安星宇， 朱守殿， 黃 露， 吳石平*， 陳小均， 李 淳

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所， 貴州 貴陽 550006；2.黔東南州農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心， 貴州 凱里 556000)

0 引言

【研究意義】南瓜隸屬于葫蘆科南瓜屬，又稱金瓜、番瓜等，是我國最為常見的農(nóng)作物之一，含有人體所需的多種營養(yǎng)成分，對維持人體健康具有重要作用[1]。近年來，隨著南瓜飲料、南瓜籽等南瓜衍生產(chǎn)品越來越受到消費者的歡迎，南瓜的種植面積呈逐年增長勢頭。目前，我國已成為世界第一大南瓜生產(chǎn)國以及主要的消費國[2]。然而，隨著南瓜種植面積的不斷增加，各種病害也在各種植園區(qū)大量爆發(fā)，給廣大種植戶造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。南瓜炭疽病作為主要病害，在南瓜各生長期均可發(fā)生，主要影響果實，其次影響南瓜葉片、葉柄和莖干，一般情況下減產(chǎn)5%～20%，嚴(yán)重時甚至?xí)霈F(xiàn)絕收的情況[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來。研究人員已對多種葫蘆科作物進(jìn)行了研究，并成功分離鑒定出多種炭疽病菌，肖敏等[4]鑒定出海南省黃瓜炭疽病的病原為平頭炭疽菌(C.truncatum)，唐爽爽等[5]鑒定出遼寧省西瓜炭疽病的病原為膠孢炭疽菌(C.gloeosporioide)，黃婷等[6]鑒定出南昌市甜瓜炭疽病的病原為瓜炭疽菌(C.orbiculare)，然而對于貴州的南瓜炭疽病病原鑒定尚未有研究報道?！狙芯壳腥朦c】近年來，隨著織金縣調(diào)整農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，大力發(fā)展南瓜產(chǎn)業(yè)，總種植面積已超過1萬hm2，南瓜炭疽病的發(fā)生面積以及危害程度也隨之逐漸加重，因而有必要對當(dāng)?shù)啬瞎咸烤也∵M(jìn)行病原鑒定，并篩選出能夠有效防治該病菌的藥劑?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對織金縣南瓜種植區(qū)的炭疽病病樣進(jìn)行分離鑒定，明確當(dāng)?shù)啬瞎咸烤也〉牟≡⒃谑覂?nèi)篩選出對南瓜炭疽病病原菌防效較好的殺菌劑，為南瓜炭疽病的科學(xué)防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 南瓜病樣 采集于織金縣南瓜種植區(qū)，存放于4℃冰箱。

1.1.2 培養(yǎng)基 水瓊脂(WA)培養(yǎng)基：瓊脂粉15 g，水1 L，自然PH，121℃下滅菌20 min，倒入滅過菌的培養(yǎng)皿中，備用；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖18 g，瓊脂粉18 g，水1 L，自然PH，121℃下滅菌20 min，最后倒入滅過菌的培養(yǎng)皿中，備用。

1.1.3 引物 依據(jù)前人的研究[7]，合成引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)/ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)、ACT-512F(5′-ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC-3′)/ACT-783R(5′-TACGAGTCCTTCTGGCCCAT-3′)、GAPDH-F(5′-GCCGTCAACGACCCCTTCATTGA-3′)/GAPDH-R(5′-GGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT-3′)。

1.1.4 藥劑 市場上常見的8種殺菌劑：60%唑醚·代森聯(lián) WG，巴斯夫(中國)有限公司；10%苯醚甲環(huán)唑 WG，利民化學(xué)有限責(zé)任公司；30%肟菌酯 SC，杭州宇龍化工有限公司；1%申嗪霉素 SC，上海農(nóng)樂生物制品股份有限公司；450 g/L咪鮮胺 EW，福建新農(nóng)大正生物工程有限公司；70%丙森鋅 WP，拜耳(中國)有限公司；22.5%啶氧菌酯 SC，杜邦中國集團(tuán)有限公司；50%嘧菌酯 WG，江陰蘇利化學(xué)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分離病原 參照黃露等[8]的分離方法，在顯微鏡下，挑取病樣上的分生孢子器置于滅菌水中，用力壓碎后，制成孢子懸浮液，然后用移液槍吸取孢子懸浮液到水瓊脂培養(yǎng)基上涂布。2 d后，通過顯微觀察，將已經(jīng)萌發(fā)的孢子轉(zhuǎn)移至PDA培養(yǎng)基上，密封后置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，最后進(jìn)行純化，并分別保存于4℃及-80℃冰箱中。

