劉瀟文， 陳潤臣， 徐 晨， 王鴻磊， 王紅艷， 丁 強

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙臺研究院， 山東 煙臺 264670)

0 引言

【研究意義】野生食用菌具有極高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值，越來越受到人們的重視。目前大多數(shù)野生食用菌主要依賴于野外采集，隨著野生食用菌需求量的逐年增加，造成野生菌的過度開采，嚴重破壞生態(tài)環(huán)境[1-3]，故野生菌人工馴化勢在必行。【前人研究進展】高大環(huán)柄菇(Macrolepiotaprocera)也稱為高腳環(huán)柄菇、高柄環(huán)菇、棉花菇等，國外別稱陽傘蘑菇，屬于擔(dān)子菌門層菌綱傘菌目蘑菇科大環(huán)柄菇屬。其子實體較大，最高可達30～40 cm，廣泛分布于溫帶地區(qū)[4-6]。高大環(huán)柄菇質(zhì)地脆嫩、味道鮮美、營養(yǎng)豐富，人體必需氨基酸含量高，是一種很有開發(fā)前景的野生食用菌[7]。在歐洲高大環(huán)柄菇是一種很受歡迎的食用菌，在國內(nèi)僅有零星栽培報導(dǎo)[8-10]?！狙芯壳腥朦c】目前對高大環(huán)柄菇的子實體形態(tài)特征、菌種生物學(xué)性質(zhì)、栽培特性等缺乏系統(tǒng)研究，且尚無大規(guī)模人工栽培的記錄。關(guān)于其他方面的報道也甚少[11]，偶有關(guān)于菌絲生長條件的相關(guān)研究，其研究方面也不甚全面，對于大規(guī)模栽培而言參考不夠[12]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用形態(tài)學(xué)和分子學(xué)相結(jié)合的方法對2016年9月采集的1株高大環(huán)柄菇屬真菌子實體進行鑒定，采用單因素試驗，以菌絲生長量為指標(biāo)研究其生物學(xué)特性，在此基礎(chǔ)上進行仿野生栽培，以期為豐富山東省食用菌栽培品種，實現(xiàn)高大環(huán)柄菇的人工栽培提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 2016年9月采集于煙臺市高新區(qū)林地內(nèi)，于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院食用菌實驗室分離保藏，編號為EF-5。

1.1.2 試劑 大豆蛋白胨、蛋白胨、酵母膏、土豆浸粉、胰蛋白胨、(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、KNO3、紅糖、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、糖蜜、纖維素、KH2PO4、K2HPO4、CaSO4、K2SO4、MgSO4、MnSO4、Na2SO4、ZnSO4、FeSO4和NaCl等，市購。

1.1.3 其他 ITS通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)，購于生工生物工程(上海)股份有限公司；土豆浸粉、瓊脂、麥粒、麩皮、木屑、玉米芯及石灰，市購。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備

1) 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)。采用土豆浸粉10 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL制備。

2) 馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB培養(yǎng)基)。采用土豆浸粉10 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL制備。

3) 氮源培養(yǎng)基。采用蔗糖20 g，MgSO40.5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL制作基礎(chǔ)培養(yǎng)基，然后分別添加1%的大豆蛋白胨、蛋白胨、酵母膏、土豆浸粉、胰蛋白胨和0.5%的硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、硝酸鉀等制成不同氮源培養(yǎng)基備用。

4) 碳源培養(yǎng)基。采用土豆浸粉10 g，MgSO40.5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL制作基礎(chǔ)培養(yǎng)基，然后分別添加2%的紅糖、可溶性淀粉、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、糖蜜、纖維素和蔗糖等制成不同碳源培養(yǎng)基備用。

5) 無機鹽培養(yǎng)基。采用糖蜜20 g，土豆浸粉10 g，瓊脂20 g，水1 000 mL制作基礎(chǔ)培養(yǎng)基，然后分別添加0.1%的KH2PO4、K2HPO4、CaSO4、K2SO4、MgSO4、MnSO4、Na2SO4、ZnSO4、FeSO4和NaCl等制成不同無機鹽培養(yǎng)基備用，以不加無機鹽的培養(yǎng)基做對照。

