師 洋，王志杰，王天儀

目前，急性橫貫性脊髓炎(acute transverse myelitis, ATM)臨床仍然缺乏行之有效的治療方法。兒童時(shí)期是ATM患者發(fā)病率較高的階段之一[1]。ATM患者存在暫時(shí)或永久性運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)和自主神經(jīng)功能障礙，約33%的患者遺留嚴(yán)重感覺(jué)功能異常[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)在基底膜降解過(guò)程中起作用，可以引起血腦屏障破壞，并在炎癥過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有研究報(bào)道中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)元自身表達(dá)的MMP-9上調(diào)[3-4]。Cardone等[5]研究發(fā)現(xiàn)MMP-9的過(guò)表達(dá)可直接影響神經(jīng)元生長(zhǎng)狀態(tài)。Gu等[6]報(bào)道，在體外培養(yǎng)神經(jīng)元中加入活化的MMP-9可改變其生長(zhǎng)狀態(tài)，而加入MMP-9抑制劑后可減少神經(jīng)元凋亡。Asahi等[7]報(bào)道MMP-9能夠特異性地降解髓鞘堿性蛋白(MBP)，以致廣泛的脫髓鞘和生長(zhǎng)錐崩解進(jìn)而導(dǎo)致中樞神經(jīng)傳導(dǎo)功能損傷。MicroRNA(miRNA)是可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的非編碼RNA，其與生物體的遺傳性狀、生長(zhǎng)發(fā)育和疾病的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系[8]。miRNA組學(xué)(miRNomes)能夠同時(shí)觀察在某個(gè)生命現(xiàn)象中全部已知關(guān)鍵miRNA發(fā)生的變化及其對(duì)靶基因組的動(dòng)態(tài)表達(dá)調(diào)控過(guò)程[9]。本研究旨在運(yùn)用miRNomes的方法以系統(tǒng)的、全局的視角去探尋兒童ATM關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制，并尋找精準(zhǔn)、高效的治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月—2019年6月在承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八一醫(yī)院診斷為ATM的患兒4例為觀察組，臨床懷疑相關(guān)疾病且經(jīng)腦脊液等相關(guān)檢查排除疾病后腦脊液正常的患兒3例為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：觀察組均符合2002年橫貫性脊髓炎聯(lián)盟工作組織(TMCWG)提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡<14歲。2組患兒監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：觀察組為除ATM外其他疾病者；近期曾患感染性疾病者；有家族遺傳病史者；有結(jié)核病史者；生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、營(yíng)養(yǎng)不良者。對(duì)照組近期曾患感染性疾病者；有家族遺傳病史者；有結(jié)核病史者；生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、營(yíng)養(yǎng)不良者。

1.2樣本采集和總RNA提取 2組均取腦脊液，并將觀察組腦脊液樣本隨機(jī)編號(hào)T1、T2、T3、T4，隨后凍存。生物信息分析試驗(yàn)部分將對(duì)照組樣本進(jìn)行混樣操作。本研究通過(guò)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，項(xiàng)目編號(hào)為201606A062。根據(jù)說(shuō)明書(shū)中的操作步驟，使用mirVanaTMPARISTMKit試劑盒(Ambion，美國(guó))提取總RNA。每例樣本取2 ml，迅速轉(zhuǎn)入抗凝管中用移液器混勻。在室溫下1 h內(nèi)進(jìn)行以下步驟：4 ℃條件下820×g離心10 min。取1 ml上清液放入無(wú)菌的1.5 ml離心管中離心，4 ℃，16 000×g，共10 min。將上清液移至干凈的離心管中，并保存在-80 ℃下備用。取400 μl樣本加入等量的2×Denaturing Solution渦旋混勻，放置于冰上，5 min后加入相同體積的氯仿，渦旋混勻(30～60 s)后室溫下離心，最高轉(zhuǎn)速，共5 min。取上清加入1.25倍體積的無(wú)水乙醇渦旋混勻。將其移至最大體積為700 μl的純化柱中離心，13 000×g，共30 s。向離心柱中加入350 μl 的miRNA Wash Solution 1，室溫下離心，13 000×g，共15 s，棄流過(guò)液，將離心柱放回收集管中。將10 μl DNase Ⅰ和 70 μl Buffer RDD QIAGEN混合，加入離心柱中的膜上于室溫放置，共15 min。向離心柱中加入350 μl miRNA Wash Solution 1，室溫下離心，13 000×g，共15 s，棄流過(guò)液，將離心柱重新放入收集管中。500 μl的 Wash Solution 2/3清洗純化柱2次，空柱離心1 min。將離心柱放在新的收集管中，加入100 μl 在95 ℃條件下預(yù)熱的Elution Solution，室溫下離心，最高轉(zhuǎn)速，共20～30 s，收集管中的液體即所提取的總RNA，在-70 ℃冰箱保存。

