韓 聰 徐 力 曾文玉 辜文艷 劉 慶△

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院1 疼痛科；2 手術(shù)室，瀘州646000）

紫杉醇 (paclitaxel, PTX) 是屬于紫杉烷類的一種天然生物堿，目前作為臨床一線廣譜使用的抗腫瘤藥物，抗腫瘤療效較好，已被大量應(yīng)用于癌癥病人救治[1]。紫杉醇能夠控制微管蛋白發(fā)生聚合，保持微管蛋白的穩(wěn)定性，抑制細胞有絲分裂進而抑制惡性腫瘤細胞的增殖從而達到治療效果[2]。但是，目前仍存在著許多臨床問題，在治療過程中表現(xiàn)的藥物神經(jīng)毒性問題仍未得到解決，病人會在治療后數(shù)月或者數(shù)年持續(xù)存在神經(jīng)病理性疼痛通常是由藥物造成的感覺系統(tǒng)損傷引起的[3]。這種劇烈的疼痛給病人帶來身體和精神上巨大的痛苦，已經(jīng)成為紫杉醇在治療腫瘤方面存在的不容忽視的健康問題[4]。

MicroRNA (miRNA) 通常是具由19～25 個核苷酸組成的高度保守非編碼小分子單鏈RNA[5]。MicroRNA 在外周神經(jīng)具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性參與和維持慢性神經(jīng)病理性疼痛的作用，如過表達的miR-7a對大鼠神經(jīng)病理性疼痛具有保護作用[6]。背根神經(jīng)節(jié)是感覺傳導(dǎo)的初級神經(jīng)元，在疼痛的外周發(fā)病機制中有著不可忽視的作用[7]。miR-99b-5p 能夠參與腫瘤和關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程，同時miR-99b-5p 也能調(diào)控Akt/mTOR/STAT3 信號通路修復(fù)脊髓損傷[8]。agomir-99b-5p 是經(jīng)過特殊化學(xué)修飾的miR-99b-5p 激動劑，可直接注射于動物體內(nèi)。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)成纖維細胞生長因子受體3 (fibroblast growth factor receptor 3, FGFR3)的3'-非編碼區(qū) (3'-untranslated region,3'-UTR)是miR-99b-5p 潛在靶點。FGFR3 是成纖維細胞生長因子受體家族成員(FGFR1-4)之一，作為一種酪氨酸激酶受體，包含了配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域[9]。FGFR3在與配體（如FGF2/9/18）結(jié)合后，其酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)區(qū)發(fā)生磷酸化，進而激活下游RAS-MAPK、PI3K-AKT、MEK/ERK、PLCγ 和STAT 等胞內(nèi)信號通路[10,11]。這些信號通路與炎癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，同時，促炎因子TNF-α、IL-1β 及IL-6 通過增強興奮性電流、抑制抑制性電流、促進NMDA 釋放興奮遞質(zhì)谷氨酸等影響神經(jīng)病理性疼痛[12]。因此，通過本研究可獲得miR-99b-5p 過表達可能通過負向調(diào)控FGFR3 表達，從而抑制炎性反應(yīng)，進而改善神經(jīng)痛行為的實驗數(shù)據(jù)，形成miR-99b-5p作為化療藥物毒副作用治療靶點的理論體系。

方 法

1.實驗材料

紫杉醇針劑購買于海南中化聯(lián)合藥業(yè)；雙報告基因檢測試劑盒購買于上海翊圣生物科技公司。Trizol 和RT-qPCR 試劑盒（反轉(zhuǎn)加定量）購買于日本TAKARA 公司；FGFR3 抗體購買于ABCAM(ab231442)公司。h-FGFR3 雙熒光載體構(gòu)建于上海生工生物科技有限公司。

2. 方法

（1）實驗動物飼養(yǎng)及模型建立：本實驗動物進行的研究行為均嚴格遵守相關(guān)動物保護及使用規(guī)定，并已通過西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物福利倫理委員會批準（SWMU20210385）。雄性SPF 級大鼠，8周齡，體重220±30 g，購買于達碩動物實驗中心，生產(chǎn)許可證編號：SCXK（川）2020-030。選擇10只SPF 級大鼠分為空白組和模型組，模型組采用腹腔隔日注射紫杉醇（2 mg/kg，共4 次）的方法制備紫杉醇誘導(dǎo)慢性神經(jīng)病理性疼痛小鼠模型，空白組注射等體積無紫杉醇藥物溶劑，進行預(yù)實驗，檢測大鼠miR-99b-5p 和FGFR3 的變化以及行為學(xué)的改變。預(yù)實驗結(jié)束后再選擇32 只SPF 級大鼠作為研究對象，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，大鼠按照簡單隨機化的方法隨機分為空白組 (blank)、紫杉醇模型組(model)、agomiR-99b-5p 治 療 組 和agomiR-NC 對照組，每組8 只。