1.2.2 致病性鑒定 按照科赫式法則，將分離純化后的病原菌進(jìn)行回接，觀測是否出現(xiàn)相同的發(fā)病癥狀。首先將待測菌株在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，在菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌塊，并打取空白的培養(yǎng)基；用無菌水將健康的南瓜清洗干凈，將菌塊的菌絲面朝下，貼于南瓜上的接種點，相同方法接種空白PDA作為對照。26℃保濕培養(yǎng)，每天觀察發(fā)病癥狀，并對發(fā)病部分進(jìn)行分離培養(yǎng)，再次進(jìn)行病原鑒定。

1.2.3 病原菌的鑒定 通過CTAB法提取菌株DNA。分別使用引物對rDNA的ITS、CAT、GAPDH序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂凝膠電泳檢測后，送至北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行序列測定。參照崔曉霞等[9]的分析方法，對分離純化菌株及參考模式菌株的ITS基因序列進(jìn)行編輯，采用MEGA 7.0以鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建與聚類分析。將比較結(jié)果與病原菌的形態(tài)特征結(jié)合，對病原菌進(jìn)行分析與鑒定。

1.2.4 室內(nèi)藥劑篩選 參考李樹江等[10]的方法，以市場上常見的8種殺菌劑進(jìn)行藥劑篩選，設(shè)8個處理，每種藥劑1個處理，T1～T8處理分別為60%唑醚·代森聯(lián)WG、10%苯醚甲環(huán)唑WG、30%肟菌酯SC、1%申嗪霉素SC、450 g/L咪鮮胺EW、70%丙森鋅WP、22.5%啶氧菌酯SC、50%嘧菌酯WG。將各藥劑加入到已滅菌的PDA中混勻，配制成4 000倍液的藥劑培養(yǎng)基，倒入培養(yǎng)皿中，以不含藥劑的PDA為對照，每個處理3次重復(fù)。用打孔器在培養(yǎng)6 d后的菌株菌落邊緣打取直徑為5 mm的小菌塊，將菌絲面朝下接種到含藥平板和對照平板中央，用封口膜密封后，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，采用十字交叉法測定不同處理的菌落直徑，計算抑菌率，并通過DPS對殺菌劑的抑菌效果進(jìn)行差異顯著性分析。

抑菌率=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-菌塊直徑)]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離純化及形態(tài)觀察

由圖1顯示，南瓜病樣上的病斑為圓形或橢圓形，壞死區(qū)為黑色，當(dāng)濕度較高時，黑色病斑上出現(xiàn)大量白色菌絲。通過單孢分離法對南瓜炭疽病病樣進(jìn)行病菌分離，得到N-1和N-2共2個菌株。其分生孢子為單孢子，沒有隔膜、壁光滑，橢圓形或腎形，直或稍彎曲，兩端為鈍圓，大小一般為(4～7)μm×(12～23)μm，其形態(tài)與DU等[11]從百香果炭疽病病樣分離到的Colletotrichumbrevisporum相似，因而初步鑒定該病菌為C.brevisporum。

注：A為發(fā)病癥狀；B為產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)；C為分生孢子(標(biāo)尺為20 μm)。

2.2 分離菌株的致病性鑒定

人工離體接菌后南瓜的發(fā)病癥狀與自然發(fā)病癥狀基本一致，首先在接種處出現(xiàn)水漬狀斑點，后變成暗褐色凹陷斑，逐漸擴(kuò)大形成暗褐色的圓形或橢圓形病斑，中心壞死區(qū)為黑色，且黑色病斑上有大量白色菌絲，而對照則不發(fā)病(圖2)。對發(fā)病組織進(jìn)行病原菌分離，得到與接種前形態(tài)一致的病原菌，表明，菌株N-1和菌株N-2確實為引起南瓜炭疽病的病原菌。

注：A為離體接種發(fā)病癥狀；B為對照。

2.3 分離菌株的分子鑒定

從圖3看出，菌株N-1和菌株N-2的總DNA通過引物ITS1/4、CAT-512F/783R和GAPDH-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到長度約為500 bp的ITS片段、長度約為250 bp的ACT和GADPH片段。在NCBI數(shù)據(jù)庫上對擴(kuò)增產(chǎn)物序列進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，分離得到的菌株為炭疽菌屬(Colletotrichum)真菌，因而選用11個炭疽菌菌株使用MEGA 7.0采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。從南瓜病樣上分離得到的病菌菌株N-1和菌株N-2與C.brevisporum菌株GM1、CPDZ21、COUFAL7300及UACH289聚在一起，支持率為100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，確定引起織金縣南瓜炭疽病的病原為C.brevisporum。

