余慧玲 林升祿 吳雪梅

（1 福建省老年醫(yī)院藥劑科，福建 福州 350001；2 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院藥學(xué)部，福建 福州 350001）

白消安（Busulfan）聯(lián)合環(huán)磷酰胺、氟達(dá)拉濱等以白消安為基礎(chǔ)的預(yù)處理方案廣泛應(yīng)用于造血干細(xì)胞移植（haematopoietic stem cell transplantation，HSCT）前的預(yù)處理過程。白消安作為細(xì)胞周期非特異性的雙功能烷化劑，治療窗窄，對(duì)體內(nèi)正常細(xì)胞損傷也很大，容易發(fā)生急慢性肝損傷等不良反應(yīng)，更嚴(yán)重的如肝靜脈閉塞癥（hepatic veno-occlusive disease，HVOD）則可能致命[1]。白消安主要在肝臟內(nèi)經(jīng)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathiones transferases，GSTs）催化與谷胱甘肽結(jié)合后代謝[2]。而GSTA1是肝臟GST酶家族中含量最多的一種，常依據(jù)其啟動(dòng)子區(qū)3個(gè)連鎖位點(diǎn)的堿基突變（-52位G→A、-69位C→T、-567位T→G），分為GSTA1*A和*B等位基因，GSTA1*B等位基因因突變致啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性降低，致GSTA1酶蛋白表達(dá)水平下降，表現(xiàn)為GSTs對(duì)相應(yīng)底物的解毒能力及其保護(hù)組織細(xì)胞抵御損傷的能力降低[3]，提示其可能與預(yù)處理過程常見的肝損傷并發(fā)癥的發(fā)生有關(guān)。已有研究表明抗結(jié)核藥所致肝損傷與該位點(diǎn)的多態(tài)性密切相關(guān)[4]。故本研究收集了115例以白消安為基礎(chǔ)預(yù)處理的HSCT患者為對(duì)象，考察該人群中二者的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2014年3月至2018年5月收治于福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院血液科，接受Ara-c/Flu/Bu/Cy、Ara-c/Bu/Cy、Flu/Bu等以白消安為基礎(chǔ)的方案進(jìn)行預(yù)處理的漢族HSCT患者115例；其中白消安的給藥劑量基于患者調(diào)整后的理想體質(zhì)量計(jì)算：0.8 mg/kg，q6h×4 d，微注泵推注2 h；所有患者預(yù)處理前肝腎功能均基本正常，并于預(yù)處理期間常規(guī)使用谷胱甘肽聯(lián)合小分子肝素預(yù)防HVOD，使用環(huán)孢素和甲氨喋呤預(yù)防移植物抗宿主病的發(fā)生。該方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批同意；患者或家屬知情并同意后方可執(zhí)行。

1.2 儀器和試劑 Veriti DX Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），OSE470藍(lán)光切膠儀（天根生化科技公司），PS100電泳儀（上海天能公司），EasyPrue Blood Genomic DNA Kit、瓊脂糖Agorose、染料Gelstain、6xDNA Loading Buffer、EasyTaq DNAPolymerrase、dNTPs、MgSO4、10x EasyTaq Buffer（北京全式金生物公司），F(xiàn)D EarⅠ、FD Buffer（賽默飛公司）。

1.3 DNA提取 采集患者靜脈血2 mL，EDTA抗凝，嚴(yán)格按基因組提取試劑盒說明書操作。

1.4 GSTA1基因型測(cè)定 PCR反應(yīng)體系參考課題組前期研究結(jié)果（20 μL）[5]：上游引物序列為5'-GCATCAGCTTGCCCTTCA-3'，下游序列為5'-AAACGCTGTCACCGTCCTG-3'，該引物對(duì)委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成并檢測(cè)；設(shè)計(jì)總反應(yīng)體系為20 μL，其中含4U DNA聚合酶、9 ng模板DNA、2.5 mmol/L MgSO4、0.1 mmol/L dNTPs、0.4 μmol/L上下游引物，余量用去離子水補(bǔ)足。擴(kuò)增程序設(shè)為：先94 ℃預(yù)變性7 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共往復(fù)循環(huán)35次；最后一次循環(huán)結(jié)束后再72 ℃延伸7 min，后4 ℃保存；酶切反應(yīng)體系（30 μL）：PCR純化產(chǎn)物12 μL，F(xiàn)D EarⅠ 5U 1 μL，Buffer 2 μL，余量用去離子水補(bǔ)足，在37 ℃水浴鍋中酶切30 min；瓊脂糖凝膠電泳：膠染法制備2%瓊脂糖凝膠，取5 μL酶消化產(chǎn)物和1 μL 6×Loading Buffer 混勻后上樣，電泳條件均為電壓5 V/cm，電泳時(shí)間20 min，用藍(lán)光切膠儀觀察；結(jié)果判定：只有1條401bp片段的判定為野生型，同時(shí)有401bp、308bp、93bp 3條片段的判定為雜合型，同時(shí)有308bp、93bp 2條片段的判定為純突變型。

