于 婷，張娟麗，孫 晶，曲守方△，黃 杰

1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.河南省醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，河南鄭州 450003

血清總膽紅素(TBIL)是人體衰老紅細(xì)胞遭到破壞后產(chǎn)生血紅蛋白進(jìn)而衍化生成，是診斷新生兒高膽紅素血癥[1-3]及肝膽疾病等的重要指標(biāo)[4-6]。測定方法包括參考方法(Doumas法)[7]及常規(guī)方法如重氮法、化學(xué)氧化法/釩酸鹽氧化法和氧化酶法[8-10]等。YY/T 1205-2013 總膽紅素測定試劑盒(釩酸鹽氧化法)[11]行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)也已發(fā)布多年?；谧詸z驗(yàn)、監(jiān)督抽驗(yàn)等任務(wù)基礎(chǔ)，國內(nèi)大部分醫(yī)療器械檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)開展了總膽紅素檢測項(xiàng)目。為考察檢測機(jī)構(gòu)總膽紅素的檢測能力，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和公正性，同時(shí)促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室間的技術(shù)交流，2020年中國食品藥品檢定研究院(下稱本院)在全國范圍內(nèi)組織開展TBIL測定比對試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1材料 本次試驗(yàn)于2020年11-12月發(fā)放3份比對試驗(yàn)用樣本，其中1份為比對樣本，2份為干擾樣本。收集外觀透明、澄清，無明顯黃疸、溶血和脂血的血清，且傳染病4項(xiàng)(乙肝病毒表面抗原、丙肝病毒抗體、人類免疫缺陷病毒抗體和梅毒螺旋體抗體)均為陰性。對收集到符合要求的血清樣本依次進(jìn)行普通濾紙初濾、0.45 μm、0.22 μm濾膜過濾。過濾好的血清按照0.5 mL分裝，-70 ℃或以下條件下保存。

1.2方法

1.2.2比對樣本的均勻性和穩(wěn)定性分析 采用參考方法按照CNAS-GL003:2018《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價(jià)指南》[12]進(jìn)行均勻性、穩(wěn)定性評價(jià)。在樣本分裝的前期、中期和末期分別抽取15支、20支和15支，采用全自動(dòng)生化分析儀對抽取樣本進(jìn)行測定，每份樣本測定3次。利用單因素方差法進(jìn)行分析，當(dāng)F值小于自由度為(f1,f2)及顯著性水平(α=0.05)所對應(yīng)的臨界值Fα(f1,f2)，表明樣本之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在第1、2、3、5、7、12、20、30天這8個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均隨機(jī)取出6支樣本，分別置于20～25 ℃、2～8 ℃、-20 ℃條件下各2支。在第31天將所有樣本取出統(tǒng)一測定。所有取樣時(shí)間保持一致。采用全自動(dòng)生化分析儀對樣本進(jìn)行測定。每個(gè)樣本測定3次，取均值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，測定值為縱坐標(biāo)作圖，進(jìn)行線性擬合回歸分析，評價(jià)樣本測定值的趨勢性變化，并計(jì)算斜率k、截距b和斜率k的標(biāo)準(zhǔn)差sk。在自由度為n-2，置信水平P=0.95(95%的顯著水平)條件下，查t-分布臨界值表，得到對應(yīng)的t(0.95,n-2)值，計(jì)算t(0.95,n-2)·sk的值，比較|k|與t(0.95,n-2)·sk的值，如果|k|

1.3比對試驗(yàn)要求 本次比對試驗(yàn)，要求已有TBIL檢測能力認(rèn)可資質(zhì)的醫(yī)療器械檢測機(jī)構(gòu)必須參加，其他實(shí)驗(yàn)室自愿報(bào)名參加。參加實(shí)驗(yàn)室應(yīng)合理選擇具有注冊證的TBIL測定試劑盒及檢測儀器，按照作業(yè)指導(dǎo)書進(jìn)行檢測并報(bào)告結(jié)果，要求每份樣本應(yīng)重復(fù)測定不少于5次，計(jì)算測定均值(保留2位小數(shù))及變異系數(shù)(保留1位小數(shù))。作業(yè)指導(dǎo)書中要求：實(shí)驗(yàn)前取出的樣本應(yīng)避光恢復(fù)至室溫20～25 ℃，充分混合后檢測，且務(wù)必在4 h內(nèi)使用，整個(gè)操作過程中亦應(yīng)注意避光。