注：A為rDNA-ITS PCR擴(kuò)增電泳圖；B為ACT PCR擴(kuò)增電泳圖；C為GAPDH PCR擴(kuò)增電泳圖譜。

圖4 基于ITS、ACT及GADPH序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 不同殺菌劑對南瓜炭疽病菌的抑制效果

由表1可知，8種殺菌劑均對南瓜炭疽病有一定的抑制作用，但不同藥劑之間存在差異。南瓜炭疽病菌在8種殺菌劑4 000倍液藥劑培養(yǎng)基上的菌落直徑為9.5～42.5 mm，均較CK(57.7 mm)小，其中，T1、T2及T5的菌落直徑在10.0 mm左右，明顯低于其余藥劑處理和CK；8種藥劑處理的抑菌率為28.8%～91.5%，其中，T1、T2及T5的抑菌率均超過88.0%，抑制效果極顯著高于其余5種藥劑處理，三者間差異不顯著；其次為T3(60.2%)和T8(58.8%)，二者差異不顯著，但T3極顯著高于T7、T6和T4，T8顯著高于T7，極顯著高于T6和T4；T7(49.1%)和T6(44%)差異不顯著，但均極顯著高于T4；T4的抑制效果最差，僅為28.8%。表明，60%唑醚·代森聯(lián)WG、10%苯醚甲環(huán)唑WG以及450 g/L咪鮮胺EW是防治南瓜炭疽病較好的化學(xué)藥劑。

表1 8種殺菌劑對南瓜炭疽病的抑制效果

3 討論

炭疽病菌是一類危害嚴(yán)重的植物病原菌，其部分菌株能夠侵染南瓜等多種葫蘆科作物，并能在瓜類作物的整個生長期發(fā)生，嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量與品質(zhì)[12]。炭疽病主要由炭疽菌屬(Colletotrichum)中的真菌引起，因植物不同，其病原菌也有所不同。近年來，分子生物學(xué)研究取得了很大進(jìn)展，可采用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS )、肌動蛋白( ACT )、3 -磷酸甘油醛脫氫酶( GADPH )等基因序列的多基因系統(tǒng)發(fā)育分析法，對植物炭疽菌分子鑒定以及分類。LIU等[13]通過ITS、GAPDH、ACT及TUB2基因序列分析，從吉林省的南瓜炭疽病病樣上分離得到C.brevisporum。本研究從采自貴州織金縣南瓜種植區(qū)的病樣中分離得到的病原菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)鑒定以及致病性測定，確定其病原菌為C.brevisporum，這說明C.brevisporum在我國東北地區(qū)及西南地區(qū)均為造成南瓜炭疽病的病原菌。

該研究針對南瓜炭疽病菌選用市場上常見的8種殺菌劑進(jìn)行室內(nèi)篩選，結(jié)果表明60%唑醚·代森聯(lián)WG、10%苯醚甲環(huán)唑WG及450 g/L咪鮮胺EW對C.brevisporum有較強(qiáng)抑菌作用。與室內(nèi)直接比較殺菌劑與病菌的互作不同，在實際使用中，藥劑的抑制效果還受溫度、濕度等環(huán)境因素的影響，因此，可將60%唑醚·代森聯(lián)WG、10%苯醚甲環(huán)唑WG及450 g/L咪鮮胺EW作為候選藥劑，在田間進(jìn)行進(jìn)一步的效果測定，為南瓜炭疽病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

通過對分離得到的病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并利用ITS、ACT、GADPH基因序列對病原菌進(jìn)行擴(kuò)增及測序，明確了引起貴州織金縣南瓜炭疽病的病原菌為C.brevisporum。通過室內(nèi)藥劑篩選發(fā)現(xiàn)，60%唑醚·代森聯(lián)WG、10%苯醚甲環(huán)唑WG及450 g/L咪鮮胺EW對南瓜炭疽病菌C.brevisporum具有較好的抑制作用，抑菌率為88.6%～91.5%，可用作南瓜炭疽病田間防治候選藥劑。