1.5 GSTA1基因型測(cè)定驗(yàn)證 隨機(jī)抽取部分樣本采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法（MALDI-TOF-MS）對(duì)上述測(cè)定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，上游引物序列為5'-ACGTTGGATGCTTAGAATCCAGT AGGTGGC-3'，下游引物序列為5'-GCTTTTCCCTAACTTGAC-3'，延伸引物序列為5'-ACGTTGGATGCCTCTCAATAGTTCTCTC CC-3'[6]，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，具體檢測(cè)委托森廣生物科技（北京）有限公司完成。圖1為2條等位基因該位點(diǎn)堿基序列均為C即基因型為野生型的質(zhì)譜峰圖，圖2為2條等位基因該位點(diǎn)堿基序列分別為C和T即基因型為雜合型的質(zhì)譜峰圖。

圖1 GSTA1基因?yàn)橐吧蜁r(shí)的質(zhì)譜峰圖

圖2 GSTA1基因?yàn)殡s合突變型時(shí)的質(zhì)譜峰圖

1.6 急性肝損傷判定 參照《急性藥物性肝損傷診治建議（草案）》，觀察患者在預(yù)處理及行造血干細(xì)胞移植住院期間，至少發(fā)生有一次以上ALT或DBIL值達(dá)正常值上限2倍以上或者AST、ALP、TBIL同時(shí)上升且至少1項(xiàng)達(dá)正常值上限2倍以上的，判斷為急性肝損傷。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析方法 采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，并采用χ2檢驗(yàn)，基因多態(tài)性對(duì)急性肝損傷發(fā)生的影響以相對(duì)危險(xiǎn)度（RR）、95%置信區(qū)間（CI）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 最終共有115例HSCT患者納入本次研究：男性71例（61.7%），女性44例（38.3%）；年齡（28.20±15.61）歲；急性髓性白血?。ˋML）57例（49.6%），急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）31例（33.0%），慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）6例（5.2%），再生障礙性貧血（AA）7例（6.1%），骨髓增生異常綜合征（MDS）5例（4.3%），多發(fā)性骨髓瘤（MM）2例（1.7%）；肝功正常93例（80.9%），出現(xiàn)急性肝損傷22例（19.1%）。

2.2 GSTA1基因分布情況及Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 本研究人群的GSTA1基因分布情況見表1，Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果P＞0.05說明本研究人群具有群體代表性。

表1 GSTA1 C-69T（rs3957357）位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)[n（%）]

2.3 GSTA1 基因多態(tài)性與急性肝損傷的相關(guān)性 攜帶GSTA1*A/*B（雜合型）的患者急性肝損傷的發(fā)生率顯著高于攜帶GSTA1*A/*A（野生型）的患者（P＜0.05）。見表2。

表2 GSTA1基因型與急性肝損傷發(fā)生的相關(guān)性

3 討論

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GSTs）是體內(nèi)重要的Ⅱ相代謝酶，其功能主要是催化內(nèi)源性或外源性親電性有害物與谷胱甘肽結(jié)合，增加疏水性以便穿透細(xì)胞膜后排出體外或進(jìn)入Ⅲ相反應(yīng)，發(fā)揮解毒功效[7]；同時(shí)部分GSTs具有過氧化物酶和異構(gòu)酶活性，可分解脂質(zhì)過氧化物，在細(xì)胞中發(fā)揮抗氧化、抗損傷作用[8]。人類的GSTs主要以可溶性的二聚體的形式分布于各組織細(xì)胞液中，且主要在肝臟，由分布于多條染色體的一個(gè)超基因家族編碼，少部分以膜結(jié)合蛋白的形式分布微粒體膜，由另一個(gè)超級(jí)因基因家族編碼。依據(jù)亞基結(jié)構(gòu)、氨基酸序列底物特異性、免疫原性等特點(diǎn)，胞液中的GSTs可分7大類：Alpha（α）、Mu（μ）、Pi（π）、Theta（Θ）、Sigma（σ）、Omega（ω）、Zeta（ξ），另有只存在于線粒體中的Kappa（K）類GSTs[9]。其中Alpha類（GSTA）在肝臟中含量最多（約75%）的GSTs，而GSTA1又在Alpha類中占比最高（約45%），可見GSTA1是肝臟內(nèi)含量最高的GST同工酶，故其基因的表達(dá)水平可能顯著影響肝臟GST酶的總體活性，進(jìn)而影響肝臟整體二相代謝及抗損傷的能力。