按照預(yù)實驗方法進行模型建立，在藥物注射后相同時間點每日尾靜脈注射agomiR-99b-5p 和agomiR-NC，在實驗最后一次注射agomiR-99b-5p和agomiR-NC 后，當(dāng)日1 h 和3 h 分別檢測各組大鼠后足機械縮足反射閾值 (mechanical withdrawal threshold, MWT) 和熱縮足反射潛伏期 (thermal withdrawal latency, TWL)。完成行為學(xué)試驗后處死大鼠，收集各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)，用RT-qPCR 法檢測背根神經(jīng)節(jié)中miR-99b-5p、TNF-α、IL-6 及IL-1β 含量，Western Blot 檢測FGFR3 表達。

（2）行為學(xué)測定：使用vonFrey 纖維絲推算大鼠50%縮足閾值：透明有機玻璃箱 (22 cm×12 cm×22 cm)安置在40 cm 高的金屬篩網(wǎng)上，大鼠置于箱內(nèi)安靜適應(yīng)15 min，使用vonFrey 纖維絲垂直刺激大鼠右側(cè)后肢足底中部，持續(xù)時間6～8 s，大鼠表現(xiàn)為抬足或舔足被判定為陽性反應(yīng)，相反則為陰性。最大刺激克數(shù)為15 g，大于15 g 時也記為15 g，每次刺激間隔30 s。首先從2 g 纖維絲刺激開始，當(dāng)該力度刺激不能造成陽性反應(yīng)，則使用相鄰大一級力度的刺激，如出現(xiàn)陽性反應(yīng)則使用相鄰小一級力度的刺激，連續(xù)操作，直到第1 次陽性反應(yīng)出現(xiàn)為止，再連續(xù)測試4 次。使用熱輻射法測定大鼠TWL，將有機玻璃箱置于3 mm 厚的玻璃板上，對大鼠右側(cè)后肢足底使用輻射熱測痛儀照射，測試前大鼠安靜適應(yīng)15 min。以5 mm 光斑照射大鼠右側(cè)第一足趾下著力點開始計時，直至大鼠出現(xiàn)抬腿回避時為一次有效數(shù)據(jù)。為防止大鼠足底灼傷，自動切斷時間為20 s。熱刺激強度在實驗過程中維持一致。每只大鼠測定6 次，每5 min 測試1 次，去掉最大值和最小值，取4 次測量的平均值作為TWL。

（3）RT-qPCR 實驗：用Trizol 試劑盒提取大鼠背根神經(jīng)節(jié)mRNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。嚴格按照試劑盒要求進行實時熒光定量操作，GAPDH 作為內(nèi)參。2-ΔΔCt法計算目的基因的表達量。miR-99b-5p 的引物由miRBASE 數(shù)據(jù)庫獲得成熟序列，采用加尾法設(shè)計獲得，其他引物由文獻獲得并在NCBI Primerblast 進行驗證后由上海生工生物合成科技有限公司采用PAGE 技術(shù)合成。引物miR-99b-5p: 5'-CACCCGTAGAACCGACCTTGCG-3', 5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'; U6: 5'-CTCGCTTCGCTTCGGCAGCACA-3', 5'-AACGCTTGAGGAATTTGCGT-3'; IL-1β: 5'-CGACAAGAGCTTCAGGAAGGCAGTG-3', 5'-TGGGTCAGACAGCACAGG CATTT-3'; IL-6: 5'-CCGCAAGAGACTTCCAGCCAGTTG-3', 5'-CGGAAC TCCAGAAGACCAGAGCAGA-3'; TNF-α:5'-CCACACCGTCAGCCGATTTGCCATT-3', 5'-TGAACACGCCAGTCGACTCACAGA-3';GAPDH: 5'-TCGGCATTGTGG AGGGGCT C-3', 5'-TCCCG TTCAGCTC GGGGATG-3'。

（4）Western Blot 實驗：將大鼠背根神經(jīng)節(jié)進行組織勻漿裂解，用BCA 蛋白濃度試劑盒測量蛋白濃度，SDS-PAGE 進行分離，用5%的脫脂奶粉封閉后，使用等量蛋白質(zhì)上樣，選擇10%的SDSPAGE 進行分離，轉(zhuǎn)模，結(jié)合一抗 (FGFR3)。4℃孵育過夜后TBST 清洗，用對應(yīng)的二抗室溫孵育，ECL暗室顯色，使用Bio-Rad 全功能成像系統(tǒng)采集圖像，以β-actin 為內(nèi)參，計算各蛋白的相對表達量。

