劉吉祥， 劉芳宇， 孫林鶴， 崔 鍵， 徐迎春， 常雅軍，①， 姚東瑞，①

〔1. 江蘇省中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)： a. 江蘇省水生植物資源與水環(huán)境修復(fù)工程研究中心，b. 江蘇省植物資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京 210014； 2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院， 江蘇 南京 210095〕

化感物質(zhì)是次生代謝產(chǎn)物，分子量較小，結(jié)構(gòu)相對(duì)簡單，在自然環(huán)境中易降解，生態(tài)安全性較好[1]。植物化感物質(zhì)對(duì)藻類具有生長抑制效應(yīng)[2]，植物化感抑藻技術(shù)是生態(tài)安全、環(huán)境友好的控藻技術(shù)[3-5]。近年來，化感作用是農(nóng)業(yè)、環(huán)境科學(xué)和生態(tài)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[6]。目前已發(fā)現(xiàn)植物化感物質(zhì)20余種，其中酚酸類化感物質(zhì)的化感作用較強(qiáng)[7-8]。穗狀狐尾藻(MyriophyllumspicatumLinn.)中的兒茶酚、五倍子酸、鞣花酸和鄰苯三酚等可同時(shí)抑制銅綠微囊藻(MicrocystisaeruginosaKützing)和斜生柵藻〔Scenedesmusobliquus(Turpin) Kützing〕生長[9-11]；苦草(VallisneriaspiralisLinn.)中的苯甲酸、阿魏酸和咖啡酸等可顯著抑制銅綠微囊藻生長[2，12-13]；0.6 mmol·L-1羥基苯甲酸和1.0 mmol·L-1阿魏酸可顯著抑制水華魚腥藻〔Anabaenaflosflos-aquae(Lyngb.) de Breb.〕和蛋白核小球藻(ChlorellapyrenoidosaChick)生長[14]；水楊酸對(duì)銅綠微囊藻和蛋白核小球藻的混合體系有生長抑制效應(yīng)，半致死濃度為64.90 mg·L-1[15]；0.6 mmol·L-1水楊酸對(duì)水華魚腥藻的生長抑制效應(yīng)最佳[16]。

酚酸類化感物質(zhì)對(duì)藍(lán)藻的生長抑制作用及藍(lán)藻的生理生化響應(yīng)與酚酸類化感物質(zhì)和藍(lán)藻的種類相關(guān)。酚酸類化感物質(zhì)對(duì)藍(lán)藻的化感抑制機(jī)制主要包括：1)對(duì)藍(lán)藻細(xì)胞膜的影響與破壞，如對(duì)羥基苯甲酸會(huì)造成銅綠微囊藻細(xì)胞膜的破裂和溶解[17]；2)對(duì)藍(lán)藻細(xì)胞光系統(tǒng)的影響與損壞，如鄰苯二酚會(huì)對(duì)銅綠微囊藻的PSⅡ活性造成持續(xù)的、不可恢復(fù)的破壞[18]；3)影響藍(lán)藻細(xì)胞抗氧化酶活性，如在酚酸類化感物質(zhì)脅迫下，藻類的抗氧化酶活性隨活性氧濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢[14，19]；4)調(diào)控藍(lán)藻生長發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)[20]。聚球藻作為海洋和淡水藍(lán)藻中最主要的代表性類群之一[21]，其結(jié)構(gòu)簡單，遺傳多樣性和生態(tài)型豐富，是微型生物生態(tài)學(xué)研究的模式種，且聚球藻基因組信息公布較早，具有成熟的遺傳轉(zhuǎn)化體系，在生理生化和分子生物學(xué)方面的背景信息較為清楚，是藍(lán)藻模式種中的優(yōu)勢種[22-23]，可作為化感物質(zhì)抑藻分子機(jī)制研究的良好材料。

本研究選取常見的酚酸類化感物質(zhì)苯甲酸、水楊酸和阿魏酸為抑制劑，研究這3種酚酸類化感物質(zhì)對(duì)聚球藻的抑制效應(yīng)，分析聚球藻在細(xì)胞形態(tài)、光系統(tǒng)及抗氧化酶活性等方面的響應(yīng)機(jī)制，以期明確酚酸類化感物質(zhì)抑制聚球藻生長的生理生化機(jī)制，為酚酸類化感物質(zhì)抑藻的分子機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

聚球藻Synechococcussp. PCC7942購自中國科學(xué)院淡水藻種庫，編號(hào)為FACHB-805。供試藻種采用pH (7.0±0.1)的BG-11培養(yǎng)基[21]培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度(25±1) ℃、光照度4 000 lx、光照時(shí)間12 h·d-1；每天搖動(dòng)培養(yǎng)瓶1～2次，每7～10 d轉(zhuǎn)接1次。

