高愛莉 代歆悅 李華平 王煥麗 馬少吟 陳教全 朱慧蘭

(廣州市皮膚病防治所，廣州 510095)

外陰陰道念珠菌病(vulvovaginal candidiasis，VVC)是一種常見的皮膚黏膜疾病，據統(tǒng)計，有10%～15%的婦女患無癥狀型VVC，75%的育齡期婦女至少經歷1次VVC，40%～50%的婦女患病2次及以上[1]。復發(fā)性外陰陰道念珠菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis，RVVC)指 12個月中確實發(fā)作4次或4次以上有癥狀的VVC，約8%的成年婦女患有RVVC[2]。VVC的臨床癥狀呈非特異性，主要表現(xiàn)為外陰瘙癢，外陰和陰道紅斑、水腫和皸裂，部分患者伴有陰道酸痛和刺激，嚴重者有明顯的排尿困難。重度 VVC 是指臨床癥狀嚴重，外陰或陰道皮膚黏膜有破損，按 VVC 評分標準[3]，評分≥7分者(見表1)。VVC的發(fā)作與復發(fā)給人們身心帶來不良影響。

文獻顯示VVC患者中大量細胞因子表達異常[4-5]，多項研究也證實了白細胞介-17(interleukin-17，IL-17)和白細胞介-23(IL-23)等細胞因子在陰道念珠菌中具有重要的免疫保護作用[6-8]。而高遷移率族蛋白 1(high mobility group box-1，HMGB1)是高遷移率族蛋白中的一員，既往研究認為HMGB1是一種重要的內源性信號分子，在DNA結構和轉錄調控中起著重要的作用。近年來發(fā)現(xiàn)，HMGB1是一種晚期炎癥介質，可由免細胞和壞死受損細胞釋放至細胞外，隨后遷移至炎癥部位結合相應受體，如TLR4、RAGE等，誘導細胞因子產生、趨化，促進晚期炎癥[9]。VVC是一種真菌感染引起的炎癥性疾病，而HMGB1與VVC發(fā)病關系暫未見有相關報道。

表1 VVC臨床癥狀評分Tab.1 The clinical symptom scores of VVC

本研究旨在于探討IL-17、IL-23 及 HMGB1 在 VVC 患者血清及陰道分泌物中的表達情況，以及三者表達與 VVC臨床指標之間的關系，試圖闡明其在VVC發(fā)病機制中的作用，為尋找新的治療靶點提供一定理論依據。

1 臨床資料

1.1 資料

選擇2016年12月至2018年12月廣州市皮膚病防治所門診就診的年齡為18～50歲性活躍期婦女。常規(guī)詢問病史及婦科檢查, 對臨床懷疑外陰陰道念珠菌病的患者, 取其陰道分泌物做真菌鏡檢和培養(yǎng)鑒定。以真菌鏡檢有假菌絲且培養(yǎng)鑒定為白念珠菌的患者作為入選病例，隨機選取105例VVC患者，并按照臨床癥狀評分標準分為輕中度VVC組、重度VVC組及RVVC組，選擇正常體檢者，陰道分泌物檢查白細胞陰性，真菌鏡檢陰性, 培養(yǎng)陰性的39例作為正常對照組。所有患者由主診醫(yī)師詳細記錄主要臨床資料，包括：姓名、年齡、病程、臨床癥狀評分、1個月內是否使用過激素治療、1個月內是否使用過抗生素治療、1個月內是否服用過避孕藥、是否使用宮內節(jié)育器、是否妊娠、糖尿病及血糖控制情況、1個月內是否使用免疫抑制藥物等。排除標準：①有自身免疫性或免疫缺陷疾病者; ②妊娠或合并其他生殖器感染性疾病者; ③有特殊藥物服用史者; ④1周內陰道給藥和陰道灌洗者。