（5）雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)：設(shè)計構(gòu)建FGFR3 的3'UTR 突變和未突變螢光素酶報告基因質(zhì)粒，體外培養(yǎng)人胚腎HEK-293T 細胞，用LipofectamineTM3000 將miR-99b-5p mimics 或NC-mimic 轉(zhuǎn) 染 至 對數(shù)期的HEK-293T 細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后收集細胞，根據(jù)試劑盒操作說明，取50 μl 細胞裂解液于半量板，多功能酶標(biāo)儀上機檢測各組細胞熒光強度。

3. 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準差(±SD)表示。組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析 (one-way ANOVA)，P< 0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1. 前期預(yù)實驗及可行性驗證

對大鼠按照空白組和模型組進行基礎(chǔ)閾值測定，去除耐受性差異較大的個體，排除不可控干擾因素（見圖1A, B）。前期預(yù)實驗檢測miR-99b-5p在背根神經(jīng)節(jié)的表達，確定與空白組相比，模型組miR-99b-5p 的表達顯著降低（見圖1C），證明實驗的可行性。Western Blot 檢測發(fā)現(xiàn)FGFR3 在模型組背根神經(jīng)節(jié)的表達相較于空白組顯著升高（見圖1D）。對完成注射紫杉醇誘導(dǎo)的大鼠模型，進行MWT 和TWL 檢測，與空白對照組比，模型組MWT 和TWL 均顯著低于空白組，提示模型建立成功（見圖1E, F）。

圖1 FGFR3 與miR-99b-5p 在紫杉醇誘導(dǎo)疼痛模型的表達(A) 空白組與模型組紫杉醇誘導(dǎo)前MWT；(B) 空白組與模型組紫杉醇誘導(dǎo)前TWL；(C) 空白組與模型組完成紫杉醇誘導(dǎo)后miR-99b-5p 表達；(D) 空白組與模型組完成紫杉醇誘導(dǎo)后FGFR3 蛋白顯影及結(jié)果統(tǒng)計；(E) 紫杉醇誘導(dǎo)后大鼠MWT；(F) 紫杉醇誘導(dǎo)后大鼠TWL**P < 0.001，***P < 0.0001，與空白組相比Fig. 1 Expression of FGFR3 and miR-99b-5p in Paclitaxel-induced rats Model(A) MWT before paclitaxel induction in rats; (B) TWL before paclitaxel induction in rats; (C) Expression of miR-99b-5p after completion of paclitaxel induction in rats; (D) The protein level of FGFR3 after completion of paclitaxel induction in rats; (E) MWT after paclitaxel induction; (F) TWL after paclitaxel induction.**P < 0.001, ***P < 0.0001, compared with the group blank.

2. agomiR-99b-5p 對大鼠痛覺行為及FGFR3 蛋白的影響

在注射agomiR-99b-5p 前，各組大鼠進行MWT和TWL 檢測基礎(chǔ)痛閾值，剔除差異較大個體后，所有實驗大鼠MWT 和TWL 在各組之間的基礎(chǔ)閾值無顯著性差異（見圖2 A, B）。大鼠最后一次注射agomiR-99b-5p 后1 h，后足MWT 實驗結(jié)果模型組顯著低于空白組， 顯示空白組為(14.78±0.30)、模 型 組 為(8.85±0.55)、agomiR-99b-5p 治 療 組 顯著 高 于 模 型 組 為(14.56±0.38)、agomiR-NC 組 為(9.06±0.34)，見圖2C。在藥物注射后3 h 測量大鼠TWL，結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)大鼠空白組TWL 反應(yīng)時間為(14.15±0.65)、模型組TWL (8.84±0.50)，模型組TWL 和空白組相比反應(yīng)明顯縮短，提示模型組出現(xiàn)了熱痛敏現(xiàn)象，模型組TWL 反應(yīng)時間明顯縮短，表明建模成功；與模型組比，agomiR-99b-5p 治療組反應(yīng)時間為(13.76±0.63)，與空白組幾乎一致，而與agomiR-NC 組(9.14±0.43)比較，反應(yīng)時間延長（見圖2D）。完成行為學(xué)實驗后處死大鼠，收集大鼠背根神經(jīng)節(jié)進行RT-qPCR 檢測agomiR-99b-5p注射后大鼠miR-99b-5p 的變化，治療組miR-99b-5p含量明顯高于模型組（見圖2E）。將收集的大鼠背根神經(jīng)節(jié)進行Western Blot 檢測，結(jié)果顯示在agomiR-99b-5p 治療組FGFR3 的含量明顯低于模型組（見圖2F）。