苯甲酸、水楊酸和阿魏酸均為分析純，購自阿拉丁試劑(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 將苯甲酸、水楊酸和阿魏酸分別用BG-11培養(yǎng)基配置成500 mg·L-1母液，于121 ℃高壓滅菌30 min，現(xiàn)配現(xiàn)用。取處于對(duì)數(shù)生長期的聚球藻藻液10 mL，分別加入上述3種化感物質(zhì)的母液至500 mL，聚球藻細(xì)胞濃度為1×104～1×105mL-1，苯甲酸和水楊酸的濃度分別為25、30、35和40 mg·L-1，阿魏酸的濃度分別為30、40、50和60 mg·L-1。對(duì)照為500 mL 不添加酚酸類化感物質(zhì)的BG-11培養(yǎng)基。每組3個(gè)重復(fù)，置于光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件同“1.1”，培養(yǎng)周期9 d，定時(shí)測定相關(guān)指標(biāo)。

1.2.2 指標(biāo)測定

1.2.2.1 細(xì)胞密度測定 每天9：00將聚球藻培養(yǎng)液搖勻后，各處理取5 mL，使用UV-1600紫外分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)于波長680 nm處測定其吸光值(A)，即為細(xì)胞密度，以BG-11培養(yǎng)基作空白對(duì)照。

1.2.2.2 細(xì)胞形態(tài)觀測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天(處理9 d)，各取一定量的聚球藻培養(yǎng)液于室溫、4 000 r·min-1離心10 min，去除上清液，收集濃縮藻細(xì)胞，然后加入磷酸緩沖液(pH 7.0)配置的體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液固定藻細(xì)胞[24]，置于4 ℃冰箱，每7 d更換1次固定液。采用K850臨界點(diǎn)干燥儀(英國Quorum公司)干燥后，在Quanta 200環(huán)境掃描電子顯微鏡(美國FEI公司)下觀測聚球藻的細(xì)胞形態(tài)。

1.2.2.3 葉綠素a含量測定 分別于處理0、3、6和9 d取各處理搖勻的聚球藻培養(yǎng)液10 mL，于室溫、4 000 r·min-1離心10 min，去除上清液，沉淀用液氮速凍后研磨破碎，加入等體積無水乙醇[25]，混合均勻，靜置至葉綠素萃取充分，然后于室溫、4 000 r·min-1離心10 min。使用分光光度計(jì)分別于波長665和649 nm處測定上清液的吸光值，以無水乙醇為空白對(duì)照，根據(jù)公式“葉綠素a含量=13.90A665-5.76A649”計(jì)算葉綠素a含量。

1.2.2.4 部分葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定 分別于處理0、3、6和9 d取各處理搖勻的聚球藻培養(yǎng)液20 mL，暗適應(yīng)20 min后，利用FluorPen手持式葉綠素?zé)晒鈨x(北京易科泰生態(tài)技術(shù)有限公司)測定聚球藻初始熒光(Fo)和PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)。

1.2.2.5 抗氧化酶活性測定 參照文獻(xiàn)[26]，于實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天(處理9 d)，取數(shù)份50 mL聚球藻培養(yǎng)液，于室溫、4 000 r·min-1離心10 min，去除上清液，收集沉淀。用1 mL 0.05 mol·L-1磷酸緩沖液(pH 7.0)在冰浴中研磨為勻漿，使用D3024R高速冷凍離心機(jī)(美國Scilogex公司)于4 ℃、4 000 r·min-1離心10 min，獲得聚球藻粗酶提取液。聚球藻的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性分別按照SOD試劑盒A001-1-2、POD試劑盒A084-3-1和CAT可見光試劑盒A007-1-1(南京建成生物工程研究所)的方法測定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用WPS Office 2019軟件和Origin 2018軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制，采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及顯著性分析(P<0.05)。

聚球藻生長抑制率(IR)計(jì)算公式為IR=(1-N/N0)×100%。式中，N為處理組聚球藻細(xì)胞密度(以A680表示)，N0為同一處理時(shí)間對(duì)照組的聚球藻細(xì)胞密度[27]。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同濃度酚酸類化感物質(zhì)處理下聚球藻的生長及細(xì)胞形態(tài)響應(yīng)

2.1.1 對(duì)生長的影響 不同濃度酚酸類化感物質(zhì)處理下聚球藻的生長響應(yīng)見圖1，對(duì)聚球藻生長的抑制率見表1。結(jié)果顯示：與對(duì)照(不添加酚酸類化感物質(zhì))相比，隨著處理時(shí)間的延長，25 mg·L-1苯甲酸對(duì)聚球藻的生長呈現(xiàn)先抑制后促進(jìn)效應(yīng)；30 mg·L-1苯甲酸對(duì)聚球藻的生長呈現(xiàn)明顯的抑制效應(yīng)，處理9 d，抑制率為33.99%；35和40 mg·L-1苯甲酸處理8 d，聚球藻的生長基本處于被阻止?fàn)顟B(tài)，而處理9 d，35 mg·L-1苯甲酸處理組的聚球藻出現(xiàn)生長恢復(fù)現(xiàn)象，40 mg·L-1苯甲酸處理組的聚球藻細(xì)胞出現(xiàn)衰亡現(xiàn)象。

