黎 蓓，馬 艷，李 盈，程志祥

肝癌具易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移特性，短期病死率高，5年生存率始終低于50%，我國(guó)肝癌年死亡數(shù)占世界肝癌年死亡數(shù)的45%。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)修飾方式，指DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5' 碳位共價(jià)鍵結(jié)合的一個(gè)甲基基團(tuán)[1]。研究指出，抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的高甲基化可以通過(guò)招募甲基化結(jié)合蛋白及相關(guān)復(fù)合物，改變?nèi)旧|(zhì)空間結(jié)構(gòu)，阻止基因轉(zhuǎn)錄，使腫瘤抑制基因沉默，而此時(shí)相關(guān)基因的 DNA 序列并沒(méi)有發(fā)生改變，因此腫瘤抑制基因啟動(dòng)子上的高甲基化與腫瘤形成密切相關(guān)[2]。多數(shù)腫瘤抑制基因都存在啟動(dòng)子區(qū)域異常甲基化，部分基因甲基化率甚至達(dá)80%。細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1(suppressor of cytokine signaling 1, SOCS1)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1(glutathione S-transferase P1, GSTP1)及Dickkopf相關(guān)蛋白3(Dickkopf-related protein 3, DKK3)均是抑癌相關(guān)基因[3-5]?，F(xiàn)階段SOCS1、GSTP1及DKK3基因甲基化狀態(tài)及與肝癌臨床病理的關(guān)系報(bào)道較少?；诖耍狙芯炕仡櫺苑治隽烁伟┗颊甙┙M織中SOCS1、GSTP1及DKK3基因甲基化狀態(tài)及與臨床病理的關(guān)系，旨在為肝癌的生物標(biāo)志物研究提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月—2019年12月在本院接受手術(shù)治療的肝癌患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)性肝癌，并有病理組織學(xué)診斷結(jié)果佐證；留存肝癌癌組織標(biāo)本前無(wú)抗腫瘤治療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：轉(zhuǎn)移性肝癌；合并內(nèi)分泌疾??；合并免疫代謝性疾病。最終納入肝癌70例，男54例，女16例；年齡37～82(58.40±11.22)歲；腫瘤直徑≤5 cm者38例、>5 cm者32例。低分化14例，高-中分化56例；腫瘤包膜侵犯40例；肝外轉(zhuǎn)移8例，門(mén)靜脈癌栓6例，肝門(mén)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移6例；乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽(yáng)性56例；肝硬化44例；術(shù)前甲胎蛋白(AFP)陽(yáng)性44例。選取同期行手術(shù)治療的20例正常肝臟組織為對(duì)照組，包括肝血管瘤旁組織12例，肝外傷8例；術(shù)前檢測(cè)HBsAg均為陰性且無(wú)肝硬化，術(shù)后病理證實(shí)為正常肝組織。

1.2儀器與試劑盒 DNA甲基化修飾、春華試劑盒均購(gòu)自美國(guó)ZYMO RESEARCH公司；基因組DNA提取試劑盒、DNA引物由上海生工生物工程公司合成；PCR Mixture 2×Mix(BS-PCR002)購(gòu)自上海Bil-serve公司；100 bp DNA Msarket購(gòu)自日本Takkara公司；PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)MJ公司；紫外線分光光度儀(Nano Drop2000)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；臺(tái)式高速離心機(jī)(5417R)購(gòu)自德國(guó)Eppendorff公司；JS-380B全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自上海培清科技有限公司；多功能電泳儀(PowerBC-6002S1)購(gòu)自上海申能博彩生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1肝癌組織、癌旁組織、正常肝組織標(biāo)本采集：肝癌組織切除后避開(kāi)出血壞死區(qū)域切癌組織，取距肝癌組織邊緣5 cm以上的肝組織作為癌旁組織。肝癌組織、癌旁組織及正常肝組織切除大小均為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm,液氮速凍放至-80 ℃冰箱保存待檢。

1.3.2SOCS1、GSTP1及DKK3基因甲基化狀態(tài)檢測(cè)：參照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟提取肝組織DNA，收集DNA溶液，ZYMO甲基化試劑盒修飾提取DNA，修飾后的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火60 s、72 ℃延伸30 s，循環(huán)數(shù)35個(gè)；72 ℃延長(zhǎng)5 min，4 ℃時(shí)結(jié)束反應(yīng)。同樣方式將上述甲基化引物替換為非甲基化引物，退火溫度調(diào)整至58 ℃再次進(jìn)行非甲基化PCR擴(kuò)增，2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠成像分析目標(biāo)基因的甲基化表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1不同肝臟組織SOCS1、GSTP1、DKK3甲基化情況 正常肝組織未見(jiàn)SOCS1、GSTP1、DKK3基因甲基化現(xiàn)象。肝癌組織SOCS1、GSTP1、DKK3基因甲基化陽(yáng)性率顯著高于癌旁組織(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 不同肝臟組織SOCS1、GSTP1、DKK3基因甲基化情況[例(%)]