圖2 agomiR-99b-5p 對大鼠痛覺行為及FGFR3 蛋白的影響(A) 紫杉醇誘導(dǎo)前MWT 基礎(chǔ)閾值；(B) 紫杉醇誘導(dǎo)前TWL 基礎(chǔ)閾值； (C) 給予miR-99b-5p 后MWT；(D)治療后TWL；(E) 治療后miR-99b-5p；(F) 治療后FGFR3 蛋白顯影及結(jié)果統(tǒng)計*P < 0.05，**P < 0.001Fig. 2 The effect of agomiR-99b-5p on pain behavior and FGFR3 protein expression in rats(A) Basal threshold of MWT in rats before paclitaxel induction; (B) Basal threshold of TWL in rats before paclitaxel induction; (C) MWT in rats after treatment of miR-99b-5p; (D) TWL in rats after treatment; (E) miR-99b-5p level in rats after treatment; (F) The protein level of FGFR3 in rats after treatment. *P < 0.05, **P < 0.001.

3.大鼠背根神經(jīng)節(jié)中炎癥因子表達

取大鼠背根神經(jīng)節(jié)，檢測agomiR-99b-5p 對大鼠背根神經(jīng)節(jié)炎癥因子的調(diào)控作用。模型組和agomiR-NC 組TNF-α 和IL-6 無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，而與空白組比，模型組TNF-α 和IL-6 水平較高。同時，與 模型組組比，agomiR-99b-5p 給藥組TNF-α 和IL-6 水平顯著降低，而與空白組則無明顯差異（見圖3A, B)。大鼠背根神經(jīng)節(jié)中IL-1β 無統(tǒng)計學(xué)差異，但與模型組相比，agomiR-99b-5p 給藥組較模型組具有下降的趨勢且與空白組一致（見圖3C)。

圖3 大鼠背根神經(jīng)節(jié)中炎癥因子表達(A) 治療后TNF-α mRNA 水平；(B) 治療后IL-6 mRNA 水平；(C) 治療后IL-1β mRNA 水平*P < 0.05Fig. 3 The expression of inflammatory factors in rat dorsal root ganglion(A) The mRNA level of TNF-α; (B) The mRNA level of IL-6; (C) The mRNA level of IL-1β. *P < 0.05

4. 雙熒光素酶報告基因驗證miR-99b-5p 對FGFR3 的靶向抑制作用

通 過Targetscan 發(fā) 現(xiàn)FGFR3 是miR-99b-5p 的潛在靶基因，從數(shù)據(jù)庫中獲得了miR-99b-5p 與FGFR3 的結(jié)合位點（見圖4A）。h-FGFR3 選擇雙熒光為載體構(gòu)建質(zhì)粒，作為miR-99b-5p 與FGFR3 的靶向關(guān)系理論驗證（見圖4B）。報告基因結(jié)果顯示，與NC mimics 相比，hsa-miR-99b-5p 能夠顯著抑制h-FGFR3-3UTR-wt 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性，而NC mimics和hsa-miR-99b-5p 對h-FGFR3-3UTR-mu 質(zhì)粒的活性則無影響（見圖4C）。為進一步驗證miR-99b-5p 對FGFR3 的靶向抑制作用，Western Blot 檢測實驗細胞HEK-293T 的FGFR3 的 變 化，與NC mimics 給藥組相比，miR-99b-5p 的作用下FGFR3 蛋白表達水平顯著降低（見圖4D）。

圖4 miR-99b-5p 對FGFR3 的靶向抑制作用(A) Targetscan 獲得miR-99b-5p 與FGFR3 的結(jié)合位點圖；(B) h-FGFR3 雙熒光質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖；(C) 雙報告基因miR-99b-5p 與FGFR3 靶向關(guān)系驗證結(jié)果統(tǒng)計圖；(D) HEK-293T 細胞中FGFR3 的表達*P < 0.05，**P < 0.001.Fig. 4 The targeted inhibitory effect of miR-99b-5p on FGFR3(A) Binding site map of miR-99b-5p and FGFR3 obtained by Targetscan; (B) Schematic diagram of h-FGFR3 dual fluorescent plasmid; (C) Relationship between miR-99b-5p and FGFR3; (D) Expression of FGFR3 in HEK-293T cells.*P < 0.05, **P < 0.001.

