余涵

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430000)

0 引言

急性胰腺炎是臨床常見的消化內(nèi)科疾病，主要是胰酶被激活后引起胰腺組織自身消化而導(dǎo)致癥反應(yīng)[1]。臨床以急性上腹痛、惡心、嘔吐、發(fā)熱和血胰酶增高等為特點。病變程度輕重不等，臨床病理常把急性胰腺炎分為輕度急性胰腺炎、中度急性胰腺炎及重度急性胰腺炎。臨床上，大多數(shù)患者的病程呈自限性，20%～30%患者臨床經(jīng)過兇險，總體病死率5%～10%。中國急性胰腺炎診治指南2019年版指出MAP的治療以禁食、抑酸、抑酶及補液治療為主，補液只要補充每天的生理需要量即可，一般不需要進行腸內(nèi)營養(yǎng)[2]。對于MSAP及SAP需要采取器官功能維護、應(yīng)用抑制胰腺外分泌和胰酶的抑制劑、早期腸內(nèi)營養(yǎng)、合理使用抗菌藥物、處理局部及全身并發(fā)癥、鎮(zhèn)痛等措施。中醫(yī)多以癥狀命名，故急性胰腺炎無中醫(yī)專屬名稱[3]。根據(jù)古人對胰腺及類似急性胰腺炎癥狀的描述，現(xiàn)在人們多把急性胰腺炎歸為“腹痛”“脾心痛”“脾實”和“結(jié)胸”來進行研究。中醫(yī)認為感受六淫之邪、飲食不潔(醇酒肥甘)、情志不舒、膽石、蟲積、創(chuàng)傷等因素是急性胰腺炎的主要病因，基本病機為氣、濕、熱結(jié)聚不散則釀生熱毒，熱毒熾盛又易致血熱妄行而致血瘀，熱毒血瘀互結(jié)，腑氣不通[4]。中醫(yī)藥治療急性胰腺炎途徑多，可以有效減少復(fù)發(fā)，副作用相對較小[5]。

大黃為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatumL.>唐古特大黃 Rheu tanguticum Maxim.exBalf. 或藥用植物大黃 Rheum officinale Baill. 的干燥根或根莖。性味歸經(jīng)：苦，寒，歸脾胃、大腸、肝、心包經(jīng)。功效：瀉下攻積，清熱瀉火，涼血解毒，逐瘀通經(jīng)，利濕退黃[6]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，大黃內(nèi)含番瀉苷A、大黃酸蒽酮苷和大黃酸蒽酮等多種成分[7]。Wan B等[8]提出番瀉苷A具有刺激腸蠕動、促進腸液分泌、增強腸張力、軟化大便、改善腸麻痹、促進排氣、排便的作用；Yao P等[9]認為大黃通過松弛oddi括約肌達到促進胰液及膽汁的排泄功能，可有效緩解患者腹痛、腹脹，縮短血清淀粉酶恢復(fù)時間。大黃酸蒽酮苷和大黃酸蒽酮可在小腸吸收，經(jīng)肝臟轉(zhuǎn)化作用于骨盆神經(jīng)叢和黏膜神經(jīng)叢，使腸蠕動增加，進而達到導(dǎo)瀉、減少腸道內(nèi)細菌移位、下調(diào)炎癥相關(guān)因子表達的功效[10]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可結(jié)合海量數(shù)據(jù)庫[11](DrugBank、STITCH、ChEMBL、OMIM、KEGG、TCMID、TCMSP等數(shù)據(jù)庫)可研究藥物、靶標和疾病之間的關(guān)系，可通過整合中藥化學(xué)成分、疾病靶標構(gòu)建“化學(xué)成分-作用靶標-疾病靶標-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)”[12]。將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)應(yīng)用于中藥復(fù)方的研究，既反應(yīng)了大數(shù)時代生物醫(yī)藥系統(tǒng)性研究的新趨勢，又適應(yīng)了中醫(yī)藥對系統(tǒng)性研究方法的需求，且能很好地與我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥結(jié)合而體現(xiàn)其原創(chuàng)性[13]。在此運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討大黃輔治AP的作用機制，為今后中藥治療AP提供思路和方向。

