李彩云 柯婷婷 李剛 趙梅 王文

(1.江蘇省人民醫(yī)院浦口分院檢驗科，南京 211800；2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院醫(yī)學實驗中心，銀川 750000)

妊娠期產(chǎn)婦陰道酸堿平衡失調(diào)，大大增加了感染的風險[1]。大量研究表明，陰道微環(huán)境的變化可能跟不良妊娠結(jié)局有關。念珠菌是引起妊娠期陰道炎最常見的致病菌之一[2]，當念珠菌形成生物被膜以后,其耐藥性將上升10～1000倍，并且還能逃脫人體免疫系統(tǒng)的攻擊，引起患者機體長期感染[3]。正常情況下，機體通過識別不同致病菌的相關分子模式(PAMPs)來引起一系列免疫反應而將其殺死，但生物被膜形成以后能把這些成分包裹起來，引發(fā)免疫逃逸[4]，因此，生物被膜型念珠菌引起的感染對臨床醫(yī)生產(chǎn)生了很大的困擾。本文旨在通過研究分析不同產(chǎn)膜能力的念珠菌與感染患者機體Toll樣受體信號通路的免疫關系，探討念珠菌生物膜在妊娠期陰道炎感染患者體內(nèi)的免疫逃逸機制，找到能夠有效清除生物膜的方法，并且研究探討其對不良妊娠結(jié)局的影響，從而為臨床產(chǎn)科治療念珠菌引起的陰道炎提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌株及標本

收集2016年1月—2019年12月從我院產(chǎn)科陰道分泌物標本中分離出的念珠菌178株，采用法國梅里埃公司全自動微生物分析儀(VITEK 2 COMPACT)將微生物鑒定到種。同時收集上述患者的外周靜脈血5 mL置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中備用，再收集178例同時期陰道分泌物中未檢出念珠菌的健康產(chǎn)婦的外周血作為對照。

1.2 試劑與儀器

TRI zol、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、YPD液體培養(yǎng)基、ELISA試劑盒、血清總蛋白提取試劑盒、基因引物由上海生工生物工程有限公司合成；二氧化碳培養(yǎng)箱、酶標儀、96孔細胞培養(yǎng)板、熒光定量PCR儀、離心機等。

1.3 念珠菌生物膜形成能力分析

把分離出的菌株用RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整濃度為1.0×106/mL左右，然后加入到96孔細胞培養(yǎng)板，對照組加入等量的培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h以后，PBS沖洗3遍，用戊二醛固定后加入染液結(jié)晶紫，等待30 min后，用水沖洗，吸光度值用酶標儀檢測。結(jié)果判斷A570>0.5為強產(chǎn)膜菌，A570<0.25為弱產(chǎn)膜菌，在兩者之間為中等產(chǎn)膜菌。加入熒光染料FITC-conA后，用熒光顯微鏡觀察各組菌株的形態(tài)特征。

1.4 RT-PCR檢測各組妊娠期陰道炎患者外周血單個核細胞中TLR2、TLR4、MyD88基因的表達量

采集各組妊娠期陰道炎患者外周靜脈血，利用Ficoll密度梯度離心法收集單個核細胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄，測定基因TLR2、TLR4、MyD88mRNA表達水平，然后以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔct相對定量計算方法分析表達量的變化(引物序列見表1)。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.5 ELISA測定各組妊娠期陰道炎感染患者細胞因子的分泌情況

收集各組患者血液標本，離心后，取上層血漿待用，按照ELISA試劑盒使用說明方法測定各組血漿中的炎癥因子IFN-γ、IL-4、IL-1β、TNF的表達量。

1.6 診斷并記錄各組妊娠期陰道炎感染患者妊娠不良結(jié)局的情況

早產(chǎn)、羊水異常、新生兒窒息、產(chǎn)褥感染、新生兒黃疸、絨毛膜羊膜炎的診斷標準均參照《婦產(chǎn)科學》教材。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析，組間比較用單因素方差分析，計數(shù)資料用百分率表示，組間比較用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 念珠菌生物膜的表型分類