1.3miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析 采用miRNA 4.0芯片(Affymetrix，美國(guó))分析發(fā)生改變的miRNA。總RNA定量及完整性分別利用NanoDrop ND-2100(Thermo Scientific，美國(guó))和Agilent 2100(Agilent，美國(guó))檢測(cè)。確定樣品可用后依據(jù)芯片標(biāo)準(zhǔn)方案，對(duì)樣本標(biāo)記、芯片雜交和洗脫。原始圖像用Affymetrix Scanner 3000(Affymetrix，美國(guó))掃描獲得，應(yīng)用Expression Console version1.3.1(Affymetrix，美國(guó))數(shù)據(jù)分析軟件分析。將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行RMA標(biāo)準(zhǔn)化算法處理，獲得標(biāo)準(zhǔn)化后的表達(dá)譜數(shù)據(jù)。利用分層聚類分析法對(duì)樣本間差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行分析。

1.4miRNA的表達(dá)量檢測(cè) 應(yīng)用miScript Ⅱ Reverse Transcription Kit (Qiagen,德國(guó))，采用RT-qPCR檢測(cè)miRNA的表達(dá)量，以U6作為miRNA表達(dá)的內(nèi)參。應(yīng)用PrimerScript RT reagent Kit (TaKaRa,日本)檢測(cè)miRNA的表達(dá)量，以GADPH作為miRNA表達(dá)的內(nèi)參。

1.5MMP-9蛋白水平檢測(cè) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作步驟，使用美國(guó)R&D System公司生產(chǎn)的試劑盒檢測(cè)MMP-9基因蛋白水平。Western blot檢測(cè)細(xì)胞中MMP-9表達(dá)水平：將各樣本置入RIPA裂解液，加入蛋白酶抑制劑后離心分離。分離蛋白樣品轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。封膜后加入抗體，而后用ECL發(fā)光試劑檢測(cè)。

1.6細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 在無(wú)菌條件下，取出新生Wistar大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)放入D/F12+10%胎牛血清培養(yǎng)基中，放入24孔板，待神經(jīng)元貼壁后更換為Neurobasal+B27培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為空白組、擴(kuò)增亂序組、抑制亂序組、miR-133過(guò)表達(dá)組、miR-133抑制組。將miR-133b模擬物(miR-133b mimics)與抑制物(miR-133b inhibitor，GenePharma,中國(guó))參照說(shuō)明書(shū)流程進(jìn)行轉(zhuǎn)染(YIJUN，中國(guó))。

2 結(jié)果

2.1兒童ATM MicroRNA表達(dá)譜分析 與對(duì)照組比較，觀察組樣本中發(fā)生表達(dá)變化的miRNA共有681個(gè)。見(jiàn)圖1A。與對(duì)照組比較，T1～T4 miR-133b在各樣本中明顯下調(diào)，信號(hào)值分別為1.41、2.71、2.63、2.68。根據(jù)同一聚類miRNA可能具有相似生物學(xué)功能的理論[8]，本實(shí)驗(yàn)聚類分析結(jié)果顯示T1～T4樣本中miR-133b表達(dá)變化被聚為一類，執(zhí)行與健康對(duì)照樣本不同的生物學(xué)功能。見(jiàn)圖1B。因此本研究的治療靶點(diǎn)為miR-133b。RT-qPCR驗(yàn)證miR-133b表達(dá)和基因芯片結(jié)果一致。見(jiàn)圖1C。

圖1 各組腦脊液樣本中microRNA表達(dá)譜分析A.橫列為microRNA的表達(dá)差異(縱列為不同樣本，藍(lán)色為下調(diào)，黃色為上調(diào)，上方顏色標(biāo)尺為其余顏色所代表的變化)；B.miR-133b在各樣本中表達(dá)的聚類分析(藍(lán)色為下調(diào)，紅色為上調(diào)，上方顏色標(biāo)尺為其余顏色所代表的變化)；C.RT-qPCR檢測(cè)的各樣本miR-133b相對(duì)表達(dá)量