1 資料與方法

1.1 藥物中活性成分及藥物靶點的篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/)，檢 索 大 黃 的 化 學(xué) 成分，通過口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)及類藥性(Drug-likeness，DL)的篩選條件(OB≥30%，DL≥0.18)進行篩選。篩選出符合條件的化學(xué)成分作為活性成分并得到相關(guān)靶點，借助疾病靶點標準化數(shù)據(jù)庫(Universal protein，UniProt)(https://www.uniprot.org/)查詢相關(guān)靶點對應(yīng)的基因名。

1.2 藥物活性成分-靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將大黃的活性成分及相關(guān)靶點，上傳至網(wǎng)絡(luò)可視化軟件Cytoscape (V3.7.1)(http://www.cytoscape.org/)構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.3 疾病靶點的檢索及活性成分-疾病共有靶點的篩選

通過Genecard 數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)以“Acute pancreatitis”為關(guān)鍵詞檢索目前已報道的與急性胰腺炎相關(guān)的靶點基因。將“1.1”項中活性成分靶點基因與“1.3”中疾病靶點基因分別輸入韋恩圖網(wǎng)站(http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html)，得到的重合靶點即為“大黃”治療急性胰腺炎的潛在靶點。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(Protein-protein interaction,PPI)的構(gòu)建

將篩選得到的潛在靶點導(dǎo)入String (https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫，選擇“multiple proteins”模式，蛋白種屬設(shè)置為“Home sapiens”，最小互作分數(shù)值為0.4，其余參數(shù)保持不變，得到PPI相互作用關(guān)系圖，保存其TSV格式文件。

1.5 GO富集分析和KEGG富集分析

將共同靶標同時導(dǎo)入Metascape生物分子功能注釋系統(tǒng)(www.metascape.org/)進行GO基因本體功能和KEGG通路富集分析，設(shè)置P Value Cutoff為0.01，選擇生物過程(Biological Processes)、分子功能(Molecular Functions)、細胞組成(Cellular Components)、KEGG通路(KEGG Pathway)進行富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大黃化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)

由TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索“大黃”，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18作為檢索條件并進行篩選后，得到的大黃活性成分為16個，見表1。將這16個活性成分經(jīng)由TCMSP查詢成分相關(guān)靶點，去重后共得到62個相關(guān)靶點。借助Uniprot數(shù)據(jù)庫查詢相關(guān)靶點的基因名。

2.2 藥物活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將得到的16個活性成分及62個相對應(yīng)的靶點關(guān)系保存為EXCEL文件，通過可視化軟件Cytoscape3.7.1構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，得到“大黃”的活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，共得到78個節(jié)點，見圖1。

圖1 “大黃”活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 疾病靶點的檢索及活性成分-疾病共有靶點的篩選

通過Genecards 數(shù)據(jù)庫檢索“Acute pancreatitis”，得到922個急性胰腺炎相關(guān)的基因。將活性成分靶點基因與急性胰腺炎相關(guān)基因通過韋恩圖得到兩者交集，共有靶點為21個，即為“大黃”治療急性胰腺炎的潛在靶點。韋恩圖如圖2。

圖2 韋恩圖

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建及核心靶點的篩選

將“大黃”治療急性胰腺炎21個潛在靶點輸入String數(shù)據(jù)庫，得到靶點間的相互作用關(guān)系圖，運用Cytoscape 3.7.1軟件圖構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖(如圖3)，其中共有21個節(jié)點和90條邊，平均節(jié)點度值8.57，經(jīng)過網(wǎng)絡(luò)拓撲分析篩選出11個核心靶點，包括環(huán)加氧酶2(PTGS2)、腫瘤壞死因子(TNF)、周期素依賴性激酶抑制因子1B (CDKN1B)、CHEK1等，提示以上靶點是大黃治療急性胰腺炎的核心靶點，如圖3。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 GO富集分析

2.5 通路富集分析

將核心靶點導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫中進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，其中得到了GO分析14個富集條目，主要涉及生物過程(Biological Processes)7個，如積極調(diào)控細胞死亡(positive regulation of cell death)、神經(jīng)元死亡的積極調(diào)控(positive regulation of neuron death)、DNA損傷反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction in response to DNA damage)、調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞增殖(regulation of vascular smooth muscle cell proliferation)等，分子功能(Molecular Functions)5個，如半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡信號通路(cysteinetype endopeptidase activity involved in apoptotic signaling pathway)、細胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑活性(cyclin-dependent protein serine/threonine kinase inhibitor activity)、蛋白激酶結(jié)合(protein kinase binding)、泛素蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin protein ligase binding)等，細胞組成(Cellular Components)2個，膜筏(membrane raft)、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體(transferase complex)。大黃治療急性胰腺炎的核心靶點GO富集分析如圖，從上至下分別為BP、MF、CC。

