方道艷，施麗梅，李朋富，蔡元鋒，張 民，史小麗，吳慶龍，于 洋

(1:南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210093)(2:中國科學(xué)院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國家重點實驗室，南京 210008)(3:中國科學(xué)院南京土壤研究所土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室, 南京 210008)

在夏季湖泊暴發(fā)的藍藻水華中，微囊藻(Microcystisspp．)是主要優(yōu)勢種. 當(dāng)氣象和水文條件適宜時，微囊藻會迅速繁殖并聚集，形成微囊藻水華[1-2]. 微囊藻能產(chǎn)生毒素、消耗氧氣及釋放氣味化合物等，從而帶來一系列生態(tài)問題和健康風(fēng)險[3-4]. 微囊藻在自然界中普遍以群體形態(tài)存在，這也是微囊藻屬能在淡水生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)獨特生態(tài)位，形成優(yōu)勢的重要原因之一[5-6]. 在富營養(yǎng)化湖泊中，微囊藻的生長繁殖除了受環(huán)境因素，例如溫度、光照和氮磷供應(yīng)水平等的影響[7-9]，還與大量定殖在藻群體上的或者游離在藻細胞周圍的異養(yǎng)細菌關(guān)系密切[1]. 研究表明細菌能夠影響微囊藻的形態(tài)和群體形成[10]，并且微囊藻與其附生細菌之間具有密切的代謝偶聯(lián)關(guān)系[11]. Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)，藻際細菌群落促進了不同水華藍藻之間的演替，表明了附生細菌在微囊藻生長及其水華發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用.

同時，微囊藻水華也會影響水體細菌群落結(jié)構(gòu)組成[13-14]. 藻類通過分泌胞外多糖等代謝產(chǎn)物影響藻周圍生境中的物質(zhì)組成[15-17]，從而影響周圍細菌的群落結(jié)構(gòu). 不同藻的胞外多糖含量和組成不同[9]，故特定藻的附生細菌相對于其他的藻具有特異性[18-19]. 雖然在不同湖泊生境下同種微囊藻群體上的細菌群落組成趨于相似[19]，但細菌群落多樣性會隨著微囊藻水華的發(fā)展產(chǎn)生波動[20]. 此外，微囊藻群體的附生細菌組成不同于游離細菌或其他沉降顆粒附生細菌的，具有明顯的特異性[21]. 細菌群落組成除了因不同水華階段和優(yōu)勢藍藻種類的不同而發(fā)生變化外，也會受到溫度等環(huán)境因素的影響[22]. Wang等[23]發(fā)現(xiàn)環(huán)境因素對洱海藻類附生細菌和游離細菌群落組成的影響要大于浮游植物群落組成的影響，其中溫度是主要的環(huán)境影響因素之一. 有研究報道，附生細菌和游離細菌由于受到溫度等環(huán)境因素的影響，兩者群落組成之間共享的OTUs占59%(占總reads的96%)，部分細菌會在附生狀態(tài)和游離狀態(tài)之間發(fā)生轉(zhuǎn)變[24]. 因此，藻的附生菌中存在穩(wěn)定附著和隨機附著的類型，探討環(huán)境條件變化下的穩(wěn)定附著細菌群落組成是進一步深入研究藻-菌關(guān)系的重要方面.

由于在野外微囊藻水華中多種藍藻種屬經(jīng)常共存，因此，細菌群落組成往往受到多種因素綜合的影響，揭示其影響規(guī)律較為困難. 而關(guān)于微囊藻附生菌的室內(nèi)研究，大都以單細胞微囊藻作為研究對象[22].單細胞微囊藻與群體微囊藻在形態(tài)和生理上有很大差異，比如微囊藻群體株系細胞壁表面相比單細胞株系具有更厚的表層蛋白(S-layer)[25]. 對于單一微囊藻群體附生細菌群落組成對溫度的響應(yīng)目前仍不清楚. 為了進一步探究在溫度變化下，微囊藻群體上細菌群落組成及其在溫度波動下的核心微生物類群，本研究以從太湖分離的一株群體銅綠微囊藻為材料，揭示了在4種溫度下附生與游離細菌群落組成的相對穩(wěn)定性和動態(tài)變化規(guī)律，從而有助于了解藻-菌相互關(guān)系對微囊藻水華生消的影響.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藻種培養(yǎng)和采樣 本研究采用的銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)群體D2，下文簡稱“D2群體”，由蔡元鋒博士在2011年從太湖分離純化得到. 將擴大培養(yǎng)后的D2群體，接種到含250 mL BG-11培養(yǎng)基的500 mL滅菌玻璃三角瓶中，并放置在設(shè)定不同溫度的光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，初始接種濃度為5×104cells/mL. 綜合文獻報道[7, 26]及對太湖湖水溫度的調(diào)查，本實驗將溫度梯度設(shè)置為15、20、25和30℃，來模擬野外微囊藻所處的溫度. 實驗每組設(shè)置3個平行，光暗周期為12 h∶12 h，光照強度為50 μmol photons/(m2·s). 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，分別在第15、35、45和65天取樣. 取樣前輕輕搖勻，使D2群體均勻分布. 微囊藻單個細胞大小一般為3～5 μm，而微囊藻群體一般含4個以上微囊藻細胞，因此，取適量體積藻液(10 mL)后，依次過濾在20、3和0.2 μm的濾膜(47 mm直徑，Millipore，Germany)上，則分別代表微囊藻群體(>20 μm)、單細胞-小群體(3～20 μm)和游離(0.2～3 μm)等3種不同粒徑中的細菌群落，濾膜保存在-80℃，直至分析使用.

