楊傳廣 席作武 王凱 韓曉麗

(河南中醫(yī)藥大學(xué) 1第二臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450000；2第二附屬醫(yī)院肛腸科)

結(jié)腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，我國結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。半邊蓮(LCL)是臨床上常用的抗癌中藥，用于治療肝癌 、肺癌 、胃癌、直腸癌、食道癌、宮頸癌等多種癌癥，其可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔1，2〕。研究發(fā)現(xiàn)LCL提取物對胃癌、肝癌細(xì)胞增殖有一定的抑制作用，并且其可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡〔3〕，但目前LCL對結(jié)直腸癌的影響研究較少。研究發(fā)現(xiàn)miR-20a在直腸癌、腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)〔4〕。miR-20a-3p靶向含有4個mbt區(qū)域的scm相關(guān)基因(SFMBT1)影響角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和凋亡〔5〕。脆性組氨酸三聯(lián)體(FHIT)在結(jié)直腸癌中下調(diào)表達(dá)，其可能參與結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，并有研究證明過表達(dá)FHIT可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲活性〔6〕。本研究旨在探究LCL通過miR-20a-3p/FHIT對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1材料 結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480(上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫)；LCL(福建省中醫(yī)藥研究院)；胎牛血清(法國 Biowest公司)；DMEM培養(yǎng)基、青-鏈霉素雙抗(美國Gibco公司)；miRNA 熒光定量試劑盒；RIPA裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒(美國Thermo scientificals公司)、Tranwell 小室(美國Millipore公司)；基質(zhì)膠(美國BD公司)；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(美國invitrogen公司)；miR-con、miR-con mimic、anti-miR-NC、anti-miR-20a-3p、si-NC、si-FHIT的構(gòu)建(上海吉凱基因公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(北京，天根生化科技有限公司)；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(美國 Sigma公司)；細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2、P21、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)一抗(美國Abcam公司)；上皮型鈣粘蛋白(E-cadherin)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、β-肌動蛋白(actin)抗體(美國CST公司)；FHIT過表達(dá)載體及空載體(廣州復(fù)能基因有限公司)；miR-20a-3p、FHIT引物(上海生工公司)；免疫球蛋白(Ig)G二抗(北京博奧森生物科技有限公司)。

1.2細(xì)胞的培養(yǎng)與分組 結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為對照組(Con)、LCL組，LCL組：取對數(shù)期細(xì)胞添加LCL，各組終濃度為150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L〔2〕分別記作LCL 150 mg/L組、LCL 200mg/L組、LCL 250 mg/L組、LCL 300 mg/L組，Con與LCL組繼續(xù)培養(yǎng)1 w進(jìn)行后續(xù)檢測，每組設(shè)置4個重復(fù)。

1.3miR-20a-3p抑制物及模擬物的轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期細(xì)胞3×105個接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑分別以miR-con、miR-20a-3p mimic、anti-miR-NC、anti-miR-20a-3p、si-NC、si-FHIT轉(zhuǎn)染至不同孔SW480細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后以無雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)，6 h后更換完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，每組設(shè)置4個重復(fù)。

1.4實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR) 收集生長狀態(tài)良好的細(xì)胞約1×107個提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行RT-qPCR，RT-qPCR反應(yīng)參數(shù)為95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，共40個循環(huán)。以U6和β-actin分別為miR-20a-3p、FHIT的內(nèi)參基因，2-ΔΔct方法計(jì)算miR-20a-3p、FHIT的相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。引物序列：miR-20a-3p：正義鏈3′-ACTGCATTATGAGCACTTAAAG-5′，反義鏈5′-AAGTGCTCATAATGCAGT-3′；U6：正義鏈5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反義鏈5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；FHIT：正義鏈5′-ATCCTGGAAGCTTTGAAGCTCA-3′，反義鏈5′-TCACTGGTTGAAGAATACAGG-3′；β-actin：正義鏈5′-TCACCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反義鏈5′-CTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′ 。