1.4試驗(yàn)結(jié)果判定原則 根據(jù)定值結(jié)果及參考YY/T 1205-2013 TBIL測定試劑盒(釩酸鹽氧化法)中“3.7.1批內(nèi)精密度”項(xiàng)“批內(nèi)精密度應(yīng)不大于5.0%”的要求，確定2條判定的基本原則：(1)比對樣本測定值應(yīng)在(27.10±2.71)μmol/L范圍內(nèi)；(2)3份樣本檢測結(jié)果的批內(nèi)精密度應(yīng)不大于5.0%。參加實(shí)驗(yàn)室的檢測結(jié)果必須同時(shí)滿足：比對樣本應(yīng)滿足(1)和(2)判定原則，且干擾樣本滿足判定原則(2)，方可判定為滿意，否則即判定為不滿意。

2 結(jié) 果

2.1比對樣本均勻性、穩(wěn)定性及定值結(jié)果 采用單因素方差分析方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，比對樣本F值為1.234 1，小于F0.05(1.355 2)，說明均勻性良好。結(jié)果見表1。

表1 比對樣本均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

對比對樣本進(jìn)行3種溫度條件下的30 d短期穩(wěn)定性評價(jià)，由表2結(jié)果可知，樣本在3種溫度條件下放置30 d均不穩(wěn)定，減少時(shí)間點(diǎn)數(shù)重新進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明，在20～25 ℃條件下，只在當(dāng)天穩(wěn)定；在2～8 ℃條件下，可穩(wěn)定2 d；-20 ℃條件下，可以穩(wěn)定5 d。同時(shí)對室溫20～25 ℃ 24 h內(nèi)的避光穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示20～25 ℃ 4 h內(nèi)穩(wěn)定。見表2、3。

表2 比對樣本穩(wěn)定性檢測結(jié)果(μmol/L)

3家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值，得到4組獨(dú)立數(shù)據(jù)，分別為(26.93、27.14、27.33、26.99 μmol/L)，比對樣本定值結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)不高于0.6%，表明各實(shí)驗(yàn)室建立的參考方法重復(fù)性好，數(shù)據(jù)可靠。最終以聯(lián)合定值的均值，作為比對樣本靶值，結(jié)果為27.10 μmol/L。

2.2比對試驗(yàn)結(jié)果 本次共有40家實(shí)驗(yàn)室報(bào)名參加本次比對試驗(yàn)，來自全國23個(gè)省(自治區(qū))、直轄市，包括各地醫(yī)療器械檢驗(yàn)所/食品藥品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)和大學(xué)/企業(yè)實(shí)驗(yàn)室。其中檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)30家，大學(xué)/企業(yè)實(shí)驗(yàn)室10家。最終，共有39家按要求提交了結(jié)果報(bào)告。根據(jù)評價(jià)原則，34家實(shí)驗(yàn)室的比對樣本血清TBIL測定值滿足要求，35家實(shí)驗(yàn)室3份樣本測定結(jié)果的CV滿足要求，最終獲得結(jié)果滿意的實(shí)驗(yàn)室為31家，滿意率為77.25%，結(jié)果不滿意的實(shí)驗(yàn)室為9家(含未上報(bào)數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)室)，不滿意率為22.75%。見表4。