1.1.2 主要儀器與試劑 光照培養(yǎng)箱和PCR儀(ABI GeneAmp?9700型)等. 乙基黃原酸鉀、乙酸銨、EDTA、Tris-HCl、10% SDS、RNase A、異丙醇、70%乙醇和無菌水等.

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取 DNA提取采用乙基黃原酸鉀(XS)法[27-28]，處理過程如下：取出過濾樣品得到的3種梯度濾膜，用干凈滅菌剪刀剪碎后，置于1.5 mL的離心管中，加入50 μL的TER(10 mmmol/L Tris-HCl， pH=7.4；1 mmol/L EDTA，pH=8；100 mg/mL RNase A)溶液. 隨后加入新制的XS緩沖液(1% XS；100 mmmol/L Tris-HCl，pH=7.4；20 mmmol/L EDTA，pH=8；1% SDS；800 mmmol/L ammonium acetate)，前后搖晃，混合. 將混合后的細胞裂解液在70℃下水浴60 min，期間每隔10 min搖晃一次. 之后，將試管劇烈渦流10 s，再置于冰上30 min. 將細胞裂解液以14000 r/min，在4℃下離心10 min，去除細胞碎片. 隨后將上清液小心地轉(zhuǎn)移到含有750 μL異丙醇的離心管中，在室溫下放置10 min. 在12000×g，4℃下離心10 min，使得DNA沉淀. 之后加入70%乙醇，在12000×g，4℃下離心10 min洗滌沉淀，并風(fēng)干. 最后將DNA溶解在50 μL的無菌水中.

1.2.2 PCR擴增 用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物對V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增[29]，并添加barcode序列，程序如下：95℃預(yù)變性3 min，27個循環(huán)(95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s)，最后72℃延伸10 min. 采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL擴增體系：10 ng DNA模板，0.8 μL BSA，0.4 μL FastPfu 聚合酶，0.8 μL的正向引物(5 μmol/L)和反向引物(5 μmol/L)，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs和4 μL 5×FastPfu緩沖液，最后加ddH2O至20 μL.

1.2.3 Illumina MiSeq測序 用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences，Union City，CA，USA)進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測. 利用QuantiFluorTM-ST(Promega，USA)進行檢測定量. 根據(jù)Illumina MiSeq平臺(Illumina，San Diego，USA)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴增片段構(gòu)建PE 2*300的文庫. 利用Illumina公司的Miseq PE 300平臺進行測序，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成. 原始序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫，BioProject序列號為PRJNA700808.

1.3 數(shù)據(jù)處理

原始測序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控，使用FLASH軟件[30]進行拼接. 使用UPARSE軟件[31](version7.1 http://drive5.com/uparse/)，根據(jù)97%的相似度對序列進行OTU聚類，并在聚類的過程中去除單序列和嵌合體. 利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)對每條序列進行物種分類注釋[32]，比對Silva數(shù)據(jù)庫(SSU123)，設(shè)置比對閾值為70%. 利用mothur軟件(version 1.30.1)進行Alpha多樣性分析(http://www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity)，包括物種豐富度Chao1指數(shù)，Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(以下簡稱Shannon指數(shù))和譜系多樣性PD指數(shù)(以下簡稱PD指數(shù))[33]，指數(shù)組間差異采用Wilcoxon秩和檢驗(Wilcoxon rank-sum test)確定. 統(tǒng)計分析和相關(guān)繪圖利用Origin 9.1、GraphPad Prism 9和R語言平臺實現(xiàn)：R語言‘vegan’軟件包進行NMDS和PERMANOVA分析和作圖；‘stats’軟件包進行組間差異顯著性檢驗；并利用R完成群落組成分析和Venn圖分析. 單因素相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析使用Python語言‘Networkx’工具包確定，篩選條件為：選取屬分類水平上總豐度前50的物種，并計算物種之間的斯皮爾曼(Spearman)等級相關(guān)系數(shù)(|R|≥0.5，P<0.05). 除了單因素相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析包含藍藻序列外，以上其它分析均去除藍藻序列.

