武芳 張葉毛 趙建平 趙亞楠 周秀嵐

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院，呼和浩特 010010)

念珠菌是一種常見的條件致病菌，存在于人體體表及和外界相通的腔道中，當(dāng)宿主免疫力低下時可引起多種原發(fā)或繼發(fā)感染，輕者僅累及表皮和黏膜，重者可造成深部器官的侵襲性感染或菌血癥[1]。文獻(xiàn)[2]報(bào)道念珠菌血癥的臨床感染，約占醫(yī)院獲得性菌血癥病例的15%，死亡率高達(dá)30%～40%。近年來念珠菌感染率呈上升趨勢，而且不同菌種的念珠菌對抗真菌藥物的抗菌活性存在較大差異，臨床經(jīng)驗(yàn)性用藥又可導(dǎo)致念珠菌耐藥率上升，因而監(jiān)測院內(nèi)念珠菌感染的菌種類型及耐藥情況對指導(dǎo)臨床用藥有著重要的意義。為此本文采用回顧性分析，對內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院2012—2019年分離出的念珠菌3951株進(jìn)行耐藥性監(jiān)測，為臨床醫(yī)師合理選擇抗真菌藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株來源 收集2012年1月至2019年12月臨床分離出的念珠菌3951株的資料(在1周內(nèi)從同一患者相同標(biāo)本中，多次分離出同一種菌僅統(tǒng)計(jì)初次分離菌株1次)。近平滑念珠菌ATCC 22019, 克柔念珠菌ATCC 6258為藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株，結(jié)果均在控。

試劑和儀器 沙堡弱培養(yǎng)基平板、血平板和血培養(yǎng)瓶為法國梅里埃公司產(chǎn)品，真菌鑒定采用法國梅里埃VITEK 2 Compact全自動細(xì)菌培養(yǎng)鑒定儀(試劑均為原廠配套產(chǎn)品)，真菌藥物敏感試驗(yàn)(MIC法)采用法國梅里埃ATB TMFUNGUS 3。

1.2 方法

培養(yǎng)鑒定 菌株培養(yǎng)鑒定嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第4版)進(jìn)行[3]。

藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)參照2017年美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)M60文件——酵母抗真菌藥物敏感試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)和CLSI推薦的念珠菌屬的分界點(diǎn)，見表1。使用儀器判斷結(jié)果的時候，在檢測白念珠菌或熱帶念珠菌時，氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑可出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，導(dǎo)致MIC偏高，必要時肉眼判讀其MIC值；對于氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑，用酵母樣真菌藥敏試劑盒(微量稀釋法)所獲得的“I”分類相當(dāng)于CLSI/ NCCLS定義的劑量依賴型敏感(SDD)[4]。

表1 CLSI推薦的念珠菌屬的分界點(diǎn)Tab.1 Cut-off points of Candida recommended by CLSI μg/mL

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用上海金仕達(dá)軟件，差異顯著性分析使用SPPS 20軟件，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行耐藥率比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)本分布

2012—2019年臨床分離的3951株念珠菌的標(biāo)本來源分布見表2。標(biāo)本來源主要為痰液和尿液，構(gòu)成比均超過1/3 ；分泌物標(biāo)本排在第3位，其中從女性生殖道標(biāo)本中檢出較多，占分泌物標(biāo)本的75.16%(360/479)；沖洗液標(biāo)本中，來自呼吸道的標(biāo)本最多，占所有沖洗液的84.11%(127/151)。

表2 2012—2019年3951株臨床分離念珠菌的標(biāo)本來源分布Tab.2 Source distribution of 3951 clinical isolates of Candida in 2012—2019