與對(duì)照相比，25～40 mg·L-1水楊酸對(duì)聚球藻的生長呈現(xiàn)明顯抑制效應(yīng)，其中，30～40 mg·L-1水楊酸對(duì)聚球藻的生長抑制效應(yīng)加劇，處理8 d，抑制率在70%左右，處理9 d，30 mg·L-1水楊酸處理組的聚球藻出現(xiàn)生長恢復(fù)現(xiàn)象，而35和40 mg·L-1水楊酸處理組的聚球藻細(xì)胞出現(xiàn)衰亡現(xiàn)象。說明水楊酸對(duì)聚球藻的抑制效應(yīng)隨其濃度升高而增強(qiáng)，處理9 d，25、30、35和40 mg·L-1水楊酸對(duì)聚球藻生長的抑制率分別為34.27%、66.01%、85.39%和83.43%。

與對(duì)照相比，30和40 mg·L-1阿魏酸明顯促進(jìn)聚球藻生長，而50和60 mg·L-1阿魏酸處理前8 d，聚球藻的生長基本被阻止，二者的抑制率在75%左右；50 mg·L-1阿魏酸處理9 d，聚球藻出現(xiàn)生長恢復(fù)現(xiàn)象。

比較3種酚酸類化感物質(zhì)對(duì)聚球藻生長的抑制率，處理9 d，25 mg·L-1水楊酸對(duì)聚球藻生長的抑制率為34.26%，而25 mg·L-1苯甲酸對(duì)聚球藻生長還有一定的促進(jìn)作用，說明水楊酸對(duì)聚球藻的抑制效果優(yōu)于苯甲酸，但40 mg·L-1苯甲酸和水楊酸對(duì)聚球藻生長的抑制率均達(dá)到85%左右；而30和40 mg·L-1阿魏酸明顯促進(jìn)聚球藻生長。另外，苯甲酸和阿魏酸對(duì)聚球藻的生長均呈現(xiàn)低促高抑現(xiàn)象。

表1 不同濃度酚酸類化感物質(zhì)處理下聚球藻生長的抑制率

2.1.2 對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 不同濃度酚酸類化感物質(zhì)處理下聚球藻的細(xì)胞形態(tài)響應(yīng)見圖2。結(jié)果顯示：對(duì)照組聚球藻分裂旺盛、生長正常，分布相對(duì)均勻，細(xì)胞個(gè)體分明、表面光滑，形態(tài)完整。25 mg·L-1苯甲酸以及30和40 mg·L-1阿魏酸處理組的聚球藻細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組基本一致；30和35 mg·L-1苯甲酸抑制聚球藻的細(xì)胞生長，40 mg·L-1苯甲酸阻止聚球藻的細(xì)胞生長，基本抑制細(xì)胞分裂，細(xì)胞分布不均、凹陷明顯，胞外出現(xiàn)大量絮狀分泌物和內(nèi)容物，部分細(xì)胞出現(xiàn)抱團(tuán)聚集現(xiàn)象，且隨濃度升高抱團(tuán)聚集現(xiàn)象越明顯。25和30 mg·L-1水楊酸抑制聚球藻細(xì)胞生長，細(xì)胞分裂相對(duì)減少，細(xì)胞表面出現(xiàn)皺縮和凹陷，存在少量胞外分泌物；35和40 mg·L-1水楊酸以及50和60 mg·L-1阿魏酸阻止聚球藻細(xì)胞生長，細(xì)胞分裂更少、分布不均，胞外出現(xiàn)大量的絮狀分泌物和內(nèi)容物，且50 mg·L-1阿魏酸導(dǎo)致聚球藻細(xì)胞破裂，細(xì)胞出現(xiàn)板結(jié)和凝聚現(xiàn)象?？傮w上看，上述3種酚酸類化感物質(zhì)的濃度范圍內(nèi)，聚球藻細(xì)胞形態(tài)受影響程度隨3種酚酸類化感物質(zhì)濃度的升高而加劇。在酚酸類化感物質(zhì)的作用下，隨處理濃度的升高，聚球藻的細(xì)胞膜會(huì)逐漸出現(xiàn)皺縮、破損，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞和功能的喪失，內(nèi)容物大量外滲以及細(xì)胞黏連出現(xiàn)凝聚成團(tuán)和板結(jié)等現(xiàn)象，最終細(xì)胞死亡。

A1，A2，A3，A4： 分別為25、30、35和40 mg·L-1苯甲酸處理25， 30， 35， and 40 mg·L-1 benzoic acid treatments， respectively； B1，B2，B3，B4： 分別為25、30、35和40 mg·L-1水楊酸處理25， 30， 35， and 40 mg·L-1 salicylic acid treatments， respectively； C1，C2，C3，C4： 分別為30、40、50和60 mg·L-1阿魏酸處理30， 40， 50， and 60 mg·L-1 ferulic acid treatments， respectively； D1，D2，D3： 對(duì)照(不添加酚酸類化感物質(zhì))The control (not adding phenolic acid allelochemicals).