1.2 方法

標本采集及處理 ①外周血標本采集：采集所有受試者清晨空腹狀態(tài)下靜脈血5 mL，離心分離血清，-80℃保存?zhèn)溆?。②陰道分泌物采集：所有受試者取材時均常規(guī)消毒外陰, 將統(tǒng)一標準的專用干棉簽置于陰道后穹窿處留置30 s，取出后，一份棉拭子進行真菌涂片及培養(yǎng)，另一份棉拭子放入有1 mL無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)的Eppendor管中，充分轉動后取出棉拭子，再將Eppendor管3 000 r/min離心3 min，吸取上清液，儲存于-80℃冰箱備用檢測。

檢測方法 采用 ELISA 檢測血清及分泌物中HMGB1(南京建成公司)、IL-17(杭州聯(lián)科公司)及IL-23(杭州聯(lián)科公司)及含量，具體操作嚴格按照試劑盒使用說明進行，并根據試劑盒提供的樣本制作標準曲線, 求出標本的濃度。

2 結 果

2.1 一般情況

本研究共納入VVC患者105例，平均年齡為 (33.4±9.8)歲，其中輕中度VVC組51例、重度VVC組21例、RVVC組33例；對照組39例，平均年齡(31.2±8.8)歲。

2.2 血清及分泌物中HMGB1與IL-17、IL-23檢測結果

外周血中，重度VVC組及RVVC組患者HMGB1水平均較正常組高(P<0.05)，輕中度及重度VVC組IL-17水平均高于對照組(P<0.05)。輕中度及重度VVC組、RVVC組IL-23水平均高于對照組(P<0.05)；分泌物中，輕中度及重度VVC組、RVVC組IL-17水平均高于對照組(P<0.05)。輕中度及重度VVC組、RVVC組IL-23水平均高于對照組(P<0.05)見表2～4及圖1～3。

表2 各組患者外周血中HMGB1的水平Tab.2 The levels of HMGB1 in peripheral blood

表3 各組患者外周血及陰道分泌物中IL-17的水平Tab.3 The levels of IL-17 in peripheral blood and vaginal discharge

表4 各組患者外周血及陰道分泌物中IL-23的水平Tab.4 The levels of IL-23 in peripheral blood and vaginal discharge

圖1 各組患者外周血中HMGB1的水平 圖2 各組患者外周血及分泌物中IL-17的水平 圖3 各組患者外周血及分泌物中IL-23的水平Fig.1 The levels of HMGB1 in peripheral blood Fig.2 The levels of IL-17 in peripheral blood and vaginal secretions Fig.3 The levels of IL-23 in peripheral blood and vaginal discharge

2.3 HMGB1水平與IL-17表達的相關性分析

研究發(fā)現(xiàn)，外周血中HMGB1水平與IL-17、IL-23表達成正相關，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表5及圖4。

表5 外周血中HMGB1水平與IL-17、IL-23表達相關性分析Tab.5 Correlation analysis of the HMGB1 level and IL-17, IL-23 expression in peripheral blood

2.4 IL-23與IL-17表達的相關性分析

對105例VVC患者外周血及分泌物中IL-23水平與IL-17進行了相關分析，結果發(fā)現(xiàn)：外周血及分泌物中IL-23的表達水平與IL-17的表達均成正相關，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表6及圖5。

表6 外周血及分泌物中IL-23水平與IL-17相關性分析Tab.6 Correlation analysis of IL-23 and IL-17 in peripheral blood and vaginal discharge

2.5 HMGB1、IL-17、IL-23與疾病嚴重程度的相關性分析

研究發(fā)現(xiàn)，患者外周血中HMGB1水平與疾病嚴重度成正相關，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；分泌物中IL-17水平與疾病嚴重度成正相關，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表7。

表7 IL-17、IL-23及HMGB1水平與VVC疾病嚴重度相關性分析Tab.7 Correlation analysis of IL-17, IL-23 and HMGB1 with the severity of VVC

圖4 HMGB1水平與IL-17、IL-23表達的相關性 圖5 IL-23與IL-17表達的相關性Fig.4 Correlation analysis of the HMGB1 level with IL-17, IL-23 expression Fig.5 Correlation analysis of IL-17, IL-23 expression