本實驗將178株從妊娠期陰道炎患者分離出的念珠菌分為強產(chǎn)膜組64株、中等產(chǎn)膜45株、弱產(chǎn)膜69株(非產(chǎn)膜組)。用結(jié)晶紫和FITC-conA染色后觀察菌株形態(tài)，發(fā)現(xiàn)強產(chǎn)膜菌大部分以菌絲的形態(tài)相互交錯密密麻麻排列，非產(chǎn)膜菌大部分以酵母樣的形態(tài)附著于培養(yǎng)皿的底部(見圖1)。

圖1 結(jié)晶紫和FITC-conA染色后的菌株形態(tài)Fig.1 Strain morphology after staining with crystal violet and FITC-conA

2.2 RT-PCR法檢測各組妊娠期陰道炎感染患者外周血單個核細胞中TLR2、TLR4、MyD88基因的表達量

比較患者感染念珠菌后，其機體對強產(chǎn)膜菌與非產(chǎn)膜菌的免疫應答能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離出強產(chǎn)膜菌患者TLR2、TLR4、MyD88基因的表達量比對照組低，非產(chǎn)膜組比對照組高，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05，見圖2)。

圖2 RT-PCR法檢測各組妊娠期陰道炎感染患者外周血單個核細胞中TLR2、TLR4、MyD88基因的表達量Fig.2 Detection of TLR2, TLR4, MyD88 gene expression in peripheral blood mononuclear cells of patients with vaginitis infection during pregnancy by RT-PCR method

2.3 ELISA測定各組妊娠期陰道炎感染患者細胞因子的分泌情況

結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染強產(chǎn)膜菌的妊娠期陰道炎患者血漿中IL-1β、TNF、IFN-γ濃度與對照組相比有所下降，非產(chǎn)膜組與健康對照組相比有所上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而細胞因子IL-4的濃度，與對照組相比，強產(chǎn)膜組明顯升高，而非產(chǎn)膜組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 ELISA測定各組細胞因子的濃度Tab.2 ELISA to determine the concentration of cytokines in each group

2.4 各組妊娠期陰道炎感染患者妊娠結(jié)局的比較

對照組不良妊娠結(jié)局發(fā)生率為2.8%，非產(chǎn)膜組不良妊娠結(jié)局為 4.3%，與對照組相比差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；強產(chǎn)膜組不良妊娠結(jié)局為 21.8%，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組妊娠期陰道炎感染患者妊娠結(jié)局的比較Tab.3 Comparison of pregnancy outcomes of patients with vaginitis infection during pregnancy in different groups

3 討 論

妊娠期女性陰道微環(huán)境發(fā)生改變，免疫力下降，容易引發(fā)致病菌感染，目前發(fā)現(xiàn)陰道炎可能妊娠不良結(jié)局有關[5]，念珠菌是引起陰道炎最常見的病原菌，嚴重者可引起流產(chǎn)、胎膜早破等不良后果。生物膜型的念珠菌形成以后，其致病性更強，目前對于妊娠期陰道炎患者還沒有很好的治療方法。

有研究報道，念珠菌生物膜形成能力的強弱與其致病性有關[6]。本實驗將從妊娠期陰道炎患者分離出的菌株分為強產(chǎn)膜組和非生物膜組，用熒光顯微鏡觀察期形態(tài)，發(fā)現(xiàn)強產(chǎn)膜菌呈菌絲狀相互交錯密集排列，而弱產(chǎn)膜菌大部分以酵母樣黏附于培養(yǎng)板底部，其生物學結(jié)構可能也是其具有強耐藥性和強抵抗性的原因之一。