2.2miR-133b靶基因預(yù)測(cè) 應(yīng)用Target Scan數(shù)據(jù)庫(kù)以及查閱相關(guān)文獻(xiàn)預(yù)測(cè)出MMP-9為miR-133b的靶基因[10]，進(jìn)而探究miR-133b表達(dá)變化的意義。MMP-9 3' UTR的第43～49位點(diǎn):5' ...UGUAAAUCCCCACUGGGACCAAC..., hsa-miR-133b:3' AUCGACCAACUUCCCCUGGUUU。

2.3MMP-9蛋白表達(dá) 對(duì)照組MMP-9為237.24 μg/L，觀察組T1～T4分別為663.15、389.00、420.71、409.91 μg/L。與對(duì)照組比較，觀察組腦脊液樣本中MMP-9蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，其表達(dá)趨勢(shì)與miR-133b相反。見(jiàn)圖2。

圖2 觀察組T1～T4與對(duì)照組MMP-9蛋白與miR-133b表達(dá)水平比較MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶-9

2.4miR-133b通過(guò)MMP-9影響背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng) 與空白組比較，miR-133b過(guò)表達(dá)組背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元生長(zhǎng)狀態(tài)相對(duì)較好，軸突明顯延長(zhǎng)(P<0.05)。miR-133b抑制組背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)明顯弱于空白組(P<0.05)。見(jiàn)圖3A、3B。與空白組比較，miR-133b過(guò)表達(dá)組中MMP-9蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，miR-133b抑制組中MMP-9蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖3C。

圖3 5組背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中miR-133b與MMP-9蛋白及軸突生長(zhǎng)的關(guān)系A(chǔ)．背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元生長(zhǎng)狀態(tài)(免疫熒光×200)，紅色為用NF-200標(biāo)識(shí)的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元，藍(lán)色為DAPI；B.背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)情況；C.MMP-9蛋白表達(dá)水平；MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶-9；與空白組比較，aP<0.05

3 討論

ATM是橫貫性脊髓炎的炎癥亞型，在疾病發(fā)作后的急性期和亞急性期會(huì)出現(xiàn)脊髓損害臨床癥狀，導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)障礙。目前ATM的發(fā)病機(jī)制仍難以明確[11]。兒童時(shí)期是ATM發(fā)病率最高的時(shí)期之一。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用microarray 4.0芯片檢測(cè)相較于健康兒童樣本而言在ATM樣本發(fā)生差異表達(dá)的microRNA，以期尋找在ATM疾病中發(fā)生作用的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制。miR-133b在ATM樣本中明顯下調(diào)，因此初步將該miRNA納入研究。

本研究應(yīng)用Target scan數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，發(fā)現(xiàn)miR-133b的靶基因可能為MMP-9。有學(xué)者報(bào)道MMP-9能夠特異性地降解MBP，以致廣泛的脫髓鞘和生長(zhǎng)錐崩解進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)功能損害。本研究結(jié)果顯示，觀察組T1～T4與對(duì)照組MMP-9蛋白表達(dá)與miR-133b呈相反趨勢(shì)。這一結(jié)果在一定程度證明了MMP-9是miR-133b的靶基因，miR-133b可以造成MMP-9蛋白表達(dá)下調(diào)，而此時(shí)仍然需要細(xì)胞層次的功能驗(yàn)證。本研究以DRG神經(jīng)元為工具細(xì)胞，抑制或過(guò)表達(dá)miR-133b，觀察細(xì)胞軸突形態(tài)以及MMP-9蛋白表達(dá)改變，結(jié)果顯示在神經(jīng)元水平miR-133b能夠通過(guò)其靶基因MMP-9調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞軸突生長(zhǎng)狀態(tài)。

綜上所述，ATM患者患病后中樞神經(jīng)系統(tǒng)miR-133b表達(dá)下調(diào)，致使其靶基因MMP-9上調(diào)產(chǎn)生臨床癥狀。miR-133b是ATM潛在的治療靶點(diǎn)。ATM后有681個(gè)miRNA至少在任一樣本發(fā)生變化，本研究中miR-133b可能只是ATM潛在的治療靶點(diǎn)之一，今后的實(shí)驗(yàn)中我們將繼續(xù)探索其他可能發(fā)揮作用的關(guān)鍵miRNA及通路，為臨床治療ATM找到更多更有效的治療靶點(diǎn)和診斷標(biāo)志物。