馮成軍， 周艷萌， 田應(yīng)娟

1.遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院感染科，貴州 遵義 563000； 2.遵義醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563000； 3.遵義市播州區(qū)中醫(yī)院B超科，貴州 遵義 563000

非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）是最常見的肝病之一，高發(fā)于高熱量飲食人群，全世界患病率約25%[1,2]。NASH是由過多的甘油三酯（triglycerides，TG）誘導(dǎo)累積導(dǎo)致肝脂肪變性，繼而發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎，最后導(dǎo)致肝硬化甚至肝癌[3,4]。目前為止，尚無有效的治療非酒精性脂肪性肝炎的方法。從脂質(zhì)積累分子機(jī)制來看，氧化應(yīng)激可能會(huì)引起脂肪變性?？寡趸瘎┛烧{(diào)節(jié)脂肪生成、脂質(zhì)氧化和過氧化以及炎癥，氧化環(huán)境的改善可能改善肝損傷和纖維化，從而降低脂肪肝風(fēng)險(xiǎn)[5]。因此抗氧化可能成為一種有前景的治療方法。白藜蘆醇（resveratrol，RSV）是一種天然多酚，提取自葡萄、漿果和紅酒，具有抗氧化作用[6]，可控制能量代謝。白藜蘆醇通過熱量限制，激活關(guān)鍵的代謝調(diào)節(jié)通路，如AMP活化激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）[7]、核 因 子 紅 系 衍 生 樣2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）[8]。Nrf2是調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，也是維持細(xì)胞內(nèi)源性氧化還原穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)因子。Nrf2可降低活性氧和親電體對(duì)細(xì)胞的損傷，誘導(dǎo)抗氧化應(yīng)激酶，使細(xì)胞保持穩(wěn)定狀態(tài)。Nrf2在細(xì)胞質(zhì)通過與其負(fù)性調(diào)節(jié)因子Kelch樣ECH結(jié)合蛋白1（kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）結(jié)合，促進(jìn)Nrf2泛素化。在活性氧作用下，Nrf2以Keap1-Nrf2復(fù)合物的形式從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，然后與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）結(jié)合。該復(fù)合物激活多種解毒劑和抗氧化劑酶基因的表達(dá)，如醌氧化還原酶1（NADPH quinone oxidoreductase 1，NQO1）、血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1），保護(hù)細(xì)胞免受氧化壓力以及其他毒素危害[9]。最近的數(shù)據(jù)表明，Nrf2/ARE途徑在抗氧化和凋亡損傷的保護(hù)作用中起著核心作用[10]。本實(shí)驗(yàn)主要基于Nrf2/ARE信號(hào)通路探討白藜蘆醇治療非酒精性脂肪性肝炎大鼠的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑 RSV（純度＞98%）購自美國Sigma公司；OAD85（Nrf2/ARE抑制劑齊墩果酸衍生物）由云南民族大學(xué)云南民族大學(xué)-香港浸會(huì)大學(xué)傳統(tǒng)天然藥物研發(fā)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；HE試劑盒購自北京索萊寶科技公司。 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、膽 固 醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein cholesterol，HDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）和 游 離 脂 肪 酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）試劑盒購自美國雅培公司。Keap1、Nrf2、ARE、NQO1、HO-1、GAPDH、H1兔抗鼠一抗，IgGHRP羊抗兔二抗購自美國Abcam公司。Favorgen試劑盒購自臺(tái)灣Favorgen生物科技公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠（體重200～260 g），購自北京華阜康生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0041。大鼠保持有規(guī)律的12 h光／暗循環(huán)（24±2）℃。CD飼料的能量組成含10%脂肪（可可脂4%，大豆油6%），20%蛋白質(zhì)以及70%碳水化合物。HCD飼料的能量來自65%脂肪（可可脂59%和大豆油6%），20%蛋白質(zhì)，10%碳水化合物，2%膽固醇，0.5%膽酸鹽等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型構(gòu)建 雄性SD大鼠32只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，取8只繼續(xù)喂養(yǎng)普通飼料作為CD組，其他采用高脂飲食法構(gòu)建大鼠NASH模型[11]。實(shí)驗(yàn)第4周末從高脂造模動(dòng)物中隨機(jī)抽取2只大鼠處死取其肝行肝組織病理學(xué)診斷，有明顯脂肪肝改變視為造模成功，并隨機(jī)分為高脂飲食組（HCD）、白藜蘆醇組（HCD+RSV）及（白藜蘆醇+OAD85）組（HCD+RSV+OAD85），每組取6只。各組大鼠干預(yù)情況如下：（HCD+RSV）組及（HCD+RSV+OAD85）組在喂養(yǎng)第4周灌胃給予10 mg/kg RSV或10 mg/kg RSV+100μg/kg OAD85[12,13]，灌胃劑量3 ml，每日1次，連續(xù)給藥28 d，CD組和HCD組給予等量生理鹽水，觀察病理情況并測試相關(guān)評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.2.2 肝HE染色病理學(xué)評(píng)價(jià) 取大鼠肝組織，于4%多聚甲醛溶液中固定，脫水，石蠟包埋，組織切片。進(jìn)行HE染色觀察肝組織病理學(xué)改變。脂肪變性程度主要觀察肝含脂肪面積的百分比。肝組織學(xué)參數(shù)分級(jí)按照非酒精性脂肪性肝炎臨床研究網(wǎng)絡(luò)NAFLD活動(dòng)評(píng)分。脂肪變性分級(jí)（0級(jí)，＜5%受影響；1級(jí)，5%～33%；2級(jí)，34%～66%；3級(jí)，66%以上）；小葉炎性活動(dòng)（0～3級(jí)）和腫脹程度（0～2級(jí)）；門靜脈炎癥分級(jí)為（0，無；1，輕度；2，中度；3，嚴(yán)重）。NASH總分采用非酒精性脂肪性肝炎臨床研究評(píng)分，是脂肪變性（0～3）、小葉炎癥（0～3）和腫脹（0～2）得分的未加權(quán)總和[14]。