機體的固有免疫應答是抵抗感染的第1道防線，主要通過模式識別受體來識別外源性物質(zhì)，從而激活一系列信號傳導系統(tǒng)，發(fā)揮免疫防御功能[7]。Toll樣受體是表達于細胞膜上以及內(nèi)膜系統(tǒng)上的常見模式識別受體，其主要通過胞外富含亮氨酸的結(jié)構域直接識別病原菌的分子結(jié)構，激活細胞內(nèi)的信號傳導通路，引起炎癥因子的變化，達到抵抗病原菌的目的[8]。研究發(fā)現(xiàn)TLR2、TLR4在感染引起的免疫應答中發(fā)揮著重要的作用，通過顯著表達后識別念珠菌表面的糖磷脂甘露聚糖, 通過MyD88依賴性途徑和MyD88非依賴性途徑來激活NF-κB和絲裂原蛋白激酶級聯(lián)反應通路,引起大量炎性細胞因子的變化來發(fā)揮免疫應答作用[9]，本實驗通過RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，強產(chǎn)膜組TLR2、TLR4、MyD88基因的表達量低于對照組，而非生物膜組表達量高于對照組，說明感染強產(chǎn)膜菌株的患者機體能夠通過降低TLR2、TLR4受體的表達和抑制MyD88依賴性途徑而降低固有免疫應答能力，非生物膜組病原菌主要通過增強Toll受體的表達啟動免疫應答。這與楊婧等[10]報道的浮游狀態(tài)的銅綠假單胞菌通過高表達TLR4，激活p38MAPK和NF-κB信號傳導通路，引起的炎癥反應相一致，其所報道的生物膜型銅綠假單胞菌更主要是通過分泌藻酸鹽抑制中性粒細胞、巨噬細胞的吞噬而引起免疫逃逸。本實驗又進一步測定各組陰道炎患者細胞因子的分泌情況，發(fā)現(xiàn)感染強產(chǎn)膜組患者血漿中IL-1β、TNF、IFN-γ濃度與對照組相比明顯降低，非生物膜的患者血漿中的濃度與對照組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義。強產(chǎn)膜組患者IL-4因子濃度明顯高于對照組，這說明強產(chǎn)膜能夠擾亂機體的免疫功能，Th1型主要以IL-1β、TNF、IFN-γ分泌為主，介導細胞免疫[11]，Th2型主要以IL-4分泌為主，刺激機體產(chǎn)生抗體，介導體液免疫[12]。而且IL-4為炎癥抑制因子，主要的生物學作用是抑制巨噬細胞的活性，局部控制炎癥反應。本研究顯示，強產(chǎn)膜菌誘發(fā)機體主要產(chǎn)生Th2型免疫反應，使得Th1/Th2比例失調(diào)，從而引起細胞因子表達量的變化,這可能是強產(chǎn)膜菌相對非產(chǎn)膜菌更容易發(fā)生免疫逃逸，引起機體慢性感染的原因之一。因此，這時可考慮通過調(diào)節(jié)患者機體免疫反應類型，增加Th1型免疫反應，來清除感染的病原菌，通過適當抑制Th2型免疫反應來降低機體的炎癥反應。

本研究進一步分析了不同狀態(tài)的念珠菌對妊娠結(jié)局的影響，結(jié)果顯示對照組不良妊娠結(jié)局發(fā)生率為2.8%，強產(chǎn)膜組不良妊娠結(jié)局為 21.8%，差異有統(tǒng)計學意義，說明強產(chǎn)膜念珠菌對妊娠期陰道炎患者影響較大，在臨床工作中因進行適當宣傳教育，必要時在醫(yī)生的指導下進行積極治療。

強產(chǎn)膜念珠菌對母嬰影響很大，其相對非產(chǎn)膜菌而言，更容易發(fā)生免疫逃逸，引起感染的慢性化。因此，應鼓勵產(chǎn)婦及早到醫(yī)院產(chǎn)檢，及時干預治療，預防不良結(jié)局的發(fā)生。