李汾杰， 陳曦， 李洋杰， 廖佳馨， 李志富， 劉桉茁， 張月秋， 顏南， 王正東

沈陽醫(yī)學(xué)院 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2.康復(fù)教研室，3.解剖學(xué)教研室，沈陽 110034

先天性馬蹄內(nèi)翻足（congenital talipes equinovarus，CTE）是一種常見的先天性足部畸形，患者有足部骨關(guān)節(jié)變形以及軟組織攣縮等復(fù)雜病理改變。這種先天性發(fā)育不良可能與肌肉攣縮、關(guān)節(jié)紊亂、肌肉異常插入、血管損傷、吸煙、宮內(nèi)體位不佳等有關(guān)，然而其病理機(jī)制尚未完全清楚。目前對于CTE的產(chǎn)前診斷是通過超聲檢查，有一定的漏診率。課題組前期研究表明：與對照組相比，患兒足踝部軟組織中COL9A1與SOX9高表達(dá)，高表達(dá)的COL9A1可能參與CTE軟組織攣縮，從而導(dǎo)致足部畸形的發(fā)生[1]；動物實驗發(fā)現(xiàn)與肢體遠(yuǎn)端發(fā)育相關(guān)的HOXD13基因低表達(dá)可使SOX9基因表達(dá)上調(diào)，從而導(dǎo)致與軟組織發(fā)育相關(guān)的COL9A1基因表達(dá)上調(diào)，這些可能參與CTE畸形的發(fā)生[2～4]。已知軟骨的分化受Sox9（sex determining region Y-box9）和經(jīng)典Wnt信號通路的關(guān)鍵因子β-catenin共同調(diào)控[5～7]，但未有研究顯示CTE畸形的發(fā)生與Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)，因此猜想Wnt/β-catenin通路可通過影響β-catenin磷酸化來調(diào)控下游靶基因Sox9的表達(dá)進(jìn)而參與CTE畸形的形成。該研究旨在通過觀察β-catenin，Pho-β-catenin-S552，Sox9在CTE大鼠踝部軟組織的表達(dá)來闡明Wnt/βcatenin信號通路的調(diào)控機(jī)制，為CTE的臨床診斷及治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 建模與取材 取10周齡SD大鼠，體重200～350 g，雌鼠20只，雄鼠12只，動物生產(chǎn)許可證SCXK（遼）2015-0001。分別將5只雌鼠和3只雄鼠合籠，第2 d通過陰道栓檢查是否懷孕，將孕10 d的SD雌鼠20只隨機(jī)平均分為對照組和實驗組，按照周海濤等人[8]的研究以135 mg／kg全反式維甲酸溶于礦物油對實驗組大鼠進(jìn)行灌胃處理，對照組以相應(yīng)體積的礦物油灌胃。實驗組2只孕鼠在灌胃1 d后死亡。孕20 d后剖宮取出胎鼠。實驗組剩余8只孕鼠產(chǎn)出胎鼠58只，其中出現(xiàn)類馬蹄內(nèi)翻足癥狀的胎鼠有34只，概率為58.6%。對照組獲得胎鼠98只，均未出現(xiàn)畸形。部分用于免疫印跡和mRNA檢測的典型馬蹄內(nèi)翻足胎鼠和正常胎鼠剖宮取出后立即凍存于-80℃冰箱中，專項實驗前取其下肢足踝關(guān)節(jié)上下5 mm附近的軟組織。另取部分典型馬蹄內(nèi)翻足胎鼠和正常胎鼠下肢相應(yīng)部位組織分別浸入4%多聚甲醛中固定，置于4℃冰箱保存。本實驗經(jīng)沈陽醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會審批（SYYXY2019022001）。

1.1.2 藥物與試劑 HE染色試劑、免疫組化試劑盒和Western blot試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，qRT-PCR試劑盒（Vazyme），兔抗鼠抗體β-catenin（ABclonal），phospho-β-catenin-S552（ABclonal）及Sox9（Santa Cruz）。

1.2 實驗方法

1.2.1 切片HE染色 取兩組足踝部組織標(biāo)本，4%多聚甲醛固定3 h，不同濃度蔗糖溶液浸泡進(jìn)行組織梯度脫水，制作冰凍切片，固定，HE染色，中性樹膠固封，于100倍光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.2 免疫組化檢測踝部軟組織Sox9與β-catenin表達(dá) 組織標(biāo)本制作冰凍切片同上。取制備好的切片滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑消除其活性；滴加封閉液，室溫靜置封閉20 min；滴加Ⅰ抗（Sox9 1：500、βcatenin 1：100），置于濕盒中，37℃溫箱處理1 h，4℃過夜；滴加生物素標(biāo)記的Ⅱ抗，室溫孵育30 min；滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶，室溫孵育10 min；DAB顯色約5 min后，用蒸餾水緩流水沖洗以終止顯色；蘇木素復(fù)染并使用1%鹽酸-乙醇溶液對細(xì)胞核進(jìn)行分化，PBS沖洗返藍(lán)，脫水封片；以空白對照組為陰性對照進(jìn)行免疫組化染色數(shù)據(jù)分析。Image J軟件進(jìn)行平均灰度值掃描。

