過(guò)程中，不僅改變了原材料的外觀，導(dǎo)致檢測(cè)人員無(wú)法利用形態(tài)、味道和色澤等外觀特征進(jìn)行種類判斷，還有可能造成原材料核酸成分的降解，從而導(dǎo)致分子檢測(cè)結(jié)果的不理想。因此，本文探索不同加工方式(腌制、高壓、炸、燒、炒、蒸、燉煮)處理的豬肉樣品對(duì)基因組DNA提取效果的影響，通過(guò)對(duì)比分析進(jìn)行確認(rèn)，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，實(shí)現(xiàn)加工食品中動(dòng)物源性成分的鑒定，以期為食品安全監(jiān)管提供技術(shù)支持，保證廣大消費(fèi)者的利益。

2 材料與制備

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮豬肉樣品、調(diào)味料均購(gòu)自本地超市。

2.2 加工方法

2.2.1 不同腌制方式

對(duì)新鮮豬肉樣品切薄片后均勻分成9份，1份為對(duì)照，不添加任何調(diào)味料腌制，在4℃條件下放置24 h；8份為實(shí)驗(yàn)組，其中4份用調(diào)味料(食鹽、醬油、食鹽加醬油、混合調(diào)料)在4℃條件下腌制24 h[6]，調(diào)味料的用量為樣品重量的1%[7]；另外4份用對(duì)應(yīng)的調(diào)味料(食鹽、醬油、食鹽加醬油、混合調(diào)料)在4℃腌制24 h，調(diào)味料的用量為樣品重量的10%。

2.2.2 高壓

將不同調(diào)味料腌制的樣品和對(duì)照樣品分別置于干凈的容器中，在高壓滅菌鍋中，121℃處理20 min，取出晾涼備用。

2.2.3 不同烹飪方式

不同調(diào)味料腌制的樣品和對(duì)照樣品分別進(jìn)行以下處理：經(jīng)炸、燉、炒、蒸、燉煮烹飪至熟透(按照家庭常用烹飪方法操作)，具體方法如下：

(1)炸：在鍋中加入適量且等量的油，油燒熱后，將樣品分別放入鍋中炸熟，待樣品在油鍋中浮起后取出晾涼備用。

(2)燒：熱鍋中放入適量且等量的油，樣品分別放入炒制變色后，加入適量且等量的水，大火煮沸，小火至湯汁收干，取出晾涼備用。

(3)炒：在鍋中加入適量且等量的油，樣品分別放入鍋中炒熟，取出晾涼備用。

(4)蒸：蒸鍋中倒入開水，樣品分別放入蒸鍋中，蒸熟，取出晾涼備用。

(5)燉煮：在鍋中加入適量且等量的水燒開后，將樣品分別放入鍋中，充分燉熟，取出晾涼備用。

2.2.4 不同燉煮時(shí)間

在鍋中加入適量且等量的水燒開后，將不同調(diào)味料腌制的樣品和對(duì)照樣品，分別放入鍋中，分別燉煮0.5 h、1 h、1.5 h、2 h后依次撈出，晾涼備用。

3 試劑與儀器

Ex Taq酶、dNTP、10×buffer、瓊脂糖、6×Loading buffer及引物(寶生物工程(大連)有限公司)；血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(目錄號(hào)DP304-03)及DNA markerII(天根生物科技有限公司)；SYBR Green I(廣州普博欣科技有限公司)；50×TAE(索萊寶生物科技有限公司)。

GR60DR高壓滅菌鍋(美國(guó)ZEALWAY公司)；PIC017微量臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)HERAEUS公司)；PCMT恒溫金屬浴(英國(guó)Grant公司)；ABI Proflex三槽PCR儀(美國(guó)ABI公司)；DYY-6C電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；D-55-26M-AUTO凝膠成像儀(美國(guó)UVP公司)。

4 試驗(yàn)方法

4.1 DNA提取

處理完畢的樣品及對(duì)照樣品，每份各取30 mg放入1個(gè)1.5 ml離心管中備用，不對(duì)樣品進(jìn)行任何脫油脫鹽的處理，直接按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書指導(dǎo)提取基因組DNA。

4.2 PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

4.2.1 引物對(duì)PCR反應(yīng)結(jié)果的影響

本研究共選用5對(duì)多細(xì)胞脊椎動(dòng)物DNA條形碼的通用引物，先使用不同烹飪方式處理過(guò)的樣品，探索出適用性較佳的引物，優(yōu)先使用擴(kuò)增長(zhǎng)度為658 bp/702 bp的引物對(duì)樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增不出后再選用擴(kuò)增長(zhǎng)度為244 bp/376 bp/472 bp的引物對(duì)樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增。引物信息詳見(jiàn)表1[8-10]。

表1 引物信息表

4.2.2 退火溫度對(duì)PCR反應(yīng)結(jié)果的影響

使用未經(jīng)任何方式處理過(guò)的樣品，采用溫度梯度PCR反應(yīng)，每隔2°設(shè)置溫度梯度。溫度范圍設(shè)定為：42～68℃。

PCR反應(yīng)體系(50μl)：10×buffer 5μl；正向引物(20 nmol/μl)1μl；反向引物(20 nmol/μl)1μl；dNTP(10 nmol/μl)2μl；EX-Taq(5 U/μl)0.5μl；模板DNA(60 ng/μl)1μl；無(wú)菌水定容至50μl[11]。