2.2 不同濃度酚酸類化感物質(zhì)處理下聚球藻的生理響應(yīng)

2.2.1 對(duì)葉綠素a含量的影響 不同濃度酚酸類化感物質(zhì)對(duì)聚球藻葉綠素a含量的影響見表2。結(jié)果顯示：與對(duì)照(不添加酚酸類化感物質(zhì))相比，25 mg·L-1苯甲酸處理3 d，聚球藻葉綠素a含量顯著降低，處理6和9 d，葉綠素a含量明顯升高；30、35和40 mg·L-1苯甲酸處理3～9 d，葉綠素a含量總體上顯著降低，處理9 d，葉綠素a含量分別為0.589 5、0.168 8和0.014 4 μg·mL-1，分別為對(duì)照的79.31%、22.71%和1.94%，苯甲酸濃度在30 mg·L-1及以上時(shí)，聚球藻葉綠素a含量隨苯甲酸濃度升高而降低。隨著處理時(shí)間的延長，25 mg·L-1苯甲酸處理葉綠素a含量的變化趨勢與對(duì)照一致，呈逐漸升高的趨勢，30和35 mg·L-1苯甲酸處理的葉綠素a含量呈先降低后升高的趨勢。

與對(duì)照相比，25、30、35和40 mg·L-1水楊酸處理聚球藻葉綠素a含量顯著降低，處理9 d，葉綠素a含量分別為對(duì)照的77.40%、28.36%、3.62%和1.33%。隨著處理時(shí)間的延長，25、30和35 mg·L-1水楊酸處理的葉綠素a含量呈先降低后升高的趨勢，40 mg·L-1水楊酸處理的葉綠素a含量總體呈降低的趨勢。

與對(duì)照相比，30和40 mg·L-1阿魏酸處理6和9 d，聚球藻葉綠素a含量顯著升高，而50和60 mg·L-1阿魏酸處理3～9 d，葉綠素a含量顯著降低，處理9 d時(shí)葉綠素a含量僅為對(duì)照的29.99%和9.51%，與阿魏酸對(duì)聚球藻生長的影響呈低促高抑的趨勢一致。隨著處理時(shí)間的延長，30和40 mg·L-1阿魏酸處理的葉綠素a含量呈逐漸升高的趨勢；50 mg·L-1阿魏酸處理的葉綠素a含量在處理0～6 d基本穩(wěn)定，在處理9 d明顯升高；60 mg·L-1阿魏酸處理的葉綠素a含量呈先降低后升高的趨勢。

25 mg·L-1水楊酸處理的聚球藻葉綠素a含量顯著低于對(duì)照，而同一濃度苯甲酸處理6和9 d時(shí)葉綠素a含量高于對(duì)照；40 mg·L-1苯甲酸和水楊酸處理9 d，葉綠素a含量均僅為對(duì)照的1.5%左右，而30和40 mg·L-1阿魏酸處理6和9 d，葉綠素a含量顯著升高?？傮w上看，在不同濃度和不同種類的酚酸類化感物質(zhì)處理下，聚球藻葉綠素a含量的變化趨勢與其生長響應(yīng)相似，且水楊酸對(duì)聚球藻葉綠素a含量的抑制作用最好，苯甲酸次之，阿魏酸最差。

2.2.2 對(duì)初始熒光(Fo)的影響 不同濃度酚酸類化感物質(zhì)對(duì)聚球藻Fo值的影響見表3。結(jié)果顯示：25 mg·L-1苯甲酸處理3 d，聚球藻的Fo值較對(duì)照顯著降低，處理6和9 d，F(xiàn)o值較對(duì)照升高，但差異不顯著；與對(duì)照相比，苯甲酸濃度在30 mg·L-1及以上時(shí)，聚球藻的Fo值總體隨著苯甲酸濃度升高而顯著降低。隨著處理時(shí)間延長，25和30 mg·L-1苯甲酸處理Fo值的變化趨勢與對(duì)照一致，呈逐漸升高的趨勢，35和40 mg·L-1苯甲酸處理的Fo值呈“升高—降低—升高”的波動(dòng)變化。

與對(duì)照相比，25～40 mg·L-1水楊酸處理聚球藻的Fo值顯著降低，且隨水楊酸濃度的升高，處理3 d時(shí)Fo值先升高后降低，處理6和9 d時(shí)Fo值逐漸降低。隨著處理時(shí)間延長，25 mg·L-1水楊酸處理的Fo值呈逐漸升高的趨勢，30、35和40 mg·L-1水楊酸處理的Fo值呈“升高—降低—升高”的波動(dòng)變化。

表2 不同濃度酚酸類化感物質(zhì)對(duì)聚球藻葉綠素a含量的影響

與對(duì)照相比，低濃度(30和40 mg·L-1)阿魏酸處理聚球藻的Fo值升高，但總體差異不顯著，而高濃度(50和60 mg·L-1)阿魏酸處理的Fo值顯著降低。隨著處理時(shí)間延長，30、40和50 mg·L-1阿魏酸處理的Fo值基本呈升高的趨勢，60 mg·L-1阿魏酸處理的Fo值呈“升高—降低—升高”的波動(dòng)變化，其中，處理9 d，F(xiàn)o值有一定程度的恢復(fù)，這可能與聚球藻細(xì)胞的生長阻止效應(yīng)被解除有關(guān)。