1.2.3 Western blot檢測組織β-actin、β-catenin、Sox9和P-β-catenin-S552表達(dá) 取實驗組和對照組足踝部組織標(biāo)本，稱重，加裂解液并研磨，離心取上清于冰中待用。BAC試劑盒測量并調(diào)整至適宜蛋白濃度，制膠并以β-actin為內(nèi)參電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜后封閉；加一抗雜交液，搖床1 h后4℃過夜；二抗β-actin（1：10000）、β-catenin（1：1000）、Sox9（1：1000）和P-βcatenin-S552（1：1000）室溫雜交2 h；ECL的A，B兩種試劑等比例混合并浸潤洗滌后的PVDF膜；通過Image J對條帶進(jìn)行掃描處理，量化后分析數(shù)據(jù)。

1.2.4 Real-Time PCR檢測β-catenin和Sox9表達(dá) 提取兩組足踝部組織樣本中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行Real-Time PCR擴(kuò)增，引物序列見表1，以Gapdh為內(nèi)參，每份樣品做3個復(fù)孔，取平均Ct值進(jìn)行計算。依據(jù)各組的Ct值，采用2—△△Ct法計算實驗組與對照組之間β-catenin和Sox9的相對表達(dá)差異。

表1 引物序列表Tab.1 Primer sequencesof real-time PCR

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗分析所得數(shù)據(jù)，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色

HE染色后鏡下觀察，與正常組相比，實驗組軟骨基質(zhì)增多，軟組織中膠原纖維成分明顯增多，軟組織出現(xiàn)明顯的攣縮現(xiàn)象，骨之間的間隙增大。

2.2 免疫組化

免疫組化顯色結(jié)果，細(xì)胞核中出現(xiàn)黃褐色陽性顆粒，Sox9蛋白陽性細(xì)胞密集分布在軟骨及軟組織中，β-catenin蛋白主要表達(dá)于除骨組織以外的軟組織細(xì)胞核中。與對照組相比，實驗組趾骨有較明顯的間隙，且軟組織中黃褐色陽性顆粒增多。實驗組大鼠踝部軟組織Sox9表達(dá)顯著高于對照組（P<0.01），βcatenin表達(dá)高于對照組（P<0.05），見圖2。

圖1 大鼠足踝部組織HE染色實驗組可見較多膠原纖維沉淀及骨間縫隙增大 CTL：正常組CEV：實驗組Fig.1 HEstaining of ankletissuein each group It can be seen that the precipitation of more collagen fibers were more obvious in the experimental group,and the gap between bones also significantly increased CTL：Normal group CEV：Experimental group

圖2 大鼠足踝部組織中Sox9與βcatenin表達(dá)Sox9陽性細(xì)胞密集分布在軟骨及軟組織的細(xì)胞核，β-catenin蛋白主要表達(dá)于除骨組織以外軟組織細(xì)胞的細(xì)胞核，實驗組趾骨有較明顯的間隙，且軟組織中黃褐色陽性顆粒多于對照組CTL：正常組 CEV：實驗組 *P<0.05 **P<0.01Fig.2 The expression of Sox9 andβcatenin in two groups Sox9 protein positive cells were densely distributed in the nuclei of cartilage and soft tissue, β-catenin protein was mainly expressed in the nuclei of soft tissue cells except bone tissue.The phalangeal space in the experimental group was more obvious,and the positive yellow brown particles in soft tissue was more than that in the control group CTL：Normal group CEV：Experimental group*P<0.01,**P<0.05

2.3 RT-qPCR檢測

RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組Sox9 mRNA與β-catenin mRNA表達(dá)顯著增高（P<0.01），二者表達(dá)同步增高的原因可用Wnt信號通路調(diào)控βcatenin磷酸化水平降低從而激活Sox9基因來解釋，見圖3。

圖3 大鼠足踝部組織中Sox9與β-catenin的mRNA表達(dá)水平 CTL：正常組CEV：實驗組**P<0.01Fig.3 The mRNA expression levels of Sox9 andβ-catenin in two groups CTL：Normal group CEV：Experimental group**P<0.01

2.4 Western blot結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組大鼠踝部軟組織β-catenin表達(dá)水平增高（P<0.05），Sox9表達(dá)明顯增高（P<0.05），踝部組織中磷酸化β-catenin-S552明顯減少（P<0.001），可見CTE大鼠踝部軟組織中β-catenin確實高表達(dá)，見圖4。