表3 比對樣本穩(wěn)定性分析結(jié)果

表4 2020年血清中TBIL測定比對試驗(yàn)數(shù)據(jù)匯總表

3 討 論

本次比對試驗(yàn)選擇的是TBIL項(xiàng)目，由于膽紅素并不穩(wěn)定，容易見光分解，因此本院對其穩(wěn)定性進(jìn)行了較為充分的研究。除了通過30 d的短期穩(wěn)定性了解其在3種不同溫度下的穩(wěn)定時(shí)間外，還開展了長期穩(wěn)定性(-70 ℃或以下)的定期監(jiān)測，以及在分發(fā)樣本前，再次進(jìn)行了-20 ℃ 5 d的監(jiān)測，結(jié)果均滿意。在樣本正式發(fā)放時(shí)，選擇專業(yè)冷鏈公司采用干冰運(yùn)輸，并對整個(gè)運(yùn)輸過程中的溫度進(jìn)行監(jiān)控，以及確保5 d內(nèi)到達(dá)參加實(shí)驗(yàn)室，實(shí)際2～3 d即可到達(dá)。本院在作業(yè)指導(dǎo)書中亦明確告知參加實(shí)驗(yàn)室，收到樣本確認(rèn)完好且溫度至少在-20 ℃以下后，應(yīng)盡快置于-70 ℃或以下保存，開封后應(yīng)注意避光，并在4 h內(nèi)完成檢測。以上措施均保證了本次比對試驗(yàn)不會(huì)因樣本的問題影響各參加實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果，達(dá)到真正評價(jià)的是參加實(shí)驗(yàn)室的檢測能力。

對于本次產(chǎn)生不滿意的結(jié)果，分析主要可能有以下方面：(1)不嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行試驗(yàn)。有兩類情況比較突出，一是說明書要求使用配套的校準(zhǔn)品或者推薦采用某廠家校準(zhǔn)品，實(shí)際采用了其他廠家的校準(zhǔn)品；二是說明書中給出了試劑及樣本的加樣量，部分說明書提到試劑和樣本用量可根據(jù)不同儀器要求按比例改變。然而，部分參加實(shí)驗(yàn)室未按照要求加樣，或者不按比例減少加樣量。比如“樣本/R1/R2”的加樣量，要求8 μL/240 μL/60 μL，實(shí)際為8 μL/200 μL/50 μL，雖試劑加樣量是等比例減少，但樣本量并未等比例減少。實(shí)驗(yàn)室必須清楚意識到，說明書是廠家通過多次研究確定的操作程序，應(yīng)嚴(yán)格按照要求進(jìn)行操作，不應(yīng)隨意調(diào)整，如要改變，必須作性能確認(rèn)，否則可能存在一定風(fēng)險(xiǎn)；(2)對于試驗(yàn)結(jié)果不敏感。本次有4家實(shí)驗(yàn)室，均出現(xiàn)低值樣本檢測結(jié)果CV值超出5.00%，其中一家達(dá)到7.50%，5次測值結(jié)果在6.6～8.1 μmol/L內(nèi)，最小值和最大值之間的偏差為22.70%。這種結(jié)果并不正常。目前全自動(dòng)生化分析儀無論是國產(chǎn)還是進(jìn)口，重復(fù)性性能理想，一般不會(huì)發(fā)生這種情況。當(dāng)波動(dòng)很大時(shí)，儀器檢測過程中可能處于一種并不穩(wěn)定的狀態(tài)，因此必須要有一定的敏感性，及時(shí)發(fā)現(xiàn)存在的問題，并盡量找到原因；(3)未能合理選擇試劑盒。有4家實(shí)驗(yàn)室采用了同一家進(jìn)口試劑盒，3家比對樣本的結(jié)果不滿意，測值均偏高，1家雖判為滿意，但也是接近靶值的上限，這些數(shù)據(jù)表明，該試劑盒的準(zhǔn)確度可能存在一定的問題。