比較3種酚酸類化感物質(zhì)的抑制效應(yīng)發(fā)現(xiàn)，25、30和35 mg·L-1水楊酸處理9 d，聚球藻的Fo值均低于同濃度苯甲酸，僅在濃度為40 mg·L-1時(shí)，2個(gè)處理的Fo值均降低至190左右，說明水楊酸對(duì)聚球藻Fo值的抑制效應(yīng)較苯甲酸更強(qiáng)；與對(duì)照相比，阿魏酸對(duì)聚球藻Fo值的影響仍呈現(xiàn)低促高抑現(xiàn)象。不同濃度的3種酚酸類化感物質(zhì)對(duì)聚球藻Fo值的影響與聚球藻的生長響應(yīng)和葉綠素a含量變化一致。

2.2.3 對(duì)PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)的影響 不同濃度酚酸類化感物質(zhì)對(duì)聚球藻Fv/Fm值的影響見表3。結(jié)果顯示：與對(duì)照相比，25～40 mg·L-1苯甲酸處理聚球藻的Fv/Fm值總體上顯著降低，且苯甲酸濃度越高，F(xiàn)v/Fm值降幅越大。隨著處理時(shí)間延長，25、30和35 mg·L-1苯甲酸處理的Fv/Fm值總體呈先降低后升高的趨勢，說明這3個(gè)苯甲酸處理可抑制聚球藻光系統(tǒng)活性，但處理后期抑制效果減弱；而40 mg·L-1苯甲酸處理9 d時(shí)Fv/Fm值降為0。

25 mg·L-1水楊酸處理3 d，聚球藻的Fv/Fm值與對(duì)照相同，處理6和9 d，F(xiàn)v/Fm值較對(duì)照有所降低，但差異不顯著；與對(duì)照相比，30、35和40 mg·L-1水楊酸處理的Fv/Fm值顯著降低，且水楊酸濃度越高，F(xiàn)v/Fm值降幅越大。隨著處理時(shí)間延長，25 mg·L-1水楊酸處理的Fv/Fm值一直在0.23左右，30 mg·L-1水楊酸處理的Fv/Fm值呈先降低后升高的趨勢，而35和40 mg·L-1水楊酸處理的Fv/Fm值持續(xù)下降。

與對(duì)照相比，30和40 mg·L-1阿魏酸處理聚球藻的Fv/Fm值無顯著變化，而50和60 mg·L-1阿魏酸處理的Fv/Fm值顯著降低。隨著處理時(shí)間延長，30和40 mg·L-1水楊酸處理的Fv/Fm值一直在0.24左右，50和60 mg·L-1阿魏酸處理的Fv/Fm值總體呈下降趨勢。

表3 不同濃度酚酸類化感物質(zhì)對(duì)聚球藻初始熒光(Fo)和PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)的影響

比較3種酚酸類化感物質(zhì)對(duì)聚球藻Fv/Fm值的影響發(fā)現(xiàn)，處理9 d，40 mg·L-1苯甲酸和水楊酸處理聚球藻的Fv/Fm值均降至0，25、30和35 mg·L-1水楊酸處理的Fv/Fm值低于同一濃度苯甲酸處理，而低濃度阿魏酸處理的Fv/Fm值無顯著變化，高濃度阿魏酸處理的Fv/Fm值顯著降低，說明水楊酸的抑制效果最佳，苯甲酸次之，阿魏酸最差?？傮w而言，高濃度酚酸類化感物質(zhì)均可顯著降低聚球藻的Fv/Fm值，甚至降為0，但促進(jìn)聚球藻生長的低濃度阿魏酸并未增加其Fv/Fm值。

2.2.4 對(duì)抗氧化酶活性的影響 由于高濃度酚酸類化感物質(zhì)阻止聚球藻生長，聚球藻細(xì)胞的抗氧化酶活性無法測定，故只在促進(jìn)和抑制聚球藻生長的濃度范圍內(nèi)研究酚酸類化感物質(zhì)處理9 d時(shí)聚球藻的抗氧化酶活性。結(jié)果(表4)顯示：25、30和35 mg·L-1苯甲酸處理聚球藻的超氧化物歧化酶(SOD)活性均高于對(duì)照，且隨濃度升高SOD活性逐漸下降，其中，25 mg·L-1苯甲酸處理的SOD活性較對(duì)照升高53.83%，差異達(dá)顯著水平。25 mg·L-1水楊酸處理的SOD活性顯著高于對(duì)照，30 mg·L-1水楊酸處理的SOD活性低于對(duì)照，但差異不顯著。30、40和50 mg·L-1阿魏酸處理的SOD活性高于對(duì)照，且SOD活性隨阿魏酸濃度的升高而升高，分別較對(duì)照升高13.33%、49.58%和61.93%。說明同一濃度水楊酸處理對(duì)聚球藻SOD活性的影響較苯甲酸更強(qiáng)，且二者均強(qiáng)于阿魏酸。

聚球藻的過氧化物酶(POD)活性隨苯甲酸濃度升高而升高，但低濃度(25和30 mg·L-1)苯甲酸處理聚球藻的POD活性與對(duì)照差異不顯著，而35 mg·L-1苯甲酸處理的POD活性較對(duì)照升高24.29%，二者間差異顯著。25 mg·L-1水楊酸處理的POD活性高于對(duì)照，而30 mg·L-1水楊酸處理的POD活性低于對(duì)照，但差異均不顯著。隨阿魏酸濃度升高，聚球藻的POD活性逐漸升高，且40和50 mg·L-1阿魏酸處理的POD活性顯著高于對(duì)照。

