蒙振發(fā) 李以萍 譚德敏 陳綿軍 陳軍

(儋州市人民醫(yī)院 1重癥醫(yī)學(xué)科，海南 儋州 571700；2門診藥房)

急性胰腺炎(AP)是臨床上常見(jiàn)的急性腹癥，臨床一般表現(xiàn)為腹痛、惡心嘔吐、發(fā)熱、血胰酶升高等癥狀，具有起病迅速、病死率高、預(yù)后差等特點(diǎn)，除胰腺本身病變外，還可引發(fā)其他組織和器官損傷，甚至誘發(fā)患者全身性炎癥反應(yīng)和器官功能性障礙〔1～3〕。脂多糖(LPS)即熱源或內(nèi)毒素，是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的成分，具有毒性、炎癥損傷作用，能誘發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。雷公藤多甙(TWP)是衛(wèi)矛科植物雷公藤去皮根中提取而成的總皂苷，其中二萜類化合物和雷公藤甲素發(fā)揮主要作用，臨床上應(yīng)用于免疫調(diào)控、抗炎、腎病等，其不良反應(yīng)少、用量小，是目前國(guó)內(nèi)外研究免疫調(diào)節(jié)、抗炎藥的熱點(diǎn)之一〔4〕。微小RNA(miRNA)是內(nèi)源性非編碼RNA，在炎癥、免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用，大部分miRNA通過(guò)抑制基因表達(dá)，發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，miR-146是最先發(fā)現(xiàn)在免疫應(yīng)答中具有正反饋調(diào)節(jié)作用的miRNA，有miR-146a和miR-146b兩個(gè)成員〔5〕。miR-146b在炎癥反應(yīng)中已被廣泛研究報(bào)道，因此本研究以胰腺腺泡細(xì)胞(AR42J)為模型細(xì)胞，擬通過(guò)研究TWP在減輕LPS誘導(dǎo)的AR42J炎癥損傷中的作用及對(duì)miR-146a表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器 TWP(≥98%)購(gòu)自湖北恒景瑞化工有限公司；地塞米松(DXM) 磷酸鈉注射液購(gòu)自湖北天藥藥業(yè)股份有限公司(1 ml∶5 mg)；LPS(≥99%)購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibico公司；青鏈霉素雙抗、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6和IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Neomarker公司；總RNA提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；U6內(nèi)參(E021010)購(gòu)自美國(guó)EARTHOX公司；miR-146a PCR引物(CD106)購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；兔抗鼠NF-κB p65、兔抗鼠Toll樣受體(TLR)4、兔抗鼠內(nèi)參β-Actin、羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司；CFX96型實(shí)時(shí)熒光定量(RT-qPCR)儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀、賽默飛世爾BB15 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司；細(xì)胞培養(yǎng)接種專用超凈臺(tái)購(gòu)自鄭州安晟科學(xué)儀器有限公司；電泳槽和轉(zhuǎn)膜槽購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2細(xì)胞系 大鼠胰腺腺泡細(xì)胞(AR42J)購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，加入含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，隔天換液。細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合后進(jìn)行傳代。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3MTT法測(cè)定不同濃度TWP對(duì)AR42J細(xì)胞活性的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AR42J細(xì)胞，用培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)整為4×104個(gè)/ml，以每孔200 μl接種到96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜后棄培養(yǎng)液，并用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍，加入含不同濃度的TWP培養(yǎng)液(終濃度分別為2、5、10、25、50、100 μmol/L)，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置不加TWP的對(duì)照組，只加0.1%二甲基亞砜(DMSO)組。培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，之后加入25 μl 5 mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，加入150 μl DMSO溶液，100 r/min 37℃震蕩10 min，使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定在490 nm處吸光度(OD值)。計(jì)算不同濃度TWP對(duì)AR42J細(xì)胞活性。細(xì)胞活性按下式計(jì)算：細(xì)胞活性(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.4LPS刺激后AR42J細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 實(shí)驗(yàn)分組，對(duì)照組：不經(jīng)任何處理的AR42J細(xì)胞；LPS組：加入2 ml 終濃度為10 μg/ml LPS培養(yǎng)液〔6〕；L-TWP+LPS組：加入2 ml終濃度為10 μg/ml LPS和2 μmol/L TWP培養(yǎng)液(LPS加入24 h后，再加入TWP培養(yǎng)24 h，以下分組操作與此相同)；M-TWP+LPS組：加入2 ml終濃度為10 μg/ml LPS和5 μmol/L TWP培養(yǎng)液；H-TWP+LPS組：加入2 ml終濃度為10 μg/ml LPS和10 μmol/L TWP培養(yǎng)液；DXM+LPS組：加入2 ml終濃度為10 μg/ml LPS和25 μg/mL DXM培養(yǎng)液〔7〕。將AR42J細(xì)胞接種到含有細(xì)胞爬片的6孔板上，培養(yǎng)24 h后，按照上面分組進(jìn)行加藥操作，待培養(yǎng)結(jié)束后染色、封片，用激光共聚焦觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.5ELISA檢測(cè)TNF-α和IL-6表達(dá)水平 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6表達(dá)水平，將各孔的細(xì)胞培養(yǎng)基在4℃ 5 000 r/min離心半徑10 cm條件下離心10 min，用移液器取上清液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作測(cè)定各組細(xì)胞TNF-α和IL-6表達(dá)水平，顯色后，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定樣品在450 nm處的吸光度，根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TNF-α和IL-6濃度。