1.2.3 肝組織冰凍切片油紅O染色觀察脂肪量變化冰凍切片厚5μm，用10%中性緩沖福爾馬林固定5 min，隨后進(jìn)行脂質(zhì)染色。脂類使用油紅O染色法檢測。1 g油紅O染料溶解于100 ml 70%乙醇／丙酮混合溶液中。切片在70%乙醇中進(jìn)行適應(yīng)沖洗，然后在工作溶液中培養(yǎng)10 min。切片在70%乙醇中進(jìn)行分化，然后用HE復(fù)染進(jìn)行對(duì)比。

1.2.4 血液生化指標(biāo)檢測 腹主動(dòng)脈取大鼠全血，4000 r/min離心10 min得到血清，利用試劑盒測試血清酶指標(biāo)（ALT、AST）以及血脂水平（TC、TG、LDL、HDL和FFA），操作嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.5 qRT-PCR檢測mRNA表達(dá) 使用Favorgen試劑盒分離肝組織總RNA，測試RNA純度。將其逆轉(zhuǎn)成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s；第2步開始讀板，5 s讀板1次，共39個(gè)循環(huán)，溶解曲線65～95℃。 U6作 為 內(nèi) 參（上 游 引 物 為 5′-CCTGAGCAGGAACAGCTTGA-3′，下 游 引 物 為5′-CGTACGTAGTCGAACCGAGA-3′），keap1（上游引物為5′-CCATATCGCTGGATGACGAT-3′，下游引物為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′），Nrf2（上 游 引 物 為5′-AGGACATGGATTTGATTGAC-3′，下 游 引 物 為5′-TACCTGGGAGTAGTTGGCA-3′）、ARE（上游引物為5′-GTTTCAACGAACAGTGGTA-3′，下 游 引 物 為5′-CTAGCTTGGAATGACATTG-3′）、NQO1（上游引物為5′-CCCTGCGAACTTTCAGTATCC-3′，下游引物為5′-CTTTCAGAATGGCAGGGACTC-3′）、HO-1（上游引物為5′-GGCAGCAAGGTGCAAGA-3′，下 游 引 物 為5′-GAAGGAAGCCAGCCAAGAG-3′），相對(duì)表達(dá)量用2-△△CT表示。