3 討 論

念珠菌屬于條件致病性雙相菌，有酵母相及菌絲相，酵母相通常為無癥狀寄生狀態(tài)，當各種誘因導致機體免疫力降低時，念珠菌大量繁殖，并由酵母相則可轉化為形成菌絲相，侵襲組織能力增強，導致陰道炎的產生，目前國內外研究普遍認為細胞免疫在念珠菌感染中起主要的抗感染保護作用[10-11]。IL-17是一個常見的促炎因子，它是Th17細胞的效應細胞因子，其分泌受到Th17細胞的分化水平影響，而高表達的IL-23可誘導Th17的分化增多。Kagami等[12]也發(fā)現(xiàn)，腸道念珠菌定植患者體內可檢測到高表達的IL-17。動物實驗發(fā)現(xiàn)局部IL-23可能在小鼠陰道念珠菌病的發(fā)病機制中起一定作用，在感染過程中具有保護作用[6]。并且在人類陰道念珠菌病中也證實了IL-17、IL-23等細胞因子發(fā)揮著重要的免疫保護作用[6-8]。

HMGB1作為一種晚期炎癥介質，近年來也發(fā)現(xiàn)其在一些感染性及炎癥性疾病中發(fā)揮作用， Jhun等[13]發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎患者外周血中HMGB 1水平明顯升高，提示HMGB1可能參與感染性疾病和局部炎癥反應。另有研究表明，甘草素是HMGB1最常見的抑制劑，其可通過TLR4途徑降低IL-23、IL-17等炎性因子表達，減輕心肌缺血/再灌注損傷[14]。而HMGB1是否也參與了VVC的疾病發(fā)生，暫未見報道。

據此，我們檢測了VVC患者及健康者體內HMGB1、IL-17、IL-23的水平，并分析各指標及其與VVC臨床癥狀指標間的相關性。發(fā)現(xiàn)外周血中，重度VVC組及RVVC組患者外周血中HMGB1水平均高于對照組(P<0.05)，輕中度及重度VVC組IL-17水平均高于對照組(P<0.05)，輕中度及重度VVC組、RVVC組IL-23水平均高于對照組(P<0.05)，且HMGB1水平與IL-17、IL-23表達成正相關(P<0.05)，IL-23水平與IL-17表達成正相關(P<0.05)；而分泌物中，輕中度及重度VVC組、RVVC組IL-17水平均高于對照組(P<0.05)，僅輕中度VVC組IL-23水平高于對照組(P<0.05)，IL-23水平與IL-17表達亦成正相關(P<0.05)。由此我們推測：VVC患者體內存在高水平的HGMB1，其可通過結合TLR4受體，促進IL-23誘導的IL-17表達，或直接上調IL-17的表達，可能參與VVC的發(fā)病。在該研究中，部分研究組與對照組間差異無統(tǒng)計學意義，如重度VVC組中IL-23與對照組差異無統(tǒng)計學意義，可能與我們收集的病例數(shù)較少，后續(xù)將進一步進行大樣本的檢測，并進行統(tǒng)計學分析。

隨后，我們分析了天然免疫相關因子與疾病嚴重程度的關系，研究發(fā)現(xiàn)：外周血中，HMGB1水平與疾病嚴重度成正相關(P<0.05)；分泌物中，IL-17水平與疾病嚴重度成正相關(P<0.05)。這一結果提示，HMGB1、IL-17的水平一定程度上提示了VVC患者的病情嚴重程度。說明二者與外陰陰道念珠菌病的發(fā)病、病情嚴重程度有一定的相關性。

綜上所述，本研究結果表明，血清及分泌物中 HMGB1、IL-17、IL23 在 VVC 患者中顯著高表達，且三者與疾病活動性密切相關，推測三者有望成為VVC治療和預防的新靶點，值得進一步深入研究探討。