6) 二級種培養(yǎng)基。采用麥粒90%、麩皮10%制備。

7) 栽培培養(yǎng)基。參照文獻[13]的方法采用木屑50%、玉米芯38%、麩皮10%、石灰2%配制栽培培養(yǎng)基，含水量65%。

1.2.2 菌株鑒定

1) 形態(tài)學(xué)觀察和菌種分離。參照文獻[12-14]的方法，于煙臺市高新區(qū)林地內(nèi)發(fā)現(xiàn)高大環(huán)柄菇子實體1個，拍攝子實體、菌褶等照片。采集子實體，取菌蓋和菌柄連接處的菌肉組織，接種于PDA培養(yǎng)基平板上，24℃培養(yǎng)得到高大環(huán)柄菇菌種。

2) 分子生物學(xué)鑒定。參照文獻[15-20]的方法，將高大環(huán)柄菇菌種接種至PDB培養(yǎng)基中，150 r/min，24℃培養(yǎng)10 d。取適量菌絲體液氮研磨，利用CTAB法提取基因組DNA，再利用真菌ITS通用引物ITS1和ITS4擴增高大環(huán)柄菇基因組ITS序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送生工生物(上海)股份有限公司進行測序。采用NCBI的BLAST比對真菌PCR擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果，獲取相似性較高的菌株，用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 生物學(xué)特性觀察及指標(biāo)測定 參照文獻[15-17]的方法研究菌株的生物學(xué)性質(zhì)。

1)菌落和菌絲形態(tài)特征。將高大環(huán)柄菇菌種接種至PDA培養(yǎng)基平板上，24℃培養(yǎng)6 d后觀察菌落形態(tài)特征并拍照。另將高大環(huán)柄菇菌種接種至PDA培養(yǎng)基平板上，在距接種塊1.5 cm處斜插1片蓋玻片，24℃培養(yǎng)5 d。取1片潔凈載玻片，滴1滴美蘭染色液，將蓋玻片有菌絲一面蓋到染色液處，顯微鏡觀察菌絲形態(tài)特征。

2) 菌絲生長溫度。菌絲培養(yǎng)溫度設(shè)7個處理，即5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃。用Φ8 mm打孔器打取菌落邊緣的菌絲塊，接種于PDA培養(yǎng)基平板表面，然后置于不同溫度下培養(yǎng)。培養(yǎng)8 d測量菌落直徑，計算菌絲生長量(下同)。

菌絲生長量=(菌落直徑-接種塊直徑)/2。

3) 菌絲生長pH。根據(jù)菌絲培養(yǎng)pH不同，設(shè)8個處理，即pH為4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。按試驗要求制備相應(yīng)pH的PDA培養(yǎng)基平板，用Φ8 mm打孔器打取菌落邊緣的菌絲塊，接種于不同pH的PDA平板中央，24℃培養(yǎng)8 d，測量菌落直徑，計算菌絲生長量。

4) 菌絲生長氮源。按照添加氮源不同，設(shè)9個處理，每種氮源1個處理，即大豆蛋白胨、蛋白胨、酵母膏、土豆浸粉、胰蛋白胨和硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、硝酸鉀等。用Φ8 mm打孔器打取菌落邊緣的菌絲塊，分別接種于各氮源培養(yǎng)基表面，25℃培養(yǎng)8 d，測量菌落直徑并計算菌絲生長量。

5) 菌絲生長碳源。按照添加碳源不同，設(shè)8個處理，每種碳源1個處理，即紅糖、可溶性淀粉、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、糖蜜、纖維素和蔗糖等。菌絲接種、培養(yǎng)及測定方法同上。

6) 菌絲生長無機鹽。按照添加無機鹽不同，設(shè)10個處理，每種無機鹽1個處理，即KH2PO4、K2HPO4、CaSO4、K2SO4、MgSO4、MnSO4、Na2SO4、ZnSO4、FeSO4和NaCl等，以不加無機鹽為對照。菌絲接種、培養(yǎng)及測定方法同上。

1.2.4 栽培試驗 將高大環(huán)柄菇菌母種接種至二級種培養(yǎng)基中，24℃培養(yǎng)直至長滿。取二級種接種到栽培培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至長滿菌袋。將菌袋脫去，埋入毛櫻桃林內(nèi)進行仿野生栽培。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用R語言對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析及繪圖，利用MEGA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 高大環(huán)柄菇的形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定 從圖1看出，高大環(huán)柄菇子實體近白色，菌蓋直徑約8.5 cm，上覆有棕褐色鱗片，呈同心圓狀排列，中央乳頭狀凸起，褐色。菌柄中生，長8.2 cm，直徑0.8 cm，棕黃色，較細長，較韌，上有雙層移動菌環(huán)。菌褶近白色，不等長，靠外緣處曲折，其余部分平直，離生，孢子印白色。菌落不規(guī)則圓形，灰白色。菌絲多分枝，具鎖狀聯(lián)合。