穩(wěn)定可靠的檢測能力是產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)的基礎(chǔ)和前提，而比對試驗(yàn)的結(jié)果是檢驗(yàn)檢測系統(tǒng)質(zhì)量保證能力和檢驗(yàn)水平的客觀體現(xiàn)，通過獲得滿意結(jié)果，體現(xiàn)了其檢驗(yàn)檢測結(jié)果的可靠性。如何在比對試驗(yàn)中獲得滿意的結(jié)果，參加實(shí)驗(yàn)室尤其是檢測機(jī)構(gòu)，要轉(zhuǎn)換思路，應(yīng)從試劑盒的性能評價(jià)轉(zhuǎn)到如何選擇合適的比對試劑上來，從考官的位置轉(zhuǎn)到考生的位置上來。筆者認(rèn)為有以下幾點(diǎn)值得借鑒：(1)必須建立檢測系統(tǒng)是一個(gè)整體的概念。完整的檢測系統(tǒng)包括檢測儀器、配套試劑與校準(zhǔn)品、操作程序的固定組合，而不是各部分的性能，所以應(yīng)嚴(yán)格按照說明書要求，選擇檢驗(yàn)適用儀器、配套試劑與校準(zhǔn)品等，不能隨意更換某一組分，才能確保檢測結(jié)果符合廠家的性能指標(biāo)，如有更改，必須進(jìn)行性能確認(rèn)。目前，我國生化試劑盒依然存在與進(jìn)口校準(zhǔn)品配合使用的現(xiàn)象，尤其是一些小企業(yè)。這種將自己的產(chǎn)品定值準(zhǔn)確性完全依賴進(jìn)口校準(zhǔn)品，如若出現(xiàn)問題，無法從源頭上分析原因，風(fēng)險(xiǎn)較大；(2)無論選擇進(jìn)口或國產(chǎn)試劑，在開展正式實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)在操作過程無誤以及確認(rèn)儀器狀態(tài)良好的情況下，采用TBIL國家或國際標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行準(zhǔn)確度的確認(rèn)[13-14]，如果所選試劑盒測值結(jié)果超過所允許的偏差，那么應(yīng)該選擇其他合適的試劑盒，而不能憑經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為進(jìn)口試劑質(zhì)量一定優(yōu)于國產(chǎn)試劑。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了這一點(diǎn)；(3)試驗(yàn)過程中應(yīng)細(xì)致嚴(yán)謹(jǐn)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)結(jié)果的不穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，應(yīng)及時(shí)探尋原因，可從儀器及人員方面進(jìn)行探查，包括：參數(shù)設(shè)置和光源是否正確；比色杯和吸樣針是否潔凈；實(shí)驗(yàn)用水是否被污染；反應(yīng)溫度是否正常；儀器是否定期校準(zhǔn)；外部環(huán)境是否沒有干擾；實(shí)驗(yàn)人員操作是否熟練等。如不能找到原因，也應(yīng)更換儀器進(jìn)行復(fù)測，并在復(fù)測前，采用其他樣本進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確保儀器處于穩(wěn)定的狀態(tài)。

本次比對試驗(yàn)總體滿意率為77.25%，結(jié)果較滿意。參加比對試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室主要為試劑盒質(zhì)量評價(jià)的檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)，這些實(shí)驗(yàn)室在試劑盒的注冊檢驗(yàn)、上市后監(jiān)督抽驗(yàn)等方面發(fā)揮重要技術(shù)支撐作用。9家不滿意實(shí)驗(yàn)室中，除2家為某評價(jià)中心外，有5家為省或直轄市的檢測機(jī)構(gòu)和2家試劑生產(chǎn)企業(yè)，提示這些機(jī)構(gòu)今后要特別注意加強(qiáng)檢驗(yàn)檢測能力的提升，也進(jìn)一步說明了參加比對試驗(yàn)是實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果質(zhì)量保證的重要手段，有助于實(shí)驗(yàn)室評價(jià)和證明其檢測數(shù)據(jù)的可靠性，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和糾正自身存在的問題。各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)積極參加比對試驗(yàn)，提升技術(shù)能力和實(shí)驗(yàn)室管理水平。本次比對試驗(yàn)為進(jìn)一步加強(qiáng)對檢測機(jī)構(gòu)、相關(guān)企業(yè)的監(jiān)督管理、規(guī)范檢測市場提供了依據(jù)。