2.2 病區(qū)分布

2012—2019年臨床分離的3951株念珠菌的病區(qū)來源分布結(jié)果，見表3。全院重癥監(jiān)護(hù)病房和各病區(qū)的重癥監(jiān)護(hù)病房的占比較高,構(gòu)成比為31.71%(1253/3951)，包括醫(yī)院大重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)735株、呼吸重癥監(jiān)護(hù)病房(RICU) 292株、神經(jīng)內(nèi)科重癥監(jiān)護(hù)病房(NICU) 118株、神經(jīng)外科重癥監(jiān)護(hù)病房(NSICU) 31株、心血管外科重癥監(jiān)護(hù)病房(CSICU)38株、冠心病監(jiān)護(hù)病房(CCU) 21株和其他病區(qū)重癥監(jiān)護(hù)病房18株。構(gòu)成比前三位的病區(qū)為保健病房、ICU和呼吸與危重癥病房(占所有病區(qū)的59.20%)。

表3 2012—2019年臨床分離主要念珠菌的病區(qū)來源分布Tab.3 Ward distribution of 3951 clinical isolates of Candida in 2012—2019

2.3 2012—2019年各年度主要念珠菌的菌種分布

2012—2019年各年度臨床分離主要念珠菌菌種分布見表4。2012—2019年各年度白念珠菌和光滑念珠菌的分離比例總體呈升高趨勢，其中光滑念珠菌的分離率變化有顯著性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而白念珠菌無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；熱帶念珠菌和近平滑念珠菌的分離比例總體呈降低趨勢，且分離率變化均有顯著性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；無名念珠菌在2012—2015年分離率呈升高趨勢,2015—2019年分離率呈降低趨勢，8年間變化有顯著性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。8年內(nèi)白念珠菌的分離比例最高，占66.54%(2629/3951), 其次為熱帶念珠菌12.73% (503/3951)、光滑念珠菌4.81% (190/3951)、近平滑念珠菌4.35% (172/3951)和無名念珠菌4.02% (159/3951)。

表4 2012—2019年各年度臨床分離主要念珠菌的構(gòu)成比Tab.4 Each year composition of the main clinical isolated Candida from 2012 to 2019 %

2.4 2012—2019年臨床分離常見5種念珠菌的藥敏結(jié)果

2012—2019年臨床分離常見念珠菌的耐藥性和敏感性結(jié)果見表5。白念珠菌對5-氟胞嘧啶、兩性霉素B 、伏立康唑、氟康唑和伊曲康唑5種抗真菌藥物的敏感性較好(91.94%～99.43%)；白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和無名念珠菌對兩性霉素B的敏感性較好(96.86%～100%)；熱帶念珠菌對伏立康唑的敏感性較差(78.13%)，敏感率均低于白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和無名念珠菌(93.68%～97.67%)，其中只與白念珠菌的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.734，P=0.003)；熱帶念珠菌對氟康唑的敏感性較差(72.96%)，均低于白念珠菌、近平滑念珠菌和無名念珠菌(93.02%～96.35%)，其中與白念珠菌和無名念珠菌的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.140，P=0.000；χ2=3.952，P=0.047)；熱帶念珠菌對伊曲康唑的敏感性較差(53.88%)，均低于白念珠菌、近平滑念珠菌和無名念珠菌(89.31%～95.93%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=44.836，P<0.001；χ2=19.158，P<0.001；χ2=13.552，P<0.001)；光滑念珠菌對氟康唑的敏感性較差(82.63%)，均低于白念珠菌、近平滑念珠菌和無名念珠菌(93.02%～96.35%)，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.904，P=0.168；χ2=0.592，P=0.442；χ2=0.789，P=0.374)；光滑念珠菌對伊曲康唑的敏感性較差(72.63%)，均低于白念珠菌、近平滑念珠菌和無名念珠菌(89.31%～95.93%)，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.192，P=0.041；χ2=3.180，P=0.075；χ2=1.655，P=0.198)。值得一提的是，熱帶念珠菌和光滑念珠菌對氟康唑和伊曲康唑的劑量依賴性敏感(SDD)率較高(13.72%～25.25%)，而白念珠菌、近平滑念珠菌和無名念珠菌對氟康唑和伊曲康唑的劑量依賴性敏感(SDD)率較低(1.25%～6.92%)。