1.6RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-164a表達(dá)水平 收集AR42J細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組同“1.4”，使用總RNA提取試劑盒提取AR42J細(xì)胞中的總RNA，經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄得cDNA，采用RT-qPCR儀對(duì)miR-164a進(jìn)行擴(kuò)增。RT-qPCR體系共20.0 μl，其中SYBR Mix10.0 μl，cDNA(25 ng/ml) 2.0 μl，上下游引物(5 μmol/L)各2.0 μl，ddH2O 4.0 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性300 s，95℃變性30 s，63℃退火30 s，73℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)后，73℃終末延伸5 min。miR-164a上游引物:5′-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3′，下游引物：5′-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU-3′；U6上游引物:5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。每個(gè)樣本均做3個(gè)副孔，采用2-ΔΔCt法對(duì)AR42J細(xì)胞miR-164a表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

1.7Western印跡法測(cè)定TWP對(duì)AR42J細(xì)胞TLR4/核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號(hào)通路的影響 Western印跡測(cè)定膠質(zhì)瘤AR42J細(xì)胞NF-κB p65和TLR4表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)分組同“1.4”。用細(xì)胞裂解液十二烷基硫酸鈉(SDS)提取各組細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定各組細(xì)胞蛋白含量，每組設(shè)置6個(gè)副孔，40 μg蛋白加入到點(diǎn)樣孔中，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離目標(biāo)蛋白，根據(jù)目標(biāo)蛋白大小剪切大小適當(dāng)?shù)哪z。用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%的脫脂奶粉封閉結(jié)合位點(diǎn)2 h。加入兔抗鼠NF-κB p65(1∶1 000)、兔抗鼠TLR4(1∶1 000)、兔抗鼠內(nèi)參β-Actin(1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜，用PBS清洗3次，每次5 min，加入羊抗兔二抗(1∶1 000)，25℃孵育15 min，PBS清洗3次，每次5 min，用顯色劑電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色、曝光。用凝膠成像設(shè)備觀察。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度TWP對(duì)AR42J細(xì)胞活性的影響 0 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L TWP處理24 h后AR42J細(xì)胞活性，分別為：(102.67±3.31)%、(98.46±4.27)%、(94.27±3.64)、(87.59±4.06)%、(76.91±4.16)%、(52.47±3.94)%、(32.65±3.92)%。AR42J細(xì)胞經(jīng)10 μmol/L TWP處理24 h后，仍保持較高活性，為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取TWP濃度2 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L進(jìn)行。

2.2LPS刺激后AR42J細(xì)胞形態(tài) AR42J細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)后，細(xì)胞逐漸變形、皺縮、邊緣不規(guī)則、核仁不清晰，經(jīng)不同濃度TWP處理后，隨著濃度增加細(xì)胞形態(tài)逐步恢復(fù)，細(xì)胞逐漸恢復(fù)圓整飽滿。見(jiàn)圖1。

圖1 LPS刺激后AR42J細(xì)胞形態(tài)(免疫熒光染色，×100)

2.3TWP對(duì)AR42J細(xì)胞促炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，LPS組TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與LPS組相比，L-TWP+LPS組、M-TWP+LPS組、H-TWP+LPS組TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，隨著TWP濃度升高，蛋白表達(dá)水平也隨之降低，任意兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DXM+LPS組TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)水平與LPS組、L-TWP+LPS組及M-TWP+LPS組相比顯著降低(P<0.05)，與H-TWP+LPS組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.4TWP對(duì)AR42J細(xì)胞中miR-146a水平的影響 與對(duì)照組相比，LPS組miR-146a表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與LPS組相比，L-TWP+LPS組、M-TWP+LPS組、H-TWP+LPS組miR-146a表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，隨著TWP濃度升高，miR-146a表達(dá)水平也隨之升高，任意兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DXM+LPS組miR-146a表達(dá)水平與LPS組、L-TWP+LPS組及M-TWP+LPS組相比顯著升高(P<0.05)，與H-TWP+LPS組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.5TWP對(duì)AR42J細(xì)胞TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響 與對(duì)照組相比，LPS組NF-κB p65蛋白、TLR4蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與LPS組相比，L-TWP+LPS組、M-TWP+LPS組、H-TWP+LPS組NF-κB p65蛋白、TLR4蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，隨著TWP濃度升高，TNF-κB p65蛋白、TLR4蛋白表達(dá)水平也隨之降低，任意兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DXM+LPS組NF-κB p65蛋白、TLR4蛋白表達(dá)水平與LPS組、L-TWP+LPS組及M-TWP+LPS組相比顯著降低(P<0.05)，與H-TWP+LPS組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1和圖2。