2 結(jié)果分析

2.1 D2群體培養(yǎng)體系中不同粒徑細菌群落的多樣性受溫度的影響

Alpha多樣性分析顯示，在微囊藻群體附生細菌群落中，不同溫度下的細菌群落多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均沒有顯著性差異(圖1a～c)，但15℃下，單細胞-小群體附生細菌群落的群落多樣性PD指數(shù)要顯著高于25℃下的(P<0.05)(圖1c)，且在游離細菌群落中，15℃下細菌群落Shannon多樣性指數(shù)顯著高于25℃和30℃(P<0.05)(圖1a)，表明單細胞-小群體附生細菌群落和游離細菌群落在溫度較低時組成更為多樣.

圖1 D2群體培養(yǎng)體系中群體(>20 μm)附生細菌、單細胞-小群體(3～20 μm)附生細菌和游離(0.2～3 μm)細菌群落在15、20、25和30℃下Alpha多樣性比較分析(Wilcoxon秩和檢驗，*P<0.05，去除藍藻序列)Fig.1 Comparative analysis of alpha diversity of bacteria communities in colonial D2 culture systems at 15, 20, 25 and 30℃ attached with Microcystis colony (>20 μm), single cell-small colony (3-20 μm) and free-living (0.2-3 μm) bacterial community, respectively (Wilcoxon rank-sum test, *P<0.05, after removing cyanobacteria sequences)

對于Beta多樣性，基于Bray-Curtis距離的NMDS分析表明，溫度均顯著影響微囊藻群體(圖2a)、單細胞-小群體附生(圖2b)和游離細菌(圖2c)群落分布(PERMANOVA，P<0.01)；PERMANOVA分析揭示，溫度能分別單獨解釋3組細菌群落組成總體差異的44.38%、45.97%和65.35%，則表明相比微囊藻群體附生細菌和單細胞-小群體附生細菌，溫度變化對游離細菌群落組成影響要大(P<0.01).

圖2 D2群體培養(yǎng)體系中不同粒徑下的細菌群落基于Bray-Curtis距離的非度量多維尺度(NMDS)分析(OTU水平，去除藍藻序列)(注：以15D1520為例，其表示第15天時，D2群體在15℃、>20 μm粒徑細菌群落樣本)Fig.2 Non-metric Multidimensional Scaling (NMDS) ordination based on Bray-Curtis distances of bacterial communities of different particles at OTU level (after removing cyanobacteria sequences)

而同一溫度下，微囊藻群體、單細胞-小群體附生和游離細菌群落分布也具有差異性(圖3). PERMANOVA分析揭示，粒徑大小能分別單獨解釋15、20、25和30℃下樣本群落組成總體差異的60.87%、37.29%、35.74%和48.22%. 在15℃和30℃下，3種粒徑大小下的細菌群落具有極顯著差異(P<0.01)，20和25℃下不同粒徑細菌群落組成具有顯著性差異(P<0.05). 這些結(jié)果表明，不同粒徑大小能夠顯著影響D2銅綠微囊藻群體的細菌群落組成，且在15℃和30℃下，細菌群落組成差異性更大(P<0.01).

圖3 不同溫度下的D2群體培養(yǎng)體系中細菌群落基于布雷柯蒂斯(Bray-Curtis)距離的非度量多維尺度(NMDS)分析(OTU水平)(a～d分別代表15、20、25和30℃下細菌群落組成差異(去除藍藻序列))Fig.3 Non-metric Multidimensional Scaling (NMDS) ordination based on Bray-Curtis distances of bacteria communities at different temperatures at OTU level (a-d represent the composition differences of bacterial communities at 15, 20, 25 and 30℃, respectively (after removing cyanobacteria sequences))

2.2 D2群體培養(yǎng)體系中不同粒徑細菌群落在不同溫度下的組成差異

綜合4次時間點取樣的平均值，由溫度對D2群體細菌群落組成影響的分析結(jié)果表明，在微囊藻群體附生細菌群落中，Sphingomonadales、Caulobacterales和Sphingobacteriales是優(yōu)勢菌目，分別占總相對豐度的21.35%、17.18%和15.99%；而單細胞-小群體附生細菌群落中，有19.74%是Pseudomonadales，其次是Cytophagales和Sphingobacteriales，分別占總相對豐度的15.65%和15.14%；Cytophagales、Sphingobacteriales和Chlorobiales則在游離的細菌群落中相對豐富，分別占總相對豐度的33.44%、15.48%和15.32%(圖4).

隨著溫度的變化，這些不同粒徑下的優(yōu)勢菌目，呈現(xiàn)不同的變化趨勢(圖4). 在微囊藻群體附生細菌群落中，Sphingomonadales相對豐度在15℃下最低，占8.97%，當(dāng)在30℃時相對豐度增加至31.45%，總體呈現(xiàn)上升趨勢；Caulobacterales和Sphingobacteriales在15℃時，相對豐度相近，分別是27.04%和21.26%，但不同的是，Caulobacterales相對豐度在20℃時降至14.42%，隨后在25℃和30℃下波動較小；而Sphingobacteriales相對豐度在20℃下占20.17%，基本與15℃下持平，隨后在25℃下降至10.61%，再在30℃下基本保持穩(wěn)定.