1.5MTT法檢測細(xì)胞增殖情況 終止培養(yǎng)前4 h每孔加入20 μl MTT繼續(xù)培養(yǎng)，離心棄上清保留下層細(xì)胞，每孔加入100 μl二甲基亞砜(DMSO)，避光震蕩孵育15 min，使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀檢測490 nm波長的吸光值(OD值)。抑制率=〔1-(OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)〕×100%。

1.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480細(xì)胞的遷移和侵襲能力 上述加藥處理、轉(zhuǎn)染后細(xì)胞2×104個接種于Transwells小室，上層含基質(zhì)膠，培養(yǎng)48 h后收集上層小室穿膜細(xì)胞于10 ml/L的多聚甲醛溶液，結(jié)晶紫溶液染色15 min，200倍光鏡下隨機(jī)選取5個視野統(tǒng)計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù)，每組設(shè)置4個重復(fù)。

1.7雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測miR-20a-3p對FHIT的影響 構(gòu)建野生型pGL3-FHIT-3′UTR(wt-FHIT 3′UTR)和突變型pGL3-FHIT-3′UTR(mut-pGL3-FHIT-3′UTR)表達(dá)載體，使用Lipofectamine TM2000轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染至miR-con、miR-20a-3p mimic SW480細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，檢測雙熒光素酶活性，檢測miR-20a-3p 對 FHIT 熒光活性的調(diào)控。

1.8采用蛋白印跡(WB)法檢測蛋白表達(dá)情況 收集上述處理細(xì)胞，提取細(xì)胞中總蛋白，測定蛋白濃度；十二烷基硫酸鈉(SDS)變性蛋白；電泳跑膠，濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影液顯影，使用AI600成像系統(tǒng)觀察、拍照，Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行灰度值比較。

1.9流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 收集上述處理細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗；加入250 μl PBS重懸細(xì)胞，避光條件下加入10 μl Annexin V-FITC混勻，室溫避光孵育15 min；然后加入5 μl PI混勻，孵育5 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1LCL對結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響 與Con組比較，LCL各劑量組結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480凋亡率、抑制率顯著增加、CyclinD1、Bcl-2蛋白水平顯著降低，P21、Bax蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見圖1、圖2、表1。

1～5：Con組、LDL 150 mg/L組、LDL 200 mg/L組、LDL 250 mg/L組、LDL 300 mg/L組圖1 LCL對結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480增殖、凋亡蛋白表達(dá)的影響

圖2 LCL對結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480凋亡的影響

表1 LCL對結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480增殖、凋亡的影響

根據(jù)藥物的IC50選擇250 mg/L濃度做后續(xù)實(shí)驗(yàn)，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測顯示，與Con組比較，LCL 250 mg/L組結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)顯著降低與Con組比較，LCL 250 mg/L組結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中E-cadherin蛋白水平顯著升高，MMP-2蛋白水平顯著降低。見表2、圖3、圖4。

表2 半邊蓮對結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480遷移、侵襲的影響

圖3 LCL對結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

圖4 LCL對結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

2.2半邊蓮對結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中miR-20a-3p、FHIT表達(dá)的影響 與Con組比較，LCL 250 mg/L組SW480細(xì)胞的miR-20a-3p mRNA水平顯著降低，F(xiàn)HIT的mRNA及蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見圖5，表3。

圖5 FHIT蛋白的表達(dá)

表3 半邊蓮對結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中miR-20a-3p、FHIT表達(dá)的影響

2.3抑制miR-20a-3p表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響 與anti-miR-NC組比較，anti-miR-20a-3p組SW480細(xì)胞miR-20a-3p mRNA水平顯著降低，CyclinD1、Bcl-2蛋白水平顯著降低，P21、Bax蛋白水平顯著升高，細(xì)胞抑制率、凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖6，表4；SW480細(xì)胞E-cadherin蛋白水平顯著升高，MMP-2蛋白水平顯著降低，細(xì)胞侵襲、遷移數(shù)顯著降低。見圖6，表4、5。