1.2.6 Western blot檢測Nrf2/ARE蛋白表達(dá) 從各組肝細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)。肝細(xì)胞研磨成為單細(xì)胞混懸液，在RIPA緩沖液中裂解。用BCA蛋白質(zhì)分析法測定蛋白質(zhì)濃度。每組上樣蛋白質(zhì)含量（50μg），用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并電轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜。5%脫脂牛奶在室溫下封閉2 h?？贵w的非特異性結(jié)合被阻斷。然后加入稀釋的一抗Keap1（1：1000），Nrf2（1：200），ARE（1：200），NQO1(1：200），HO-1（1：2000）、H1（1：1000）或GAPDH（1：2000）在4℃孵育過夜。第2 d膜在室溫下復(fù)溫1 h，加入IgGHRP二抗孵育2 h，滴加ECL發(fā)光液顯影，利用成像系統(tǒng)拍照，Image-J軟件定量光密度值。最后細(xì)胞質(zhì)蛋白以目的蛋白與GAPDH蛋白的表達(dá)量比值作為相對(duì)表達(dá)水平，細(xì)胞核蛋白以目的蛋白與H1蛋白的表達(dá)量比值作為相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示。兩組間的比較采用單因素方差分析。采用Graghpad 5和SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05代表具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 肝組織HE染色病理學(xué)評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)28 d后進(jìn)行肝組織HE染色，結(jié)果如圖1所示。CD組顯示正常的肝組織學(xué)形態(tài)。HCD組大鼠肝組織表現(xiàn)出廣泛的大量的脂肪變性，最明顯的肝脂肪變性出現(xiàn)在3區(qū)周圍，出現(xiàn)微泡和少量的大泡脂肪變性，同時(shí)伴有小葉炎癥、少量的門靜脈炎癥且細(xì)胞有輕微腫脹，這也是纖維化的開始，符合NASH組織病理形態(tài)。而（HCD+RSV）組表現(xiàn)出較少的脂肪變性，小葉炎癥和門靜脈炎癥減輕，腫脹有一定程度的改善。NADH評(píng)分結(jié)果顯示，HCD組肝脂肪變性、小葉炎癥、門靜脈炎癥、腫脹程度評(píng)分最高（P<0.05），（HCD+RSV）組各項(xiàng)評(píng)分較之降低（P<0.05），（HCD+RSV+OAD85）組與HCD組類似，如表1。

表1 肝組織病理評(píng)分表（±s）Tab.1 Liver pathology score sheet(Mean±SD)

表1 肝組織病理評(píng)分表（±s）Tab.1 Liver pathology score sheet(Mean±SD)

注：*P<0.05，與CD組相比#P<0.05，與HCD組相比Note:*P<0.05 vs CD group;#P<0.05 vs HCD group

總分Total score 0.120±0.009 8.31±0.85*5.42±0.80#8.51±0.39組別Groups CD HCD HCD+RSV HCD+RSV+OAD85脂肪變性Steatosis 0.050±0.003 2.72±0.31*1.52±0.31#2.91±0.05小葉炎癥Lobular inflammation 0.030±0.002 2.53±0.06*1.61±0.17#2.22±0.21門靜脈炎癥Portal inflammation 0.030±0.003 1.72±0.23*1.23±0.12#1.92±0.04腫脹程度Degreeof swelling 0.010±0.001 1.43±0.25 1.14±0.20 1.52±0.09

圖1 肝組織HE染色Fig.1 HEstaining of liver tissue

2.2 肝組織油紅O染色觀察脂肪量變化

結(jié)果如圖2所示，CD組幾乎沒有觀察到脂肪的含量，與CD組相比，HCD組脂肪含量明顯升高（P<0.05）。與HCD組相比，（HCD+RSV）組脂肪含量明顯降低（P<0.05）。（HCD+RSV+OAD85）組與HCD組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.3 血液生化指標(biāo)檢測

血液生化指標(biāo)檢測結(jié)果顯示（圖2～3），與CD組相比，HCD組血清中酶指標(biāo)ALT、AST顯著升高（P<0.001），血脂水平TC、TG、HDL、LDL、FFA明顯升高（P<0.01），與HCD組相比，（HCD+RSV）組酶指標(biāo)與血脂水平顯著下降（P<0.01）。

圖2 RSV對(duì)肝脂肪量的影響 *P<0.05 n=6Fig.2 Effect of RSV on liver fat mass *P<0.05;n=6

圖3 RSV對(duì)血液生化指標(biāo)ALT（A），AST（B）及TC（C），TG（D），LDL（E），HDL（F），F(xiàn)FA（G）的影響 *P<0.05 n=6Fig.3 Effect of RSV on blood biochemical indexes ALT(A),AST(B),TC(C),TG(D),LDL(E),HDL(F)and FFA(G) *P<0.05;n=6

2.4 qRT-PCR測試mRNA表達(dá)

對(duì)Nrf2/ARE通路的mRNA檢測結(jié)果顯示（圖4），與CD組 相 比，HCD組Nrf2、ARE、NQO1、HO-1 mRNA的表達(dá)均升高（P<0.05），Keap1 mRNA明顯下降（P<0.01）；與HCD組相比，（HCD+RSV）組中Nrf2、ARE、NQO1、HO-1 mRNA的表達(dá)均降低（P<0.05），Keap1 mRNA升高（P<0.05）；HCD組與（HCD+RSV+OAD85）組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖4 mRNA在各組的表達(dá)水平 *P<0.05 n=6Fig.4 mRNA expression levels in different groups*P<0.05 n=6