2.2肝癌組織SOCS1、GSTP1、DKK3基因甲基化與臨床病理的關(guān)系 HBsAg陽(yáng)性肝癌患者SOCS1基因甲基化陽(yáng)性率高于HBsAg陰性患者(P<0.01)；有血管侵犯的肝癌組織GSTP1基因甲基化陽(yáng)性率高于無(wú)血管侵犯的肝癌組織(P<0.01)；有肝硬化的肝癌組織DKK3基因甲基化陽(yáng)性率高于無(wú)肝硬化的肝癌組織(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 70例肝癌組織SOCS1、GSTP1、DKK3基因甲基化與臨床病理的關(guān)系(例)

2.3肝癌組織SOCS1、GSTP1、DKK3基因甲基化與臨床病理的相關(guān)性分析 肝癌組織SOCS1基因甲基化與HBsAg呈正相關(guān)(r=0.401，P<0.01)；肝癌組織GSTP1基因甲基化與血管侵犯呈正相關(guān)(r=0.416，P<0.01)；DKK3基因甲基化與肝硬化呈正相關(guān)(r=0.243,P<0.05)。

3 討論

DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)的主要修飾方式之一，其可通過(guò)甲基化調(diào)控基因表達(dá)以確?；蚪Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，與多種惡性腫瘤疾病的發(fā)生及發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)[6]。SOCS1最早被認(rèn)為是炎性抑制因子，基于SOCS1的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其可增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)內(nèi)毒素的耐受性，并通過(guò)間隔調(diào)控樹(shù)突狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)化成熟而避免機(jī)體過(guò)度免疫反應(yīng)[7]。近年來(lái)，陸續(xù)有研究指出SOCS1可作為潛在的抑癌基因，在多種腫瘤組織中均存在低表達(dá)現(xiàn)象，其啟動(dòng)子CpG島區(qū)域異常甲基化也在多種腫瘤組織中普遍存在，尤其是肝癌組織中[8]。本研究結(jié)果顯示，在正常肝組織中并未見(jiàn)SOCS1基因甲基化，但肝癌組織、癌旁組織均存在甲基化，且肝癌組織甲基化陽(yáng)性率高于癌旁組織；同時(shí)，HBsAg陽(yáng)性的肝癌組織SOCS1基因甲基化陽(yáng)性率顯著更高，且兩者有顯著相關(guān)性。與既往文獻(xiàn)一致。肝癌的發(fā)生與肝炎病毒有著密不可分的關(guān)系，有研究報(bào)道病毒性肝炎相關(guān)肝細(xì)胞癌的肝癌組織中抑癌基因啟動(dòng)子CpG島甲基化頻率要明顯高于非病毒相關(guān)性肝癌[9]。

GSTP1最早在人胎盤(pán)細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，而后研究證實(shí)其在腎臟、肺組織中均有表達(dá)，可代謝多種致癌化合物，從而避免細(xì)胞DNA損傷和抑癌基因激活[10-11]。邢紅宇等[12]報(bào)道，GSTP1基因可能成為診斷前列腺癌的可靠生物標(biāo)志物，指出GSTP1基因啟動(dòng)子甲基化可能造成GSTP1基因低表達(dá)，與前列腺癌發(fā)病率密切相關(guān)。而本研究結(jié)果顯示，在正常肝組織中并未見(jiàn)GSTP1基因甲基化，但肝癌組織、癌旁組織均存在甲基化，且肝癌組織甲基化陽(yáng)性率高于癌旁組織。由此可見(jiàn)，GSTP1甲基化或與肝癌發(fā)病存在一定關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果還顯示，存在血管侵犯的肝癌組織GSTP1甲基化陽(yáng)性率高于無(wú)血管侵犯的肝癌組織，GSTP1基因甲基化僅與肝癌血管侵犯存在顯著相關(guān)性。

DKK3屬Dickkopf家族成員，是新抑癌基因，也是經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的拮抗因子。有研究證實(shí)，多種惡性腫瘤疾病均存在DKK3 mRNA轉(zhuǎn)錄下調(diào)/表達(dá)缺失現(xiàn)象，DKK mRNA缺失參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[13]。DKK3基因啟動(dòng)子區(qū)富含CpG島，而啟動(dòng)子區(qū)CpG島的高甲基化則是導(dǎo)致抑癌基因失活的重要機(jī)制之一。DKK3在多種惡性腫瘤中失活，并伴隨啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化，通常作為抑癌基因發(fā)生抗腫瘤作用[14]。本研究結(jié)果顯示，正常肝組織未見(jiàn)DKK3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化現(xiàn)象，但肝癌組織、癌旁組織均存在甲基化現(xiàn)象，且肝癌組織DKK3基因甲基化陽(yáng)性率顯著高于癌旁組織。與宋國(guó)棟等[15]研究結(jié)論一致。但本研究中僅合并肝硬化的肝癌組織DKK3基因甲基化陽(yáng)性率顯著高于未合并肝硬化的肝癌組織，Spearman相關(guān)性分析也證實(shí)肝癌組織DKK3基因甲基化與肝硬化顯著相關(guān)。

綜上所述，肝癌組織存在SOCS1、GSTP1及DKK3基因甲基化現(xiàn)象，且SOCS1、GSTP1及DKK3基因甲基化與HBsAg陽(yáng)性、血管侵犯、肝硬化顯著相關(guān)。但本研究也存在一定局限性，在臨床病理資料采集上存在一定不足之處，擬在下階段采集更多病理特征后進(jìn)一步補(bǔ)充及完善。