聚球藻的過氧化氫酶(CAT)活性隨苯甲酸濃度升高而升高，且30和35 mg·L-1苯甲酸處理的CAT活性顯著高于對(duì)照。25 mg·L-1水楊酸處理的CAT活性較對(duì)照顯著升高，30 mg·L-1水楊酸處理的CAT活性與對(duì)照差異不顯著，與不同濃度水楊酸處理下聚球藻SOD和POD活性的變化趨勢相似。不同濃度阿魏酸處理的CAT活性基本隨其濃度的升高而升高，與SOD和POD活性變化相似，40和50 mg·L-1阿魏酸處理的CAT活性分別較對(duì)照升高55.10%和54.78%，且差異達(dá)顯著水平。

比較3種酚酸類化感物質(zhì)對(duì)聚球藻SOD、POD和CAT活性的影響發(fā)現(xiàn)，25 mg·L-1水楊酸處理聚球藻的3種抗氧化酶活性均高于同一濃度苯甲酸處理，30 mg·L-1水楊酸處理的3種抗氧化酶活性低于同一濃度苯甲酸處理。阿魏酸處理下聚球藻的3種抗氧化酶活性總體上隨其濃度升高而升高。說明3種酚酸類化感物質(zhì)對(duì)聚球藻抗氧化酶活性的影響仍表現(xiàn)為水楊酸最大，苯甲酸次之，阿魏酸最小，與酚酸類化感物質(zhì)對(duì)聚球藻葉綠素a含量、Fo值和Fv/Fm值的影響以及聚球藻的生長響應(yīng)相一致。

對(duì)3種酚酸類化感物質(zhì)濃度與聚球藻細(xì)胞密度、葉綠素a含量、Fo值和Fv/Fm值進(jìn)行曲線擬合，由于酚酸類化感物質(zhì)對(duì)聚球藻的生長存在低促高抑的現(xiàn)象，故采用二項(xiàng)式進(jìn)行曲線擬合。結(jié)果(表5)顯示：3種酚酸類化感物質(zhì)與聚球藻的上述指標(biāo)間均存在較高的濃度依賴關(guān)系，R2值均在0.8以上，其中水楊酸濃度與細(xì)胞密度的曲線方程斜率較小，表明低濃度水楊酸對(duì)聚球藻生長的促進(jìn)效果較弱。

表4 不同濃度酚酸類化感物質(zhì)對(duì)聚球藻抗氧化酶活性的影響

表5 不同酚酸類化感物質(zhì)濃度與聚球藻部分生理指標(biāo)的曲線擬合

3 討 論

本研究中，隨著處理時(shí)間的延長，25 mg·L-1苯甲酸對(duì)聚球藻的生長呈現(xiàn)先抑制后促進(jìn)效應(yīng)，而30 mg·L-1苯甲酸則顯著抑制聚球藻生長；當(dāng)苯甲酸濃度為35和40 mg·L-1時(shí)，可基本阻止聚球藻的生長。當(dāng)水楊酸濃度為25～40 mg·L-1時(shí)，均抑制聚球藻細(xì)胞生長，且抑制效應(yīng)隨水楊酸濃度的升高而增強(qiáng)。聚球藻對(duì)阿魏酸的響應(yīng)濃度較高，在30和40 mg·L-1濃度下聚球藻的生長被明顯促進(jìn)，而在50和60 mg·L-1濃度下其生長基本被阻止，體現(xiàn)為低促高抑現(xiàn)象，這與張庭廷等[14]對(duì)水華魚腥藻和蛋白核小球藻的研究結(jié)果相似。3種酚酸類化感物質(zhì)的抑藻效果由高至低依次為水楊酸、苯甲酸、阿魏酸。較低濃度的苯甲酸(25 mg·L-1)和阿魏酸(30和40 mg·L-1)可促進(jìn)聚球藻的生長，可能是因?yàn)檫@2種酚酸類化感物質(zhì)在低濃度下會(huì)與藻類的興奮受體結(jié)合，促進(jìn)藻細(xì)胞生長[28]，還可能是低濃度酚酸類化感物質(zhì)通過增加酶活性增加了細(xì)胞膜的滲透性，藻細(xì)胞更容易吸收營養(yǎng)物質(zhì)[29]。通常認(rèn)為，酚酸類物質(zhì)的自氧化是其化感作用的主要機(jī)制之一，酚酸類物質(zhì)自氧化會(huì)產(chǎn)生H2O2和醌，H2O2會(huì)造成藻細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，而醌經(jīng)過氧化還原循環(huán)會(huì)產(chǎn)生活性氧，進(jìn)一步影響藻細(xì)胞生長[30-32]。35 mg·L-1苯甲酸、30 mg·L-1水楊酸和50 mg·L-1阿魏酸對(duì)聚球藻生長的抑制效應(yīng)在實(shí)驗(yàn)后期(處理9 d)出現(xiàn)解除和藻細(xì)胞生長恢復(fù)現(xiàn)象，可能是由于培養(yǎng)基中酚酸類化感物質(zhì)濃度因藻細(xì)胞的吸收和自然降解等作用大大降低，導(dǎo)致抑藻效果減弱[33]。