2.5 Western blot檢測Nrf2/ARE蛋白表達(dá)

Western blot檢測Nrf2/ARE蛋白表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖5），與CD組相比，HCD組及（HCD+RSV）組NQO1、HO-1、Nrf2、ARE蛋白表達(dá)均升高（P<0.05）；與HCD組對(duì)比，（HCD+RSV）組NQO1、HO-1、Nrf2、ARE蛋白表達(dá)均增加（P<0.05），Keap1蛋白表達(dá)降低（P<0.05）。HCD組與（HCD+RSV+OAD85）組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖5 Western blot檢測各組Nrf2/ARE蛋白表達(dá)水平A：CD組B：（HCD+RSV+OAD85）組C：HCD組D：（HCD+RSV）組*P<0.05 n=6Fig.5 Protein expression levelsof Nrf2/AREin different groupsdetected by Western blot A:CD group;B:HCD+RSV+OAD85 group;C:HCD group;D:HCD+RSV group*P<0.05;n=6

3 討論

NASH是西方發(fā)達(dá)國家常見的肝病，與肥胖、糖尿病及其他代謝病密切相關(guān)。NASH的發(fā)病機(jī)制目前并不清楚，大量的脂質(zhì)物質(zhì)和過氧化引起的氧化應(yīng)激是引起細(xì)胞損傷和肝組織炎癥加重的主要原因，氧化應(yīng)激通過特異性調(diào)節(jié)Nrf2/ARE通路來影響NASH。Nrf2/ARE途徑是一種內(nèi)源性抗氧化信號(hào)通路，提供細(xì)胞抵御氧化損傷的能力。Nrf2尤為重要的作用是，它能激活多種抗氧化酶（如谷胱甘肽過氧化物酶和硫氧還蛋白還原酶），來清除體內(nèi)過多的氧化自由基。因此研究Nrf2/ARE通路的特異性激活對(duì)于治療NASH很有必要。NASH模型研究表明，給予大鼠以含酒精或高脂飲食，可導(dǎo)致其出現(xiàn)比相同飲食更為嚴(yán)重的肝損傷；該通路具有潛在的保護(hù)作用，可能是加強(qiáng)抗氧化物和解毒酶的表達(dá)，從而減少細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，減少FFA從脂肪組織中釋放及對(duì)FFA的攝取[15]。本研究表明白藜蘆醇通過Nrf2/ARE表達(dá)導(dǎo)致肝損傷細(xì)胞數(shù)量減少，脂肪變性顯著減少，同時(shí)有些炎癥反應(yīng)被抑制。對(duì)比CD組，HCD組Nrf2明顯增加，同時(shí)在白藜蘆醇的作用下會(huì)對(duì)Nrf2顯著激活。在HCD作用下，Nrf2及相關(guān)通路指標(biāo)增加的可能原因是高脂造成的細(xì)胞損傷環(huán)境誘導(dǎo)了氧化應(yīng)激通路，從而使抗氧化物質(zhì)水平升高。白藜蘆醇也顯著增加了ARE、NQO1、HO-1，說明激活了Nrf2/ARE通路，并且對(duì)下游的基因蛋白產(chǎn)生了誘導(dǎo)作用。白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Keap1的影響有少量下降的趨勢，由此可看出白藜蘆醇的作用主要體現(xiàn)在正向調(diào)節(jié)Nrf2/ARE通路，負(fù)向調(diào)節(jié)Keap1。OAD85會(huì)抑制Nrf2，同時(shí)油紅染色等結(jié)果發(fā)現(xiàn)OAD85抑制RSV的脂肪代謝，這從一個(gè)側(cè)面說明RSV的脂肪代謝與Nrf2通路有關(guān)。白藜蘆醇有很好的抗氧化作用，它通過激活Nrf2/ARE通路抑制非酒精性脂肪性肝炎。有其他研究表明，白藜蘆醇可以減弱心肌缺血再灌注損傷引起的氧化應(yīng)激，可能也是因激活Nrf2/ARE保護(hù)心肌組織[16]。白藜蘆醇經(jīng)Nrf2/ARE通路減輕MPTP毒性，可通過抗氧化應(yīng)激來實(shí)現(xiàn)[17]。由此可見，白藜蘆醇通過Nrf2/ARE通路減弱氧化應(yīng)激，可治療多種疾病，減少組織損傷。