圖4 大鼠足踝部組織中β-catenin、Sox9與磷酸化β-catenin-S552蛋白表達(dá)CTL：正常組CEV：實驗組*P<0.05，***P<0.001Fig.4 Theprotein expression levelsofβ-catenin,Sox9 and phosphorylatedβ-catenin-S552 in two groups CTL：Normal group CEV：Experimental group*P<0.05，***P<0.001

3 討論

課題組前期臨床和動物模型實驗結(jié)果、相關(guān)文獻(xiàn)均表明，實驗組足踝部軟組織Sox9蛋白的表達(dá)水平明顯高于對照組，因此推測高表達(dá)的Sox9與CTE發(fā)生有關(guān)[1～7]。Sox家族的轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)作為典型Wnt/β-catenin信號的調(diào)節(jié)劑出現(xiàn)在不同的發(fā)育和疾病環(huán)境中。Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)是整個動物界發(fā)育的主要調(diào)節(jié)因子，在與Sox9表達(dá)相關(guān)的多種疾病發(fā)生發(fā)展中有著重要的角色，因此推測CTE大鼠踝部組織中Sox9高表達(dá)與Wnt/β-catenin調(diào)控有關(guān)，β-catenin是經(jīng)典Wnt途徑中的關(guān)鍵調(diào)控因子，由降解復(fù)合體（DC）控制其穩(wěn)定性。DC是由腫瘤抑制蛋白Axin作為支架，與β-catenin兩種活性絲氨酸蘇氨酸激酶（CK1和GSK3-β）和腫瘤抑制蛋白APC組成。當(dāng)Fz／LRP受體未與Wnt信號結(jié)合時，CK1和GSK3-β可依次將Axin所結(jié)合的β-catenin磷酸化；細(xì)胞接收到Wnt信號后，GSK3-β的活性被抑制從而抑制β-catenin的磷酸化進(jìn)程，使游離β-catenin水平迅速增加，在細(xì)胞質(zhì)中大量積累，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核并激活靶基因，調(diào)控基因表達(dá)[9]。本研究檢測CTE大鼠踝部軟組織，Western blot及免疫組化結(jié)果顯示Sox9與β-catenin表達(dá)增高，且磷酸化β-catenin-S552的表達(dá)顯著減少，因此認(rèn)為先天性馬蹄內(nèi)翻足大鼠足踝部組織中Sox9高表達(dá)是Wnt/β-Catenin信號通路調(diào)控引起，該通路參與先天性馬蹄內(nèi)翻足畸形的形成。胎鼠發(fā)育過程中其踝部組織細(xì)胞接收到Wnt信號，β-catenin的磷酸化被抑制，細(xì)胞中β-catenin水平升高并在細(xì)胞核中激活Sox9的表達(dá)。其他研究也證實Sox9與Wnt通路之間相似的促進(jìn)關(guān)系，比如，經(jīng)GSK-3β抑制劑處理激活Wnt/βcatenin信號，前列腺癌細(xì)胞中的Sox9表達(dá)增加，而siRNA下調(diào)β-catenin后，Sox9的表達(dá)降低，說明Sox9在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)受Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控[10]。當(dāng)Wnt/β-catenin通路被激活后，Sox9過度表達(dá)，促進(jìn)β-catenin從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的易位，從而可以增強(qiáng)TCF/LEF的轉(zhuǎn)錄活性，增加GSK3-β在Ser9的磷酸化，當(dāng)β-catenin被抑制后過度表達(dá)的Sox9的促轉(zhuǎn)移作用也被抑制[11]。

本研究的實驗?zāi)Ｐ褪怯纱笫缶S甲酸灌胃處理建立，標(biāo)本數(shù)量不是很多，畸形狀態(tài)雖然與人的馬蹄內(nèi)翻足狀態(tài)相似，但僅僅是形態(tài)上的相仿，腿部畸形明顯表現(xiàn)出馬蹄內(nèi)翻但不能確定其生長過程中的發(fā)展和表現(xiàn)；維甲酸對胎鼠有一定的毒性作用，除馬蹄內(nèi)翻足外還可導(dǎo)致眼部畸形，尾部畸形，開放性脊柱裂等，因此所得的實驗結(jié)果或許與臨床病例存在一定差異，這些是本研究的局限所在，希望會有更多的研究進(jìn)以輔證。

綜上所述，本課題組認(rèn)為CTE大鼠踝部組織中Sox9表達(dá)量增高是由于經(jīng)典Wnt信號通路被激活，βcatenin的磷酸化降解減少，胞質(zhì)中游離β-catenin的水平升高進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞核并激動Sox9基因的表達(dá)造成的，又由于Sox9與CTE畸形之間存在一定的相關(guān)性，因此基于前期的研究認(rèn)為Wnt/β-Catenin信號通路通過參與調(diào)控大鼠踝部組織中高表達(dá)Sox9而引起先天性馬蹄內(nèi)翻足畸形的發(fā)生。