注：A子實體，B菌蓋正面，C菌環(huán)，D菌褶，E菌落，F(xiàn)菌絲和鎖狀聯(lián)合。

2.1.2 分子生物學(xué)鑒定 該真菌PCR擴增產(chǎn)物約700 bp，登陸NCBI，用BLAST程序比對測序結(jié)果，獲取相似性較高的高大環(huán)柄菇30654(Macrolepiotaprocera30654)、白大環(huán)柄菇 YSU-1(MacrolepiotapuellarisYSU-1)、長柄大環(huán)柄菇 MFLU121764(MacrolepiotadolichaulaMFLU121764)等菌株，構(gòu)建獲得系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，該菌株(EF-5)與高大環(huán)柄菇菌株30654遺傳距離達99%，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征鑒定其為高大環(huán)柄菇(Macrolepiotaprocera)。

圖2 高大環(huán)柄菇EF-5系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 高大環(huán)柄菇的生物學(xué)特征

從圖3看出，不同生長條件對菌絲生長的影響存在差異。

2.2.1 溫度 隨著培養(yǎng)溫度升高，高大環(huán)柄菇菌株EF-5的菌絲生長量呈先升后降趨勢，培養(yǎng)8 d后菌絲生長量為0.275 0～29.925 0 mm，表現(xiàn)為25℃>30℃>20℃>35℃>15℃>10℃>5℃。當(dāng)培養(yǎng)溫度低于15℃時菌絲生長量緩慢增加；當(dāng)培養(yǎng)溫度超過15℃時菌絲生長量迅速提高；當(dāng)溫度達25℃時菌絲生長量達最高，為29.925 0 mm；繼續(xù)提高培養(yǎng)溫度，菌絲生長量呈下降趨勢，當(dāng)溫度增至35℃時，菌絲仍能生長，但生長很慢。

2.2.2 pH 高大環(huán)柄菇菌株EF-5菌絲生長pH范圍較寬，pH 4.5～11.0均能生長，隨著環(huán)境pH增加，高大環(huán)柄菇菌絲生長量呈先升后降趨勢，菌絲生長量為16.060 0～31.678 3 mm，表現(xiàn)為pH8.0>pH9.0>pH7.0>pH10.0>pH6.0>pH5.0>pH11.0>pH4.5。當(dāng)pH<8.0時，菌絲生長量呈上升趨勢；當(dāng)pH 8.0時，菌絲生長量達最大；當(dāng)pH>8.0時，菌絲生長量呈下降趨勢。

2.2.3 氮源 高大環(huán)柄菇菌株EF-5在無機氮源和有機氮源培養(yǎng)基上均可生長，菌絲生長量為9.926 7～33.441 7 mm，表現(xiàn)為土豆浸粉>大豆蛋白胨>酵母膏>胰蛋白胨>蛋白胨>硫酸銨>硝酸鉀>氯化銨>硝酸銨。菌絲對有機氮源的利用明顯好于無機氮源。其中，菌絲在以土豆浸粉為氮源的培養(yǎng)基上生長最快，菌絲生長量為33.441 7 mm，顯著高于除大豆蛋白胨和酵母膏處理外的其余處理；大豆蛋白胨與酵母膏處理菌絲生長量分別為31.605 0 mm和30.456 7 mm，差異不顯著，但均顯著高于除胰蛋白胨和蛋白胨處理外的其余處理；硝酸銨處理菌絲生長最慢，顯著低于除氯化銨處理外的其余處理。

注：圖中不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

2.2.4 碳源 碳源可為高大環(huán)柄菇EF-5菌絲生長提供碳元素和能量，是菌絲生長需求量最大的營養(yǎng)物質(zhì)。高大環(huán)柄菇菌株EF-5菌絲在各種碳源培養(yǎng)基上均能生長，其菌絲生長量為16.038 3～32.206 7 mm，表現(xiàn)為糖蜜>葡萄糖>麥芽糖>纖維素>可溶性淀粉>紅糖>蔗糖>乳糖。其中，以糖蜜作為碳源時的菌絲生長量最高，與其余7種碳源間差異顯著，為高大環(huán)柄菇EF-5菌絲生長最佳碳源；葡萄糖和麥芽糖其次，菌絲生長量分別為32.206 7 mm和31.586 7 mm，均顯著高于除糖蜜處理外的其余碳源處理；菌絲在以乳糖為碳源的培養(yǎng)基上生長最慢，顯著低于其余碳源處理。