圖4 D2群體培養(yǎng)體系中不同粒徑包括微囊藻群體(>20 μm)附生細菌、單細胞-小群體(3～20 μm)附生細菌和游離(0.2～3 μm)細菌在15、20、25和30℃下的目水平群落組成(去除藍藻序列)Fig.4 At order level, composition of bacteria communities attached with Microcystis colony (>20 μm), single cell-small colony (3-20 μm) and free-living (0.2-3 μm) bacterial community in colonial D2 culture systems level at 15, 20, 25 and 30℃ (after removing cyanobacteria sequences)

在單細胞-小群體附生細菌群落中，Pseudomonadales和Sphingobacteriales相對豐度變化趨勢接近，兩者都在15℃下最高，分別占28.63%和27.53%，且在20℃下均開始下降，分別降至17.29%和11.94%；不同的是，Pseudomonadales相對豐度在25℃時，有略微下降后(占15.94%)，在30℃下又回到接近20℃下的值，為17.09%，而Sphingobacteriales在20℃和25℃下，相對豐度先保持穩(wěn)定，在30℃下又略微下降. Cytophagales則在15℃時相對豐度極低，僅占0.31%，隨后在其它3個溫度下，依次增加，在30℃下，增加至26.93%.

在游離細菌群落中，Cytophagales在4個溫度下整體有較大的增長幅度，在15℃下，其相對豐度占5.32%，當(dāng)在30℃下相對豐度占比增加至52.90%；Sphingobacteriales的相對豐度在15℃下與Chlorobiales的相對豐度接近，分別為26.22%和25.17%. 隨后，Sphingobacteriales相對豐度下降幅度較Chlorobiales的大，在20℃時，兩者的相對豐度分別是9.96%和18.11%，但之后Sphingobacteriales基本保持穩(wěn)定，而Chlorobiales持續(xù)下降，到30℃時兩者的相對豐度占比分別是9.66%和7.09%.

在目水平上(圖5)，微囊藻群體附生細菌群落中，Sphingomonadales在15℃下的相對豐度要顯著低于25℃和30℃下的(P<0.05)，Chlorobiales相對豐度在15℃下要顯著高于其余3個溫度下的(P<0.05)，而Rhodobacterales相對豐度在15℃下要顯著低于20℃和25℃下的(P<0.05). 在單細胞-小群體附生細菌群落中，Sphingobacteriales相對豐度在15℃下顯著高于20℃和25℃下的(P<0.05)，極顯著高于30℃下的(P<0.01)，而Rhodospirillales在15℃下的相對豐度，分別與25℃和30℃下的相對豐度，有極顯著(P<0.01)和顯著差異(P<0.05)；而游離細菌群落中的Cytophagales相對豐度，在15℃下要顯著低于20℃和25℃下的(P<0.05)，極顯著低于30℃下的(P<0.001)，Sphingomonadales相對豐度在15℃下要顯著高于其在20℃下的(P<0.05)，Chlorobiales相對豐度在15℃下要顯著高于25℃和30℃下的值(P<0.05)，且在20℃下的相對豐度顯著高于30℃下的(P<0.05)，Burkholderiales在15℃下占優(yōu)勢，相對豐度極顯著高于其余3個溫度下的值(P<0.01)，Caulobacterales相對豐度在15℃下要極顯著高于30℃下的(P<0.01). 結(jié)果表明，在微囊藻群體附生細菌群落中，Sphingomonadales和Rhodobacterales在15℃下相對豐度較低，而Chlorobiales相反，其在15℃下具有較高的相對豐度；在單細胞-小群體附生細菌群落中，Sphingobacteriales更能適應(yīng)15℃環(huán)境；而在游離細菌群落中，Cytophagales在溫度高的環(huán)境占據(jù)優(yōu)勢，Chlorobiales和Burkholderiales更能適應(yīng)15℃環(huán)境.

圖5 D2群體培養(yǎng)體系中不同粒徑包括微囊藻群體(>20 μm)附生細菌、單細胞-小群體(3～20 μm)附生細菌和游離(0.2～3 μm)細菌群落在15、20、25和30℃下目水平的豐度差異(去除藍藻序列，One-way ANOVA，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)Fig.5 At order level, differential abundance of bacterial communities attached with Microcystis colony (>20 μm), single cell-small colony (3-20 μm) and free-living (0.2-3 μm) bacterial community in colonial D2 culture systems at 15, 20, 25 and 30℃ (after removing cyanobacteria sequences, One-way ANOVA, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001)