Ex-Taq DNA聚合酶擴(kuò)增條件：94℃變性5min；94℃、30s；42-68℃、30s；72℃、10min；30個(gè) 循 環(huán)；72℃延伸10min。

PCR擴(kuò)增完成后，經(jīng)1%瓊脂糖進(jìn)行電泳分離后，使用凝膠成像系統(tǒng)分析擴(kuò)增產(chǎn)物。

4.3 測(cè)序

成功擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送至廣州天一輝遠(yuǎn)科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序引物同擴(kuò)增引物。

5 結(jié)果與分析

5.1 引物適用性

先使用不同加工方式(腌制、炸、燒、炒、蒸、燉煮)處理過(guò)的樣品，用引物L(fēng)CO1490/HCO2198以及BatL5310/R6036R，退火溫度參照參考文獻(xiàn)[11]使用50℃，對(duì)所有樣品進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果(圖1)表明，對(duì)不同加工方式處理過(guò)的樣品，引物BatL5310/R6036R的適用性明顯優(yōu)于LCO1490/HCO2198。

5.2 退火溫度

使用未經(jīng)任何方式處理過(guò)的樣品，探索PCR的最適退火溫度，每隔2°設(shè)置溫度梯度，溫度范圍設(shè)定為：42～68℃。PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖2)顯示退火溫度的上限在68℃左右后，從62℃(11泳道)起，未出現(xiàn)雜帶，將在不同退火溫度梯度下擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物全部送測(cè)序，獲得的序列完全一致。綜合考慮擴(kuò)增引物的適用性和擴(kuò)增效率使用62℃退火溫度對(duì)不同加工方式處理的樣品的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖3。

5.3 加工方式

由圖3和4可知，不同濃度的調(diào)味料腌制的樣品對(duì)擴(kuò)增效果并無(wú)影響，不同烹飪方式(炸、燒、炒、蒸)處理過(guò)的樣品對(duì)擴(kuò)增效果也無(wú)影響，但隨著燉煮時(shí)間的增長(zhǎng)，對(duì)擴(kuò)增效果會(huì)有影響，當(dāng)燉煮時(shí)間達(dá)到1.5 h時(shí)，條帶亮度明顯減弱；當(dāng)燉煮時(shí)間達(dá)到2 h時(shí)，當(dāng)使用引物BatL5310/R6036R只有部分樣品有擴(kuò)增條帶，但全部樣品均可用短片段引物(244 bp/376 bp/472 bp的片段)擴(kuò)增出(圖5)。

經(jīng)高壓處理過(guò)的樣品都不能擴(kuò)增出658 bp/702 bp大小的片段，但能全部擴(kuò)增出244 bp大小的片段，部分樣品能擴(kuò)增出376/472 bp的片段(圖6)，說(shuō)明經(jīng)高壓處理的樣品，DNA受到了一定程度的破壞，不易擴(kuò)增出大片段的基因。

5.4 應(yīng)用

隨機(jī)購(gòu)買8種加工動(dòng)物源性食品，應(yīng)用上述方法對(duì)購(gòu)買的樣品進(jìn)行物種鑒定，將PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的樣品送至廣州天一輝遠(yuǎn)科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中的序列進(jìn)行比對(duì)，PCR檢測(cè)及DNA條形碼鑒定結(jié)果見(jiàn)表2，說(shuō)明該方法不僅適用于市售加工豬肉類食品的物種鑒定，也可以應(yīng)用于其他種類動(dòng)物源性加工食品成分份的檢測(cè)。

表2 加工動(dòng)物源性食品的PCR檢測(cè)及DNA條形碼鑒定結(jié)果

6 討論

本文探索了不同加工方式對(duì)豬肉基因組DNA提取的影響，并對(duì)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)對(duì)樣品DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序即可鑒別物種來(lái)源。結(jié)果表明，一般的常見(jiàn)加工方式(腌制、炸、燒、炒、蒸、燉煮)對(duì)擴(kuò)增效果并無(wú)影響，而隨著烹飪時(shí)間或者溫度壓強(qiáng)的增加，DNA受到了一定程度的破壞，對(duì)擴(kuò)增效果則有影響。試驗(yàn)結(jié)果與黃婭琳[12]、Arslan[13]等研究結(jié)果一致，可用擴(kuò)增短片段的引物進(jìn)行擴(kuò)增。豬肉樣品的檢測(cè)，引物用BatL5310/R6036R，退火溫度選擇62℃，擴(kuò)增效果良好。相比現(xiàn)有相同技術(shù)的物種鑒定方法，本方法操作便捷、所需儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低，適用于對(duì)市售常見(jiàn)加工豬肉類樣品物種鑒定，亦可推廣應(yīng)用于其他肉類樣品的檢測(cè)，在應(yīng)用此方法對(duì)其他肉類樣品進(jìn)行物種鑒定過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，煙熏的加工方式對(duì)長(zhǎng)片段的擴(kuò)增可能會(huì)有影響，將在后續(xù)的研究中進(jìn)一步探討。