2.2.5 無機鹽 無機鹽具有維持細胞滲透壓、保持細胞內(nèi)酶活性等重要物質(zhì)，是微生物生長必須的營養(yǎng)元素。高大環(huán)柄菇菌株EF-5菌絲在各種無機鹽培養(yǎng)基上均能生長，其菌絲生長量為27.377 5～34.530 0 mm，表現(xiàn)為MnSO4>CaSO4>K2SO4>FeSO4>K2HPO4>Na2SO4>NaCl>CK>ZnSO4>KH2PO4>MgSO4。10種無機鹽中，MnSO4、CaSO4、K2SO4、FeSO4和K2HPO4具有明顯的促進菌絲生長的作用，其相互間差異不顯著，但MnSO4、CaSO4和K2SO4處理菌絲生長量顯著高于除FeSO4和K2HPO4外的其余處理；FeSO4和K2HPO4處理菌絲生長量顯著高于除Na2SO4外的其余處理；Na2SO4處理菌絲生長量顯著高于MgSO4處理，但與其余處理差異不顯著；其余處理間差異不顯著。在促進菌絲生長的5種無機鹽中，以硫酸錳的菌絲生長量最大，菌絲最為濃密，為高大環(huán)柄菇EF-5菌絲生長最佳無機鹽。

2.3 仿野生栽培

從圖4看出，將高大環(huán)柄菇EF-5母種接種到二級種培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)大約60 d菌絲長滿菌種瓶。將二級種接種到栽培料，第2天菌種即萌發(fā)，第8天基本封面，經(jīng)66 d培養(yǎng)基本長滿栽培袋，繼續(xù)培養(yǎng)14 d進行后熟。脫袋后埋入毛櫻桃林中，61 d開始陸續(xù)現(xiàn)蕾，菇蕾初為球形，后菌蓋與膨大的菌柄基部逐漸分離，菌柄拉長將菌蓋托起。當(dāng)菌柄伸長，菌蓋尚未展開時采收。栽培狀態(tài)下的高大環(huán)柄菇EF-5可長至22 cm長，單個菇重超過100 g。

注：A為二級種，B為長滿的栽培袋，C田間栽培(埋入地下)，D菇蕾，E幼菇，F(xiàn)采摘的成熟菇。

3 討論

探索了高大環(huán)柄菇EF-5菌株子實體形態(tài)特征和生長條件，并通過仿野生栽培成功獲得了子實體。該研究篩選出的最佳溫度、氮源及發(fā)菌時間等與前人結(jié)果均有差別，究其原因是不同地區(qū)的氣候、土壤不同或菌種的特性不同所致。

高大環(huán)柄菇屬于新興食用菌，相關(guān)研究剛起步，很多生物學(xué)性質(zhì)并不清楚。該研究雖然成功獲得子實體，但也發(fā)現(xiàn)在試驗栽培過程中仍存在很多問題。首先，二級種生長緩慢。高大環(huán)柄菇二級種的培養(yǎng)時間長達60 d(750 mL菌種瓶)，遠長于平菇、香菇等食用菌，且菌種培養(yǎng)后期產(chǎn)生大量黃水。其次，栽培周期長。高大環(huán)柄菇接種至栽培料到菌絲成熟需要80 d，覆土至現(xiàn)蕾需要61 d，從接種到現(xiàn)蕾的時間長達141 d，遠遠超過常規(guī)栽培的食用菌品種。第三，出菇條件不清楚，產(chǎn)量低。經(jīng)過1年的試驗，在實驗室無法獲得子實體，經(jīng)仿野生栽培雖然獲得子實體，但總產(chǎn)量較低。由于存在以上幾方面的問題，高大環(huán)柄菇大規(guī)模人工栽培尚需時日。今后需進一步對二級種培養(yǎng)基和栽培培養(yǎng)基進行優(yōu)化，以縮短栽培時間提高產(chǎn)量；同時，需要研究高大環(huán)柄菇的出菇條件和采摘條件，以實現(xiàn)工廠化可控栽培。

4 結(jié)論

對采自野外的1株大環(huán)柄菇屬真菌(編號EF-5)通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，最終確定其為高大環(huán)柄菇。其菌絲生長最佳條件：氮源為土豆浸粉，碳源為糖蜜，生長溫度為25℃，生長pH為8，無機鹽為硫酸錳。此真菌菌種在麥粒二級種培養(yǎng)基上的生長時間為60 d，接種栽培料后66 d長滿菌袋，經(jīng)仿野生栽培成功收獲子實體。