2.3 D2群體培養(yǎng)體系中不同粒徑細菌群落在4種溫度下核心微生物組成差異

在屬水平上，微囊藻群體、單細胞-小群體附生和游離細菌群落，在不同溫度下均存在的微生物(以下稱為核心物種)數(shù)量分別是34、37和28個(圖6). 在微囊藻群體附生細菌群落核心物種中，Porphyrobacter、Brevundimonas、Chitinophaga和OPB56相對豐度占比較高，分別占到22.45%、13.20%、12.20%和6.88%；其中，Porphyrobacter相對豐度從15℃的7.04%，增加到30℃的34.23%；Brevundimonas和OPB56相對豐度變化總體趨勢則相反，在15～30℃下的占比變化范圍分別為5.27%～28.01%和1.63%～17.01%，而Chitinophaga在15℃和20℃下相對豐度不變，之后隨著溫度升高而降低，占比變化范圍是2.44%～21.64%. 在單細胞-小群體附生細菌群落核心物種中，Mariniradius、Porphyrobacter、Gemmobacter和Chitinophaga是優(yōu)勢屬，分別占物種總相對豐度的19.75%、13.99%、12.73%和11.71%；從15～30℃，Mariniradius呈先增后減的趨勢，在25℃下相對豐度達到最高，波動范圍為0.32%～30.49%，但在20℃到30℃下的變化相對穩(wěn)定，為30.49%～32.70%；Porphyrobacter相對豐度隨著溫度的升高而增加，占比變化范圍是3.38%～21.38%，而Chitinophaga則相反，相對豐度隨著溫度的升高而降低，在1.52%～31.10%范圍內(nèi)變化；Gemmobacter相對豐度在不同溫度下變化幅度相對較小，為11.04%～11.41%. 在游離細菌群落核心物種中，Mariniradius、Porphyrobacter、OPB56和unclassified Sphingobacteriales相對豐度最高，分別占到40.97%、13.43%、13.01%和11.26%.Mariniradius豐度整體隨著溫度升高而增加，但在20℃和25℃下的相對豐度占比相近，總體占比變化范圍為5.47%～63.44%；Porphyrobacter在20℃溫度時，相對豐度增加到最高值，隨后在25℃和30℃下較為穩(wěn)定，總體占比變化范圍是2.39%～15.45%；OPB56在15～30℃的變化下，相對豐度逐漸降低，占比在2.83%～26.73%范圍內(nèi)變化；unclassified Sphingobacteriales在20℃下豐度很低，總體呈先減后增的趨勢，占比變化范圍是9.20%～17.27%. 由結(jié)果可見，在微囊藻群體附生細菌群落中，Brevundimonas和OPB56的相對豐度在溫度20～30℃之間相對穩(wěn)定；在單細胞-小群體附生細菌群落中的核心優(yōu)勢菌屬中，Mariniradius相對豐度在20～30℃之間較為穩(wěn)定，且在4種溫度下Gemmobacter相對豐度均較為一致；在游離細菌群落中的核心優(yōu)勢菌屬，Porphyrobacter相對豐度在溫度20～30℃之間保持相對穩(wěn)定.

圖6 D2群體培養(yǎng)體系中不同粒徑包括微囊藻群體(>20 μm)附生細菌、單細胞-小群體(3～20 μm)附生細菌和游離(0.2～3 μm)細菌群落在15、20、25和30℃下屬水平的核心微生物組分析(去除藍藻序列)Fig.6 At genus level, analysis of core microbiomein bacterial communities attached with Microcystis colony (>20 μm), single cell-small colony (3-20 μm) and free-living (0.2-3 μm) bacterial community in colonial D2 culture systems at 15, 20, 25 and 30℃ (after removing cyanobacteria sequences)表1 D2群體培養(yǎng)體系中細菌群落在15、20、25和30℃下物種相關(guān)網(wǎng)絡(luò)特征參數(shù)(含藍藻序列)Tab.1 Key parameters of species-related network in bacterial community in colonial D2 culture systems at different temperatures (including cyanobacteria sequences)

2.4 銅綠微囊藻群體D2細菌群落在4種溫度下物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度分析

圖7顯示了在屬水平上，不同溫度下的D2群體培養(yǎng)體系中，藻-菌及菌-菌等細菌群落間的相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并在門水平上以不同顏色對節(jié)點進行區(qū)分，綠色連線表示正相關(guān)，紅色連線表示負相關(guān)，線越多，表示該物種與其他物種之間的聯(lián)系越密切. 在15℃下的物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)節(jié)點數(shù)雖然僅略高于25℃下的(表1)，但前者連線數(shù)最高，有296條連線，其中正相關(guān)155條，負相關(guān)141條，后者連線數(shù)最低，有166條顯著相關(guān)的邊，其中正相關(guān)131條，負相關(guān)35條；20℃和30℃下物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)節(jié)點數(shù)相等，均為49個，但30℃下網(wǎng)絡(luò)連線數(shù)有216條，其中正相關(guān)145條，負相關(guān)71條，而20℃下連接數(shù)有185條，其中正相關(guān)122條，負相關(guān)63條. 結(jié)果表明(表1)，在15℃和30℃下，不同粒徑細菌群落間的交流作用相對緊密，其次是20℃和25℃下的，且不同溫度下，D2群體物種間正負相關(guān)連線數(shù)比均大于1，說明當(dāng)溫度發(fā)生變化時，物種間的合作關(guān)系仍占主要地位；此外，25℃下D2群體物種間的連線數(shù)雖然是最少的，但正負相關(guān)連線數(shù)比是最高的，為3.74，而15℃則相反，細菌不同物種間聯(lián)系最為密切，但正負相關(guān)連線數(shù)比最低，為1.10，說明溫度升高促進了細菌之間的合作關(guān)系.