表5 2012—2019年臨床分離常見深部真菌的抗菌活性Tab.5 In 2012—2019 clinical common properties of deep fungus separation

2.5 2012—2019年臨床分離白念珠菌的敏感率變化趨勢

2012—2019年各年度臨床分離白念珠菌的抗菌活性變化趨勢見表6。除2014—2015年白念珠菌對氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的敏感性較低外(81.82%～87.69%)，2012—2019年各年度白念珠菌對5種抗真菌藥物的敏感率變化不明顯。

表6 2012—2019年各年度臨床分離白念珠菌的抗菌活性變化趨勢Tab.6 Clinical antifungal activity change trend of Candida albicans from 2012 to 2019 n(%)

3 討 論

不同醫(yī)院學(xué)科重點(diǎn)不同，對應(yīng)臨床送檢的標(biāo)本數(shù)量和質(zhì)量不同，標(biāo)本的構(gòu)成比不同。田洹[1]報(bào)道2015—2017年間甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院臨床分離的720株念珠菌中，下呼吸道來源的念珠菌占總分離株數(shù)的92.5%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本文報(bào)道的38.65%；本院對呼吸道送檢標(biāo)本的質(zhì)量把關(guān)較嚴(yán)格，對于不合格臨床送檢的痰液、咽拭子標(biāo)本，不做培養(yǎng)或藥敏試驗(yàn)，所以本統(tǒng)計(jì)的構(gòu)成比相對較低。本文念珠菌的標(biāo)本來源主要為痰液和尿液，與何小羊[5]、劉玉芹[6]和董平亞[7]報(bào)道的結(jié)果一致。念珠菌感染更易于侵襲呼吸道，與呼吸道的解剖結(jié)構(gòu)有關(guān)，呼吸道黏膜的溫度、濕度和酸堿度均適宜于念珠菌生長[8]；另外，近年來由于呼吸機(jī)、纖支鏡等操作的增多，呼吸道黏膜受損,患者呼吸道防御屏障受損，念珠菌更易在下呼吸道定植。然而，由于正常人口腔中也可能存在念珠菌定植，且一般不會引發(fā)臨床癥狀，因此在沒有相關(guān)臨床癥狀時，痰培養(yǎng)陽性標(biāo)本應(yīng)考慮來源于口腔定植念珠菌的污染[9]。臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的涂片、培養(yǎng)結(jié)果和臨床表現(xiàn)來區(qū)別和判斷是致病菌還是定植菌。由表3知，本文念珠菌的病區(qū)來源主要為保健病房、ICU和呼吸與危重癥病房，與田洹[1]報(bào)道的主要來自老年病科、ICU及肺病科的結(jié)果完全一致；本文報(bào)道保健病房、ICU和呼吸與危重癥病房念珠菌的構(gòu)成比為59.20%，由于這三個病區(qū)的大多數(shù)患者，通常年齡高，免疫力低下且可能伴有呼吸道黏膜受損，并有較長的抗真菌藥物使用史，均為念珠菌定植或感染的危險(xiǎn)因素；同時這些患者病情一般嚴(yán)重，長期使用抗生素，易導(dǎo)致菌群失調(diào)而致真菌感染。