由KEGG富集分析結(jié)果可知，大黃治療急性胰腺炎的核心基因富集的通路有9條，主要通路涉及乙型肝炎通路、癌癥途徑通路、P53信號通路、IL-17信號通路、內(nèi)分泌抵抗通路及癌癥中蛋白聚糖通路等，見圖5。

圖5 KEGG富集分析

3 討論與結(jié)論

Peery AF等[14]人在2015年發(fā)表的文章指出，在美國，AP在因消化病而收入院的患者中排名第3。每年有超過275000例患者因AP收入院，其中超過2000例死亡，造成的直接經(jīng)濟損失高達26億美元。在過去30年中，AP發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢，但發(fā)病率的上升可能與影像診斷技術(shù)的提高有一定關(guān)系[15]。AP發(fā)病的病因主要為以膽源性為主，其次是酒精和高脂血癥。AP的總體死亡率較低，不到1%，但SAP死亡率較輕癥明顯上升，18%～40%不等，高齡是AP病人死亡的獨立危險因素。大黃始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，原文中如此記載“下瘀血，血閉寒熱，破癥瘕積聚，留飲宿食，蕩滌腸胃，推陳致新，通利水谷，調(diào)中化食，安和五臟”[16]。有學(xué)者指出急性胰腺炎多屬于氣機不暢，實熱壅結(jié)的里熱實證，根據(jù)“六腑以通為用”的原則，治療多以清里攻下法，大黃兼有清熱、逐淤、瀉下功能，故能以此治療急性胰腺炎。

本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫的OB和DL篩選出大黃16個活性成分，對應(yīng)21個AP靶點，通過富集分析得到9條信號通路。網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示大黃可能通過PTGS2、TNF、CDKN1B、CHEK1等靶點發(fā)揮治療AP的作用。由KEGG富集分析可知，核心靶點主要調(diào)控p53信號通路、小細胞肺癌信號通路、IL-17信號通路等，p53通路涉及腫瘤抑制，調(diào)節(jié)各種基因的表達，包括細胞凋亡、生長抑制、抑制細胞周期進程、分化和加速DNA修復(fù)，基因毒性和細胞應(yīng)激后的衰老等重要的生物進程，p53可促進Bax、抑制Bcl-2表達，誘導(dǎo)細胞凋亡。而激活p53信號通路可誘導(dǎo)細胞凋亡，加速細胞應(yīng)激后的衰老[17]。IL-17可以直接或間接誘導(dǎo)多種細胞因子、趨化因子、炎癥因子和抗微生物蛋白來識別介導(dǎo)自身免疫和慢性感染的靶基因IL-17可以直接或間接誘導(dǎo)多種細胞因子、趨化因子、炎癥因子和抗微生物蛋白來識別介導(dǎo)自身免疫和慢性感染的靶基因。IL-17可以被認為與機體的多種炎癥反應(yīng)相關(guān)，Kondo S[18]研究指出IL-17是急性胰腺炎病情加重的關(guān)鍵機制之一。因此通過抑制IL-17信號通路進而減少AP進展中的炎性因子表達。

綜上，中藥及其復(fù)方具有多成分、多途徑、多靶點協(xié)同作用的特點。近10年來，隨著現(xiàn)代基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等“組學(xué)”理論的發(fā)展，系統(tǒng)生物學(xué)視角的引入以及生物信息學(xué)的應(yīng)用[19]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)(network pharmacology)概念應(yīng)運而生，它是在系統(tǒng)生物學(xué)與計算機技術(shù)高速發(fā)展的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上，通過網(wǎng)絡(luò)分析，系統(tǒng)綜合地觀察藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，揭示多分子藥物協(xié)同作用于人體的奧秘[20]。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究大黃治療急性胰腺炎的具體作用靶點及機制，望對未來臨床運用大黃治療急性胰腺炎有一定的指導(dǎo)作用[21]。