圖7 D2群體培養(yǎng)體系中細菌群落在15、20、25和30℃下物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度分析(包含藍藻序列)Fig.7 Complexity analysis of species-related network of bacteria communities in colonial D2 culture systems at 15, 20, 25 and 30℃(including cyanobacteria sequences)

在物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖中，一個物種節(jié)點(species-node)連接的節(jié)點數(shù)目越多，表示該節(jié)點的連通性(degree)越高，一個節(jié)點的連通性越高就意味著該節(jié)點的度中心性(degree centrality)越高，利用這種方法可找到Hub節(jié)點，確定關(guān)鍵物種(keystone taxa)[34]. 此外，緊密中心性(closeness centrality)和介數(shù)中心性(betweenness centrality)也能作為關(guān)鍵物種的確定條件[35]. 綜合高度中心性、高緊密中心性和低介數(shù)中心性這3個指標(biāo)(圖8)，本研究確定了D2群體細菌群落在不同溫度下相關(guān)網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵物種. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在15、20、25和30℃下，D2群體細菌群落相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵物種分別是Hydrogenophaga、FukuN57、Alphaproteobacteria和Sphingomonas(表2).

圖8 D2群體培養(yǎng)體系中細菌群落在15、20、25和30℃下物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)中心性分析(含藍藻序列,箭頭所示為關(guān)鍵物種)Fig.8 Centrality analysis of species-related network of bacterial communities in colonial D2 culture systems at 15, 20, 25 and 30℃ (including cyanobacteria sequences, the arrows showed the keystone taxa)

溫度節(jié)點數(shù)連線數(shù)正相關(guān)連線數(shù)負相關(guān)連線數(shù)正負相關(guān)連線數(shù)比15℃472961551411.1020℃49185122631.9425℃46166131353.7430℃49216145712.04

表2 D2群體培養(yǎng)體系中細菌群落在15、20、25和30℃下相關(guān)網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵物種分布情況(含藍藻序列)Tab.2 Key parameters of species-related network in bacterial community in colonial D2 culture systems at 15, 20, 25 and 30℃ (including cyanobacteria sequence)

3 討論

3.1 D2群體培養(yǎng)體系中不同粒徑中的細菌群落多樣性及組成受溫度影響的差異

水體環(huán)境條件(如溫度、營養(yǎng)鹽等)是影響細菌群落結(jié)構(gòu)的重要因素[36]，探討在不同環(huán)境條件下特定藻的藻際細菌群落組成變化，對于深入認識藻菌關(guān)系及其在藻類水華中的影響具有重要的意義. 本研究中銅綠微囊藻群體D2，從太湖分離得到后，在室內(nèi)培養(yǎng)條件下一直保持著很好的群體形態(tài)，從生長及聚集情況上來看，和野外暴發(fā)的水華藍藻狀態(tài)很相似(部分群體顆粒粒徑可超過100 μm)，可以作為野外水華藍藻與細菌關(guān)系研究的重要補充材料. 有研究發(fā)現(xiàn)，相比群體微囊藻，單細胞微囊藻附生細菌多樣性較低[37]，本研究則分析了D2群體在15、20、25和30℃下培養(yǎng)時，3種粒徑(>20、3～20、0.2～3 μm)中的細菌群落多樣性變化. 由于過濾體積較小，因此由濾膜堵塞造成的3種粒徑中細菌群落的重疊基本上可以忽略，且在使用20 μm濾膜時，選用的負壓較低(0.01 MPa)，所需的過濾時間也短(3～5 s)，不會打散微囊藻群體. 多樣性分析結(jié)果表明，在微囊藻群體附生細菌群落的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)在不同溫度下均沒有顯著性差異，而單細胞-小群體附生細菌群落的PD多樣性指數(shù)和游離細菌群落的Shannon指數(shù)，在15℃下分別均顯著高于25℃和30℃下的，說明單細胞-小群體附生和游離的細菌群落在溫度較低時組成更為多樣.