目前研究已發(fā)現(xiàn)GSTA1基因啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)，可引起啟動(dòng)子活性的改變進(jìn)而影響GSTA1基因的表達(dá)水平。其中-52、-69位點(diǎn)的突變可引起轉(zhuǎn)錄因子Sp1與啟動(dòng)子的選擇性結(jié)合水平的降低下調(diào)GSTA1的表達(dá)，對(duì)GSTA1表達(dá)的影響最大，而連鎖突變的-567位點(diǎn)的突變則引起轉(zhuǎn)錄因子GATA1與啟動(dòng)子結(jié)合水平的降低協(xié)同前二位點(diǎn)的下調(diào)表達(dá)作用[10]。因此基于這3個(gè)連鎖位點(diǎn)的GSTA1基因的多態(tài)性（分為*A和*B等位基因）對(duì)Alpha類GSTs酶以至肝臟整體GSTs酶活性水平的影響最大。已有研究表明GSTA1*A/*B的GST酶活性顯著低于GSTA1*A/*A，顯著高于GSTA1*B/*B，而GSTM1缺失與否對(duì)GST酶活性無顯著影響[11]。目前關(guān)于白消安的藥物基因組學(xué)研究多數(shù)認(rèn)為攜帶GSTA 1*B等位基因會(huì)導(dǎo)致白消安清除率顯著下降[12]，提示GSTA1基因?qū)Π紫驳拇x影響較大。

藥物所致肝損傷的發(fā)生主要由藥物和肝臟相應(yīng)Ⅰ相、Ⅱ相、Ⅲ相代謝酶的種類、活性水平、肝細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化損傷水平、個(gè)體對(duì)藥物及代謝物的免疫應(yīng)激水平的匹配失衡所致，這些又與藥物的劑量及個(gè)體的相關(guān)代謝酶或信號(hào)分子的基因多態(tài)性緊密相關(guān)[13]。白消安主要在肝臟經(jīng)GSTs代謝，而預(yù)處理所使用白消安的劑量較大，短期在肝臟的蓄積量極有可能超出肝臟GSTs酶的Ⅱ相代謝能力和對(duì)脂質(zhì)過氧化物的代謝能力，從而導(dǎo)致肝損傷。

本研究結(jié)果顯示GSTA1*A/*B患者發(fā)生急性藥物肝損傷的風(fēng)險(xiǎn)是GSTA1*A/*A患者的2.416倍（95%CI：1.160-5.032，P=0.022），考慮到上述GSTA1基因-52、-69、-567位點(diǎn)的多態(tài)性與GSTs的整體活性相關(guān)性，上述分析能較好的解釋該結(jié)果。Ansari等[14]研究發(fā)現(xiàn)GSTs低代謝表型患者（主要為GSTA1*B等位基因攜帶者）肝竇阻塞綜合征（SOS）的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)大為增加；Terakura等[15]研究發(fā)現(xiàn)GSTA1*B攜帶者給予第1劑白消安后的AUC（AUC1st）顯著高于GSTA1*A/*A，而較高AUC1st水平的患者移植期間血清總膽紅素水平顯著較高；這些均提示攜帶GSTA1*B等位基因增加白消安為基礎(chǔ)預(yù)處理方案所致肝毒性風(fēng)險(xiǎn)，可與本研究結(jié)果相佐證。而課題組前期研究未發(fā)現(xiàn)GSTT1、M1多態(tài)性與急性肝損傷相關(guān)性，這可能與GSTT1、M1多態(tài)性對(duì)總GSTs活性影響有限有關(guān)，也反映出GSTA1基因多態(tài)性對(duì)急性肝損傷的主要影響作用[16]。因此，有必要并對(duì)攜帶GSTA1*B等位基因的患者的肝功能加強(qiáng)監(jiān)測(cè)和保護(hù)。

但GSTA1的活性水平除受GSTA1基因多態(tài)性影響外，還受多條信號(hào)通路的調(diào)控，有研究表明鉛暴露可通過NF-κB信號(hào)通路下調(diào)GSTA1表達(dá)[17]，而JNK抑制劑則可通過JNK信號(hào)通路上調(diào)GSTA1的表達(dá)[18]；加之GSTs的種類繁多，對(duì)于同一底物，不同種類的GSTs之間可能存在代償調(diào)節(jié)，可見GSTs總體活性影響因素的復(fù)雜性。而GSTs酶活性太低容易發(fā)生肝損傷及其他不良反應(yīng)，而太高又可導(dǎo)致白消安清除過快影響療效，故有必要對(duì)白消安實(shí)行個(gè)體化給藥，而進(jìn)一步的擴(kuò)大樣本量研究以確認(rèn)定量關(guān)系將具有較大臨床意義。