本研究使用高脂飲食喂養(yǎng)SD鼠來模擬非酒精性脂肪性肝炎疾病的形成。臨床NASH患者往往是受肥胖、胰島素抵抗和代謝綜合征等多種因素影響，選擇高脂飲食雖不能模擬真正發(fā)病的情況，但高脂飲食后形成的肝病灶包括脂肪變性、腫脹變性、炎癥和纖維化等接近于臨床NASH的病理表現(xiàn)。許多研究人員使用高脂飲食造模，系統(tǒng)地研究了Nrf2缺乏對(duì)NASH發(fā)生發(fā)展的影響。抑制Nrf2表達(dá)會(huì)導(dǎo)致脂肪變性和氧化應(yīng)激增加[18]。Nrf2過度激活模型的研究顯示，Nrf2對(duì)肝脂肪變性有改善作用。在這些研究中，系統(tǒng)性Nrf2過度激活是通過敲除基因Keap1（k1kd）模型或通過CDDO-IM 的藥物誘導(dǎo)。Wible等[19]灌胃CDDO-IM藥物誘導(dǎo)，Zhang等[20]用k1kd小鼠配合蛋氨酸-膽堿缺乏飲食（MCD）飲食5 d，兩者都顯示了NASH病情減弱。本研究結(jié)果較為一致。然而，有研究者使用瘦素缺乏癥（lepob/ob）k1kd小鼠喂養(yǎng)到16周以及使用k1kd小鼠喂養(yǎng)HCD 24周后，均表現(xiàn)為肝脂肪變性增加，Nrf2過度活化[21]。與本結(jié)果相矛盾。值得注意的是，不同研究喂養(yǎng)時(shí)間的長短差別很大，顯示Nrf2的保護(hù)作用的飲食時(shí)間較短，最多4周。另有研究者注意到8周齡時(shí)lepob/ob和lepob/ob k1kd之間的肝脂肪變性沒有區(qū)別，且在8周齡時(shí)k1kd抑制lepob的脂質(zhì)積累，而在16周齡時(shí)可促進(jìn)脂質(zhì)積累[22]。說明Nrf2對(duì)肝脂肪變性的保護(hù)可能是一種時(shí)間限制效應(yīng)。

Nrf2/ARE通路可以調(diào)節(jié)解毒酶的轉(zhuǎn)錄水平，從而調(diào)節(jié)氧化還原水平和各種抗氧化平衡，是細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激的主要作用機(jī)制。Nrf2/ARE通路主要由3個(gè)部分構(gòu)成，抗氧化反應(yīng)元件ARE、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子Nrf2以及兩者結(jié)合調(diào)控基因表達(dá)。Nrf2在細(xì)胞質(zhì)通過與Keap1結(jié)合形成Keap1-Nrf2復(fù)合體，細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，復(fù)合體解離，導(dǎo)致游離的Nrf2增加并且誘導(dǎo)Nrf2 mRNA轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)Nrf2蛋白生成，然后與ARE結(jié)合激活靶基因，如NQO1、HO-1。有研究表明灌胃鵝去氧膽酸后小鼠肝中Nrf2、HO-1與NQO1蛋白表達(dá)水平明顯升高[23]。。這些數(shù)據(jù)表明在實(shí)驗(yàn)性NASH中，Nrf2的激活途徑仍具有功能性。此外，這些數(shù)據(jù)可能表明，患有NASH的患者可能保留功能性Nrf2信號(hào)。NASH仍然受益于抗氧化劑/Nrf2活化療法。研究表明有藥物激活A(yù)kt和Nrf2/ARE信號(hào)通路，并增加Nrf2/ARE途徑的兩個(gè)下游因子HO-1和NQO-1的蛋白質(zhì)水平，提高ROS清除能力和抑制氧化反應(yīng)[24]。HO-1在抗氧化的同時(shí)也可以降低多種炎癥反應(yīng)，減輕組織的損傷，對(duì)組織具有保護(hù)作用。

總而言之，白藜蘆醇治療非酒精性脂肪性肝炎大鼠可能是基于Nrf2/ARE信號(hào)通路激活機(jī)制，從而改善氧化應(yīng)激水平，可減輕肝病理損傷，然而，白藜蘆醇是如何特異性激活Nrf2的表達(dá)，是否通過影響哪些上游分子信號(hào)通路來影響Nrf2的表達(dá)，且不同作用時(shí)間段會(huì)產(chǎn)生不同的影響，這些問題都有待進(jìn)一步探討和研究。