微囊藻群體附生細菌的群落組成與游離細菌群落組成不同，不同大小的微囊藻群體附生細菌的群落組成也具有差異性[38]. PERMANOVA分析表明，溫度能分別單獨解釋微囊藻群體附生、單細胞-小群體附生和游離細菌群落組成總體差異的44.38%、45.97%和65.35%，說明溫度對細菌群落組成的影響隨群體粒徑的增加而減弱，即相比附著在大群體上的細菌群落對溫度變化的響應(yīng)，游離菌對溫度變化的響應(yīng)更為強烈. PERMANOVA分析揭示，粒徑大小能分別單獨解釋15、20、25和30℃下樣本群落組成總體差異的60.87%、37.29%、35.74%和48.22%，表明同一溫度下，粒徑大小對細菌群落組成的影響程度也具有差異性，差異性從低到高依次是：25℃<20℃<30℃<15℃. 這說明在較高溫度(30℃)和較低溫度(15℃)下，不同粒徑細菌群落組成差異增大，表明溫度影響了附生細菌與游離細菌群落組成之間的交流.

Shi等[18]發(fā)現(xiàn)Sphingomonadales是微囊藻附生細菌中常見的一類，該目下物種的典型特征是能產(chǎn)出鞘磷脂(glycosphingolipids，GSLs)[39]，而GSLs是在細菌的外膜上，具有類似于脂多糖功能的物質(zhì)[40]，在微囊藻群體附生細菌群落中，Sphingomonadales相對豐度最高，其分泌的鞘磷脂可能也在群體維持中發(fā)揮作用，此外Sphingomonadales相對豐度在30℃下最高，說明高溫下更利于該菌在微囊藻藻際中生長. 其次是Caulobacterales，據(jù)文獻報道[41]，Caulobacterales能夠在海洋或者淡水環(huán)境下，產(chǎn)生粘附素(holdfast adhesin). 在微囊藻群體附生細菌群落中，Caulobacterales相對豐度在15℃下最高，其它3個溫度下總體相對穩(wěn)定，這也解釋了15℃下D2能較好保持群體形態(tài)，可能與產(chǎn)生粘附素的細菌增加有關(guān). 研究表明Sphingobacteriales對N、P營養(yǎng)元素變化非常敏感[42-43]. 另一個可能與固氮過程有關(guān)的Pseudomonadales[44]在單細胞-小群體附生細菌群落中相對豐度很高，其相對豐度除在15℃下較高，在另外3個溫度下基本保持穩(wěn)定. 這意味著與該菌有關(guān)的N、P營養(yǎng)元素的利用率可能也受到溫度的影響. 在單細胞-小群體附生和游離細菌群落中，Cytophagales相對豐度分別位于第二和第一，分別占15.65%和33.44%，而且在這2種粒徑的細菌群落組成受不同溫度影響的整體變化趨勢相同：15℃下相對豐度保持在較低水平，20℃和25℃下持續(xù)增加，直至在30℃下相對豐度最高. Cytophagales是能夠溶解藍藻細胞的一類細菌[45-46]，說明隨著溫度升高，該菌在裂解轉(zhuǎn)化部分死亡藍藻中起到重要的作用，從而可能加速了營養(yǎng)鹽的循環(huán)，更有利于藍藻的生長. 在野外發(fā)生藍藻水華的湖泊水柱下部(水深25 cm處)，Chlorobiales這一類硫化細菌[47-48]的相對豐度最高[49]，本研究發(fā)現(xiàn)，Chlorobiales只在游離細菌群落中相對豐度較高，并且其豐度隨溫度升高而降低，說明此類菌可能在藻釋放到水體的胞外產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化中起到重要作用.