圖6 抑制miR-20a-3p表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480增殖、凋亡、遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

表4 抑制miR-20a-3p表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480增殖、凋亡的影響

表5 抑制miR-20a-3p表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480遷移、侵襲的影響

2.4過表達(dá)miR-20a-3p能逆轉(zhuǎn)LCL對結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480增殖、凋亡、遷移、侵襲的作用 與LCL 250 mg/L+miR-NC組比較，LCL 250 mg/L+miR-20a-3p組SW480細(xì)胞miR-20a-3p水平顯著升高，CyclinD1、Bcl-2蛋白水平顯著升高，P21、Bax蛋白水平顯著降低，細(xì)胞抑制率、凋亡率顯著降低(P<0.05)。與LCL 250 mg/L+miR-NC組比較，LCL 250 mg/L+miR-20a-3p組SW480細(xì)胞E-cadherin蛋白水平顯著降低，MMP-2蛋白水平顯著升高，細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移數(shù)目顯著升高(P<0.05)。見圖7、表6。

1～4：Con組、LDL 250 mg/L組、LDL 250 mg/L+miR-NC組、LDL 250 mg/L+miR-20a-3p組圖7 過表達(dá)miR-20a-3p能逆轉(zhuǎn)LCL對結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480增殖、凋亡、遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

表6 過表達(dá)miR-20a-3p能逆轉(zhuǎn)LCL對結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480遷移、侵襲的作用

2.5miR-20a-3p靶向、調(diào)控FHIT TargetScan軟件預(yù)測miR-20a-3p與FHIT 3′UTR存在結(jié)合位點(diǎn)(圖8)，熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-20a-3p與FHIT3′UTR的聯(lián)系，WT-FHIT 3′UTR與miR-20a-3p mimic共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。與miR-NC組比較，miR-20a-3p組FHIT蛋白水平顯著降低；與anti-miR-NC比較，anti-miR-20a-3p組FHIT蛋白水平顯著升高。見圖9，表7，表8。

圖8 FHIT的3′UTR含有miR-20a-3p的互補(bǔ)序列

1～4:miR-NC組、miR-20a-3p組、anti-miR-NC組、anti-miR-20a-3p組圖9 miR-20a-3p調(diào)控FHIT的表達(dá)

表7 雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)

表8 miR-20a-3p調(diào)控FHIT的表達(dá)

2.6抑制FHIT的表達(dá)能逆轉(zhuǎn)LCL對結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480增殖、凋亡、遷移、侵襲的作用 與LCL 250 mg/L+si-NC組比較，LCL 250 mg/L+si-FHIT組SW480細(xì)胞FHIT蛋白水平顯著降低，CyclinD1、Bcl-2、MMP-2蛋白水平顯著升高，P21、Bax、E-cadherin蛋白水平顯著降低，細(xì)胞抑制率、凋亡率顯著降低，遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增多(P<0.05)。見表1、圖10、表9。

1～4：Con、LDL 250 mg/L、LDL 250 mg/L+si-NC、LDL 250 mg/L+si-FHIT圖10 抑制FHIT的表達(dá)能逆轉(zhuǎn)半邊蓮對結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480增殖、凋亡、遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

表9 抑制FHIT的表達(dá)能逆轉(zhuǎn)半邊蓮對結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480遷移、侵襲的作用