討 論

神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生機制較復(fù)雜，為一種常見的慢性疾病，為病人的生活帶來了沉重的負擔(dān)，其具體發(fā)病機制并不明確，臨床表現(xiàn)為痛覺過敏及觸覺異常性疼痛，目前尚無非常有效的治療藥物[13,14]。嚴進紅等[15]證明，紫杉醇處理能引起大鼠脊髓中炎癥因子TNF-α 及IL-1β 的水平升高。miR-99b-5p 在脊髓損傷小鼠脊髓中高表達，沉默miR-99b-5p 能抑制脊髓損傷導(dǎo)致的神經(jīng)元數(shù)量和神經(jīng)突觸數(shù)量減少[16]。FGFR3 在多種疾病的炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，能下調(diào)抑制機體的炎癥損傷[17]。本研究顯示agomiR-99b-5p 能夠改善大鼠神經(jīng)性疼痛的形成，雙熒光素酶實驗證明miR-99b-5p 能夠靶向FGFR3。實驗結(jié)果表明agomiR-99b-5p 治療組炎癥因子的表達水平也顯著低于紫杉醇誘導(dǎo)模型組。miR-99b-5p 靶向抑制FGFR3，從而抑制下游信號通路的傳導(dǎo)，進一步抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β 及IL-6 的產(chǎn)生。

細胞因子與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和維持密切相關(guān)，促炎因子TNF-α、IL-1β 及IL-6，它們調(diào)節(jié)神經(jīng)病理性疼痛機制復(fù)雜，可能直接參與了神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生。芍藥甘草湯水提物對坐骨神經(jīng)痛模型大鼠有明顯鎮(zhèn)痛作用，其作用機制與減少脊髓后角IL-6、IL-1β 及TNF-α 水平有關(guān)[18]。雷公藤甲素可緩解脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠疼痛，并具有預(yù)防性鎮(zhèn)痛作用，其機制表明與阻礙膠質(zhì)細胞的激活（星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞），抑制MAPKs 磷酸化，抑制炎癥細胞因如IL-6、IL-1β 及TNF-α、單核細胞趨化蛋白-1 (monocyte chemotactic protein, MCP-1) 的表達有關(guān)[19,20]。miRNA 也是體內(nèi)具有調(diào)節(jié)炎癥因子功能的一類的分子，miRNA-136-5p 能夠調(diào)節(jié)炎癥因子，對急性脊髓損傷模型大鼠具有一定保護作用[21]。miR-99b-5p 能夠靶向FGFR3，進而影響腫瘤、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)的發(fā)生，F(xiàn)GFGR3 能直接調(diào)節(jié)巨噬細胞功能，進而影響炎癥反應(yīng)[17]。同時，TNF-α 是機體炎癥的重要啟動因子，能夠促使IL-1β 和IL-6等炎癥因子的釋放，也能誘使EAA 和C-反應(yīng)蛋白出現(xiàn)神經(jīng)毒性作用[22]。因此，大鼠慢性神經(jīng)病理性疼痛的消失可能與炎癥因子的減弱有一定的關(guān)系。

綜合對注射紫杉醇后大鼠的機械閾值改變、背根神經(jīng)節(jié)中炎癥因子變化分析，本研究認為，隔日腹腔注射2 mg/kg 紫杉醇可以成功建立大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型，表現(xiàn)為外周感覺神經(jīng)的機械超敏，且出現(xiàn)顯著的miR-99b-5p 含量減少和FGFR3 表達增加。agomiR-99b-5p 注射給藥能夠誘導(dǎo)miR-99b-5p 的表達水平增加，對紫杉醇誘導(dǎo)疼痛模型具有顯著的治療作用。因此，基于miR-99b-5p 探索化療后神經(jīng)疼痛的機制，有助于為臨床治療提供一定理論依據(jù)。

綜上所述，紫杉醇誘導(dǎo)的慢性神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型表現(xiàn)為痛反應(yīng)增強，而agomiR-99b-5p 治療組大鼠的MWT 和TWL 值明顯減小，說明miR-99b-5p 對紫杉醇誘導(dǎo)的慢性神經(jīng)病理性疼痛具有顯著的治療效果。本研究首次探究miR-99b-5p 在紫杉醇誘發(fā)神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)中的表達情況，并探究其通過FGFR3 對紫杉醇誘導(dǎo)的SD大鼠神經(jīng)病理性疼痛行為學(xué)和炎癥反應(yīng)的影響，為micorRNA 在疾病的臨床治療提供了前瞻性的理論依據(jù)。然而，miR-99b-5p 在靶向抑制FGFR3 后下游的相關(guān)信號通路并未做深入研究。因此，接下來的研究重點為miR-99b-5p 影響神經(jīng)病理性疼痛的涉及到的相關(guān)信號通路傳導(dǎo)機制。