由表4知，8年內(nèi)共檢出念珠菌3951株，其中分離前4位的依次為白念珠菌(66.54%)、熱帶念珠菌(12.73%)、光滑念珠菌 (4.81%)和近平滑念珠菌 (4.35%)，與何小羊[5]和楊耀永[10]報(bào)道的結(jié)果基本一致。白念珠菌是最常見的臨床致病真菌,檢出率在念珠菌屬中排首位，但不同地區(qū)、不同時間白念珠菌的檢出率有差別，本文白念珠菌檢出率為66.54%，與文獻(xiàn)何小羊[5]、劉玉芹[6]、董平亞[7]和楊耀永[10]報(bào)道的65.0%、66.6%、63.9%和68.1%相近；但高于慎慧[11]、李銳[12]和Xiao[13]報(bào)道的41.81%、42.4%和44.9%。2012—2019年各年度熱帶念珠菌和近平滑念珠菌的分離比例總體呈降低趨勢，且分離率變化均有顯著性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但與汪飛[14]報(bào)道的“侵襲性熱帶念珠菌感染的發(fā)生比例呈逐年上升的趨勢”結(jié)果不同；無名念珠菌在2012—2015年分離率呈升高趨勢,2015—2019年分離率呈降低趨勢，8年間變化有顯著性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。近年來，有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[11]，非白珠菌分離率有上升趨勢，應(yīng)該引起臨床醫(yī)師和實(shí)驗(yàn)室的重視；本研究中2012—2019年各年度光滑念珠菌等非白珠菌的分離比例總體呈升高趨勢，變化有顯著性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2012—2019年各年度白念珠菌的分離比例總體呈升高趨勢，但變化無顯著性，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與文獻(xiàn)[1]報(bào)道的結(jié)果一致。

經(jīng)典抗真菌藥物有唑類、多烯類和棘白菌素類等。唑類藥物(如氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑等)通過抑制真菌細(xì)胞膜麥角甾醇生物合成起效，作用的靶酶為羊毛甾醇C14α-去甲基化酶；多烯類藥物(如兩性霉素B等)則與細(xì)胞膜麥角甾醇結(jié)合，形成細(xì)胞膜孔道使細(xì)胞外液內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹死亡；棘白菌素(如卡泊芬凈等)通過抑制β-1，3-葡聚糖合成酶來阻斷真菌細(xì)胞壁葡聚糖的生物合成，造成細(xì)胞壁完整性缺陷，達(dá)到抗真菌效果。本實(shí)驗(yàn)的真菌藥物敏感試驗(yàn)(MIC法)采用法國梅里埃ATB TMFUNGUS 3，沒有棘白菌素類藥物的結(jié)果。由表5知，白念珠菌對5-氟胞嘧啶、兩性霉素B 、伏立康唑、氟康唑和伊曲康唑5種抗真菌藥物的耐藥率較低(0～8.72%)，熱帶念珠菌對三唑類抗真菌藥的耐藥性較高，其對氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑的耐藥率依次為13.32%、16.90%和20.87%，與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的結(jié)果一致。三唑類抗真菌藥，其作用于細(xì)胞色素P450 酶和14a-脫甲基酶，最終使麥角醇合成受阻，造成甲基戊酸在細(xì)胞內(nèi)的堆集，使膜結(jié)構(gòu)破壞，從而抑制真菌生長，這是三唑類藥物共同的作用機(jī)制，也是造成交叉耐藥的理論基礎(chǔ)[12]。唑類抗真菌藥物主要起抑菌作用，長期治療和反復(fù)使用易引起耐藥，這也是唑類抗真菌藥物耐藥率增高的原因，應(yīng)引起臨床的足夠重視。熱帶念珠菌和光滑念珠菌對氟康唑和伊曲康唑的劑量依賴性敏感(SDD)率較高(13.72%～25.25%)，與慎慧[11]報(bào)道的結(jié)果相似；而白念珠菌、近平滑念珠菌和無名念珠菌對氟康唑和伊曲康唑的SDD率較低(1.25%～6.92%)。由表6知，2012—2019年各年度白念珠菌對5種抗真菌藥物的敏感率變化不明顯，只有2014—2015年對氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的敏感性略低，可能與該年段對三種唑類抗真菌藥物折點(diǎn)的調(diào)整有關(guān)。

近年來，隨著廣譜抗生素的長期使用，腫瘤患者放化療治療增加、免疫抑制劑使用增多，臨床侵襲性真菌感染發(fā)病率有顯著提高的趨勢[15-16]；本文念珠菌總體分離結(jié)果基本與國內(nèi)、外報(bào)道情況一致[13,17]。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期監(jiān)測本地區(qū)侵襲性真菌的感染狀況，為臨床防治真菌感染提供合理用藥的依據(jù)。