3 討 論

LCL屬桔梗科植物，其主要化學(xué)成分為生物堿、皂甙、黃酮甙等，生物堿具有消腫、清熱解毒、抑癌功效〔7〕。目前研究報道，LCL對肺癌細(xì)胞、Hela細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞具有抑制作用，LCL通過抑制胃癌BG-38細(xì)胞增殖，抑制腫瘤的發(fā)展；LCL通過影響細(xì)胞內(nèi)鈣信號穩(wěn)態(tài)失衡誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡〔8，9〕。本研究中，不同濃度LCL處理結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞，結(jié)果顯示，LCL能夠促進(jìn)SW480細(xì)胞的凋亡，抑制增殖、遷移和侵襲，提示LCL可在結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用，可為臨床治療提供理論依據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)miR-20a在直腸癌、結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)〔10〕，miR-20a的高表達(dá)能夠反映結(jié)直腸癌的發(fā)生和進(jìn)展以及評估患者的預(yù)后〔11〕。miR-20a-5p在胃癌組織中隨著胃癌惡性程度的增加而降低，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)，降低miR-20a-5p的表達(dá)，可抑制胃癌的進(jìn)一步發(fā)展〔12〕。Xiong等〔13〕研究報道，miR-20a在甲狀腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，可通過抑制miR-20a的表達(dá)，抑制良性甲狀腺癌的惡化。本研究提示LCL 可能通過抑制miR-20a-3p的表達(dá)，抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移。

Bcl-2為抗凋亡蛋白，Bax為促凋亡蛋白，細(xì)胞中Bax與Bcl-2結(jié)合形成異二聚體，當(dāng)Bax表達(dá)過量可抑制Bcl-2的凋亡抑制作用促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔14〕?；啄ぶ械腗MP-2的表達(dá)活性升高可降解基底膜中的Ⅳ型膠原，促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移〔15〕。CyclinD1調(diào)控細(xì)胞增殖周期的G1-S過程，其在正常組織中不表達(dá)或者低表達(dá)，在惡性腫瘤組織中高表達(dá)〔16〕。P21是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑家族重要成員，可抑制CyclinD1的表達(dá)，發(fā)揮抑癌基因作用。Cadherin是一種鈣黏附蛋白，參與細(xì)胞間的黏附，其表達(dá)水平升高，抑制細(xì)胞的遷移、侵襲〔17〕。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-20a-3p對SW480細(xì)胞的影響，本研究進(jìn)行抑制、過表達(dá)miR-20a-3p實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示抑制miR-20a-3p后，CyclinD1、Bcl-2、MMP-2蛋白水平顯著降低，P21、Bax、E-cadherin蛋白水平顯著升高，細(xì)胞抑制率、凋亡率顯著升高，侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)顯著降低；過表達(dá)miR-20a-3p后，SW480細(xì)胞CyclinD1、Bcl-2、MMP-2蛋白水平顯著升高，P21、Bax、E-cadherin蛋白水平顯著降低，細(xì)胞抑制率、凋亡率顯著降低，侵襲、轉(zhuǎn)移數(shù)目顯著升高，進(jìn)一步驗(yàn)證了LCL通過miR-20a-3p的表達(dá)發(fā)揮對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的促凋亡作用。

本研究提示miR-20a-3p可靶向負(fù)調(diào)控FHIT的表達(dá)，miR-20a-3p。FHIT是定位于人3號染色體短臂3P14.2區(qū)，是組氨酸三聯(lián)體家族成員之一〔18〕。FHIT可通過上調(diào)P21的表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞的增殖。FHIT基因在食管癌、結(jié)直腸癌、胃癌組織中呈顯著低表達(dá)〔19〕。研究報道，將FHIT基因?qū)氲浇Y(jié)腸癌細(xì)胞系中，可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖活性和侵襲力〔20〕。本研究中LCL可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，抑制增殖、遷移與侵襲，抑制FHIT基因后，SW480細(xì)胞Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2蛋白水平顯著升高，P21、Bax、E-cadherin蛋白水平顯著降低，細(xì)胞抑制率、凋亡率顯著降低，遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增多，提示抑制FHIT基因可逆轉(zhuǎn)LCL的促凋亡、抑制增殖、遷移、侵襲作用。從機(jī)制上講LCL可能通過物通過miR-20a-3p/FHIT促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，抑制其增殖、遷移、侵襲。

綜上所述，本文初步探討了LCL通過miR-20a-3p/FHIT促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，抑制其增殖、遷移、侵襲的機(jī)制，為肝癌分子靶向治療提供理論依據(jù)。