光合作用作為初級(jí)生產(chǎn)者的重要生理過程，為化感物質(zhì)的主要靶點(diǎn)之一[34]。聚球藻是一類光合自養(yǎng)原核生物，葉綠素是其主要的光合色素，化感物質(zhì)能直接破壞藻細(xì)胞葉綠體或通過影響與葉綠素合成相關(guān)物質(zhì)的活性阻礙藻類的葉綠素合成，降低藻細(xì)胞內(nèi)的葉綠素含量[35-37]，亦或?qū)υ寮?xì)胞中捕獲和傳遞光能的輔助功能團(tuán)色素(如藻膽蛋白和別藻藍(lán)蛋白等)造成損害[38]，間接影響藻細(xì)胞光合活性及速率，而葉綠素a含量的降低則會(huì)直接抑制藻類的繁殖和生長[39]。李鋒民等[40]的研究發(fā)現(xiàn)，2-甲基乙酰乙酸乙酯(EMA)會(huì)降解銅綠微囊藻的葉綠素a，使其含量降低，影響銅綠微囊藻的光合作用速率。吳程等[41]研究認(rèn)為，藻膽蛋白是化感物質(zhì)抑制銅綠微囊藻的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一。本研究中，30、35和40 mg·L-1苯甲酸總體顯著降低聚球藻葉綠素a含量，且葉綠素a含量隨苯甲酸濃度的升高而降低，而低濃度苯甲酸(25 mg·L-1)處理的聚球藻葉綠素a含量隨著處理時(shí)間的延長呈逐漸升高的趨勢。然而，25、30、35和40 mg·L-1水楊酸均可顯著降低聚球藻葉綠素a含量。阿魏酸對(duì)聚球藻葉綠素a含量的影響與其對(duì)聚球藻生長的影響基本一致，呈低促高抑的現(xiàn)象?？傮w上看，聚球藻葉綠素a的含量對(duì)酚酸類化感物質(zhì)的響應(yīng)與其生長響應(yīng)相似，表明高濃度酚酸類化感物質(zhì)會(huì)阻礙葉綠素a合成或破壞葉綠體，影響藻膽蛋白等輔助功能團(tuán)色素，從而抑制生長、減少生物量。值得注意的是，35和40 mg·L-1苯甲酸、30 mg·L-1水楊酸以及50和60 mg·L-1阿魏酸處理下的葉綠素a含量在實(shí)驗(yàn)后期回升，說明葉綠素a的合成受阻情況隨培養(yǎng)基中酚酸類化感物質(zhì)濃度的降低而減弱。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)中初始熒光(Fo)是PSⅡ反應(yīng)中心完全開放時(shí)的熒光產(chǎn)量，而PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)代表藻類的潛在光合能力，反映PSⅡ在脅迫條件下的功能狀態(tài)變化[18，27，42]。Fv/Fm值在外部環(huán)境脅迫下顯著降低，說明環(huán)境脅迫會(huì)對(duì)PSⅡ造成損害[43]。Zhao等[44]研究認(rèn)為，桉樹(Eucalyptusgrandis×E.urophylla‘GLGU9’)葉的高濃度提取物處理銅綠微囊藻3 d后，銅綠微囊藻的Fv/Fm值顯著降低。Zhu等[45]研究發(fā)現(xiàn)，穗狀狐尾藻的分泌物焦碚酸和沒食子酸會(huì)造成銅綠微囊藻葉綠素a含量下降，且抑制PSⅡ的活性，阻斷電子在PSⅡ與PSⅠ之間的傳遞。Wang等[46]研究認(rèn)為，3.47和5.17 mmol·L-1阿魏酸可完全抑制銅綠微囊藻的光合能力。本研究中，苯甲酸和阿魏酸對(duì)Fo值的影響呈低促高抑現(xiàn)象，而不同濃度水楊酸處理均顯著降低聚球藻的Fo值，3種酚酸類化感物質(zhì)濃度較高(35和40 mg·L-1苯甲酸、35和40 mg·L-1水楊酸以及50和60 mg·L-1阿魏酸)時(shí)聚球藻的Fv/Fm值顯著降低。說明高濃度酚酸類化感物質(zhì)會(huì)造成聚球藻光系統(tǒng)反應(yīng)中心的損壞，導(dǎo)致其光系統(tǒng)活性受到抑制或破壞。另一方面，3種酚酸類化感物質(zhì)在高濃度處理后期聚球藻的Fo值均出現(xiàn)不同程度回升，與生長響應(yīng)和葉綠素a含量的變化相符合。