表1 TWP對(duì)AR42J細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)及miR-146a、NF-κB p65、TLR4水平的影響

3 討 論

p38MAPK和核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是胰腺炎發(fā)病中產(chǎn)生促炎癥因子的主要途徑，有學(xué)者認(rèn)為腸黏膜受損，導(dǎo)致腸道菌群細(xì)胞壁成分LPS刺激機(jī)體是胰腺炎發(fā)病的主要原因〔8,9〕。研究表明LPS可激活機(jī)體免疫系統(tǒng)分泌大量炎癥因子，從而引起炎癥損傷，在實(shí)驗(yàn)性胰腺炎模型中，LPS刺激后上調(diào)TNF-α和IL-6等促炎癥因子的表達(dá)，而TNF-α和IL-6的上調(diào)以正反饋方式持續(xù)活化NF-κB通路，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)得以持續(xù)和放大〔10,11〕。本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞形態(tài)結(jié)果說(shuō)明炎癥細(xì)胞模型構(gòu)造成功。

TWP因其保留雷公藤的抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用，去除毒性部分，在臨床上主要用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、皮肌炎、腎臟疾病、紅斑狼瘡等疾病〔12〕。TNF-α由非免疫或免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，可與前炎癥因子共同啟動(dòng)早期炎癥反應(yīng)，并維持炎癥。IL-6是多效能的細(xì)胞因子，在炎癥和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用〔13,14〕。徐光標(biāo)等〔15〕研究表明TWP能夠下調(diào)糖尿病腎病患者炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)水平從而改善患者免疫失衡狀態(tài)，恢復(fù)腎臟功能，減少尿蛋白生成；進(jìn)一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TWP預(yù)處理可抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞促炎癥因子TNF-α和IL-6釋放，說(shuō)明TWP能夠改善LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性損傷。本研究結(jié)果說(shuō)明TWP能下調(diào)AR42J細(xì)胞促炎癥因子TNF-α、TNF-α和IL-1β的表達(dá)，減輕LPS所致AR42J細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

miRNA是目前生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，可促進(jìn)mRNA降解或抑制翻譯，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控基因，最終影響下游蛋白分子的表達(dá)。研究表明miR-146a能夠通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)TNF受體相關(guān)因子(TRAF)6和IL-1受體相關(guān)激酶(IRAK)1，降低NF-κB活性，從而進(jìn)一步降低下游促炎因子的表達(dá)〔16〕。本研究結(jié)果說(shuō)明TWP能夠上調(diào)炎癥AR42J細(xì)胞miR-146a表達(dá)水平來(lái)減輕炎癥損傷。周興宏等〔17〕發(fā)現(xiàn)三七皂苷R1可能通過(guò)上調(diào)miR-146a表達(dá)水平，降低TNF-α和IL-6表達(dá)水平，以降低動(dòng)脈粥樣硬化小鼠血脂、血糖水平，并保護(hù)肝功能。隨后研究〔18〕發(fā)現(xiàn)在PM1誘導(dǎo)的炎癥BEAS-2B細(xì)胞中IL-6和IL-8表達(dá)水平上調(diào)，并通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路上調(diào)miR-146a的表達(dá)，過(guò)表達(dá)的miR-146a通過(guò)抑制IRAK1/TRAF6表達(dá)來(lái)阻止p65的核轉(zhuǎn)位，并下調(diào)IL-6和IL-8的表達(dá)，說(shuō)明miR-146a可以通過(guò)BEAS-2B細(xì)胞中的NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)節(jié)PM1誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。本研究說(shuō)明AR42J細(xì)胞經(jīng)TWP處理后，TLR4/NF-κB信號(hào)通路受到抑制。

綜上所述，TWP可能通過(guò)上調(diào)miR-146a表達(dá)水平抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路，降低炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)水平，從而減輕LPS誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞炎癥損傷。