3.2 D2群培養(yǎng)體系中不同粒徑細菌群落在4種溫度下核心微生物多樣性差異

Kim等[50]發(fā)現(xiàn)，對比初始野外微囊藻樣品細菌群落組成，在室內(nèi)繼代培養(yǎng)一年后的微囊藻培養(yǎng)體系細菌群落中，Brevundimonas和Pseudomonas成為與銅綠微囊藻建立長期共生關(guān)系的優(yōu)勢菌種，能夠促進銅綠微囊藻的生長，這與本研究結(jié)果相一致.Porphyrobacter在微囊藻群體附生細菌群落中的相對豐度最高，說明Porphyrobacter可能是具有促進微囊藻群體生長作用的一類特殊細菌[10]. 但值得注意的是，Porphyrobacter在3種粒徑下，相對豐度在20～30℃時都比15℃要高，且20～30℃時，其相對豐度在游離細菌群落中不再有較大變化，這表明較高溫度可能更有利于Porphyrobacter的生長，Hanada等也曾從溫泉中分離出該屬一個新的嗜熱細菌[51]. 在4種溫度下，Brevundimonas均只存在于微囊藻群體附生細菌群落中，其相對豐度在15℃下最高，20～30℃時降低且在該溫度范圍內(nèi)基本保持穩(wěn)定，表明該菌可能在低溫下的微囊藻群體生長中起到重要作用. 而在微囊藻群體附生細菌群落中，Porphyrobacter相對豐度最高，其次是Brevundimonas，這一點與Kim等[50]的報道有所不同，可能是由于藻種不同所產(chǎn)生的差異. Bhumika等[52]在2013年發(fā)現(xiàn)Cyclobacteriaceae科里一個新屬——Mariniradius. 本研究發(fā)現(xiàn)Mariniradius只存在于單細胞-小群體附生和游離細菌群落的核心物種中，且在20～30℃相對豐度很高并相對穩(wěn)定，同時只包含SaccharolyticusAK6一個種，該菌可能與高溫下D2群體與單細胞微囊藻之間的轉(zhuǎn)變過程中有關(guān). 此外，在單細胞-小群體附生細菌的核心優(yōu)勢菌屬中，Gemmobacter相對豐度在4種溫度下均較為平穩(wěn)，作為重要的反硝化細菌[53]，Shi等[54]發(fā)現(xiàn)該屬細菌與碳分解有關(guān)，當(dāng)在高大氣CO2濃度條件下，富營養(yǎng)化水體中的Gemmobacter相對豐度也會升高，這類細菌對溫度變化不敏感，能穩(wěn)定存在單細胞-小群體附生細菌群落中，表明其作為核心優(yōu)勢菌屬，對群落碳氮等物質(zhì)循環(huán)可能發(fā)揮著重要作用.

3.3 D2群體培養(yǎng)體系中細菌群落在4種溫度下物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度分析

Zhao等[55]通過全年調(diào)查6個城市淡水湖泊并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，其浮游細菌群落網(wǎng)絡(luò)會隨季節(jié)的變化存在明顯的差異，而溫度是影響藍藻菌群的重要因素之一. Lin等[56]對太湖水體細菌群落進行了網(wǎng)絡(luò)分析研究，發(fā)現(xiàn)野外不同季節(jié)細菌群落之間的相互作用存在顯著差異，秋季細菌網(wǎng)絡(luò)是最大和最復(fù)雜的，而春季細菌相關(guān)網(wǎng)絡(luò)是最簡單的. 但不同的是，Jiao等[57]發(fā)現(xiàn)浮游細菌群落網(wǎng)絡(luò)在冬季具有較高的復(fù)雜性，形成了高度穩(wěn)定的群落結(jié)構(gòu)，Kara等[58]調(diào)查富營養(yǎng)化淡水湖的浮游細菌群落十年間季節(jié)動態(tài)和共生現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)春季條件類群豐度會減少，但總體上導(dǎo)致類群(特別是豐度最高的類群)間有更密切的聯(lián)系. 本研究通過模擬溫度變化，發(fā)現(xiàn)15℃下的細菌群落組成最為復(fù)雜，其次是30℃下的，說明低溫(15℃)和高溫(30℃)有利于加強細菌之間的聯(lián)系. 盡管溫度發(fā)生變化，但物種間的合作關(guān)系仍占主要地位，本研究發(fā)現(xiàn)，25℃下細菌之間的連線數(shù)雖然最少，但正負相關(guān)連線數(shù)比是最高的，而15℃下細菌物種間聯(lián)系最為密切，但正負相關(guān)連線數(shù)比是最低的，說明溫度升高促進了細菌之間的合作關(guān)系，細菌之間合作關(guān)系的增加可能促進營養(yǎng)鹽循環(huán)，從而有利于藍藻水華的發(fā)生.

4 結(jié)論

1)溫度顯著影響微囊藻群體附生細菌、單細胞-小群體附生細菌和游離細菌群落組成，單細胞-小群體附生細菌群落和游離細菌群落在溫度較低時，組成更為多樣.

2)從不同粒徑下的優(yōu)勢菌目，對溫度的響應(yīng)來看：Sphingobacteriales在微囊藻群體附生細菌群落、單細胞-小群體附生細菌群落和游離細菌群落中均具有相對穩(wěn)定性；當(dāng)溫度在20～30℃間變化時，Caulobacterales和Pseudomonadales相對豐度分別在微囊藻群體附生細菌群落和單細胞-小群體附生細菌群落中保持穩(wěn)定.

3)微囊藻群體附生細菌的核心優(yōu)勢菌屬Brevundimonas和OPB56的相對豐度在溫度20～30℃之間相對穩(wěn)定；單細胞-小群體附生細菌群落中的核心優(yōu)勢菌屬Mariniradius相對豐度也是在該溫度范圍也較為穩(wěn)定，而Gemmobacter相對豐度在4種溫度下均較為一致；游離細菌群落的核心優(yōu)勢菌屬Porphyrobacter的相對豐度在溫度20～30℃之間相對穩(wěn)定.

4)溫度影響微囊藻群體培養(yǎng)體系中細菌群落物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜度，影響細菌之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)和關(guān)鍵物種組成，溫度升高促進了物種間的合作關(guān)系.