抗氧化酶活性的變化可反映藻細(xì)胞所受外界環(huán)境脅迫程度[47-49]，當(dāng)藻類受到外界環(huán)境脅迫時(shí)，抗氧化酶活性隨活性氧的增加而升高，當(dāng)活性氧積累過量時(shí)則下降，且對(duì)胞內(nèi)物質(zhì)造成氧化損傷[50-53]。酚酸類物質(zhì)自氧化還會(huì)產(chǎn)生H2O2和醌，進(jìn)一步造成活性氧的升高，破壞藻細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)與生物大分子[54]。張庭廷等[15]研究認(rèn)為，酚酸類物質(zhì)的自氧化是抑制銅綠微囊藻和蛋白核小球藻的主要機(jī)制之一。高濃度酚酸類物質(zhì)可能直接導(dǎo)致抗氧化酶系統(tǒng)崩潰，進(jìn)而阻止銅綠微囊藻的生長[55]。Hua等[4]發(fā)現(xiàn)，銅綠微囊藻的抗氧化酶活性在暴露于稻草水提物后呈濃度依賴性，且隨著時(shí)間推移先升高后降低。李鋒民等[40]和Hong等[49]研究發(fā)現(xiàn)，銅綠微囊藻細(xì)胞的抗氧化酶活性隨著化感物質(zhì)濃度升高呈現(xiàn)先升高至峰值后降低的趨勢?；ㄣ懙萚56]研究認(rèn)為，鄰苯三酚和咖啡酸能顯著抑制銅綠微囊藻的SOD活性。本研究中，聚球藻的SOD活性隨苯甲酸濃度的升高而降低，但均高于對(duì)照(不添加酚酸類化感物質(zhì))，苯甲酸處理的CAT活性高于阿魏酸處理；SOD、POD和CAT活性均隨水楊酸濃度的升高而降低，說明高濃度水楊酸處理的活性氧積累過量，影響抗氧化酶功能。然而，阿魏酸處理聚球藻的SOD、POD和CAT活性總體呈現(xiàn)隨濃度升高而升高的趨勢，其中50 mg·L-1阿魏酸處理的3個(gè)抗氧化酶活性仍較對(duì)照顯著升高，并未出現(xiàn)下降，未造成抗氧化酶功能的破壞，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，50 mg·L-1阿魏酸是通過抑制聚球藻細(xì)胞分裂而抑制其生長?？傮w上看，聚球藻抗氧化酶體系對(duì)3種酚酸類化感物質(zhì)的敏感程度由高到低依次為水楊酸、苯甲酸、阿魏酸。

化感物質(zhì)脅迫會(huì)造成藻細(xì)胞膜完整性下降，細(xì)胞內(nèi)容物大量滲出[57]，抑制藻類生長，最終導(dǎo)致死亡，因此，細(xì)胞膜是化感物質(zhì)抑藻的主要部位之一。臭椿〔Ailanthusaltissima(Mill.) Swingle〕提取物和稻草水提物可引起銅綠微囊藻形態(tài)的明顯改變以及細(xì)胞破裂和內(nèi)容物外泄[4，58]。酚酸類物質(zhì)自氧化產(chǎn)生的H2O2和醌還會(huì)進(jìn)一步造成細(xì)胞膜的損傷和通透性增加[30]。李鋒民等[59]研究發(fā)現(xiàn)，EMA會(huì)造成銅綠微囊藻和蛋白核小球藻的細(xì)胞膜破裂和內(nèi)容物滲出，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)遭到破壞和解體。張庭廷等[17]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)羥基苯甲酸會(huì)造成銅綠微囊藻細(xì)胞膜的破裂和溶解，且破碎藻細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)絮凝現(xiàn)象。本研究中，在酚酸類化感物質(zhì)脅迫下，聚球藻細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞周圍出現(xiàn)大量的絮狀物為外滲的內(nèi)容物或吸附的添加物，藻細(xì)胞還出現(xiàn)聚團(tuán)現(xiàn)象，因此對(duì)細(xì)胞膜的破壞和通透性的改變，也是酚酸類化感物質(zhì)抑藻的機(jī)制之一。

4 結(jié)論和展望

本研究中，酚酸類化感物質(zhì)對(duì)聚球藻的生長抑制效應(yīng)由高至低依次為水楊酸、苯甲酸、阿魏酸。3種酚酸類化感物質(zhì)一方面可通過阻礙聚球藻葉綠素a合成和抑制PSⅡ活性來抑制藻細(xì)胞的繁殖生長，另一方面可通過減少細(xì)胞分裂、破裂細(xì)胞膜、增加胞外絮狀分泌物等途徑抑制或阻止藻細(xì)胞的繁殖。聚球藻抗氧化酶體系對(duì)3種酚酸類化感物質(zhì)的敏感程度與其生長抑制效應(yīng)一致，但不同的抗氧化酶(SOD、POD和CAT)對(duì)不同種類和濃度的酚酸類化感物質(zhì)的響應(yīng)存在差異，其中，SOD活性隨苯甲酸和水楊酸濃度的升高而降低，POD和CAT活性卻隨苯甲酸濃度的升高而升高，隨水楊酸濃度的升高而降低，而SOD、POD和CAT活性基本隨阿魏酸濃度的升高而升高，這一方面可能與處理時(shí)間有關(guān)，由于實(shí)驗(yàn)后期(處理6～9 d)化感效應(yīng)減弱，聚球藻恢復(fù)生長，從而導(dǎo)致不同抗氧化酶活性的變化，另一方面也可能與不同抗氧化酶的基因或蛋白質(zhì)表達(dá)以及相關(guān)調(diào)控因子有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步的研究。