王哲 祝率 劉歡 付薔 胡騰龍

口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)是一種侵襲性極強(qiáng)的惡性腫瘤，以易復(fù)發(fā)、高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為特征[1]，OSCC的診斷及治療一直是頭頸腫瘤學(xué)的研究熱點(diǎn)。目前OSCC治療方法還是以手術(shù)治療為主，放、化療為輔，但各期口腔鱗癌患者術(shù)后5年生存率僅為50%～60%，幾十年來(lái)未見明顯改善[2]。含Sushi重復(fù)蛋白X連鎖2(Sushi repeat containing protein X-linked 2，SRPX2)由Kurosawa發(fā)現(xiàn)于白血病細(xì)胞中，是一種分泌性蛋白質(zhì)。SRPX2的突變可導(dǎo)致癲癇、語(yǔ)言認(rèn)知功能障礙[3]，并與多種癌癥的發(fā)生、遷徙密切相關(guān)。Ras相關(guān)蛋白31(Ras-related protein 31，Rab31)亦可稱為Rab22b，RAS癌基因家族成員[4]，負(fù)責(zé)控制人類細(xì)胞蛋白和脂類的轉(zhuǎn)運(yùn)，也頻繁參與惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。研究證實(shí)SRPX2、Rab31聯(lián)合可以作為胰腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素[5]，但兩者在OSCC中的作用卻鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法，檢測(cè)SRPX2、Rab31在口腔鱗癌組織和正?？谇火つそM織(Normal oral mucosal，NOM)中的表達(dá)，并進(jìn)一步分析兩蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系及兩蛋白之間的相關(guān)性，以期為OSCC的靶向治療、預(yù)后評(píng)估提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2010年—2020年哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科的OSCC石蠟組織標(biāo)本68例。所有病理切片均證實(shí)為口腔鱗癌，臨床資料完整，術(shù)前均未接受放、化療及其他輔助療法。收集的病例中男性36例，女性32例；年齡范圍為22～90歲，≥60歲患者40例，<60歲患者28例；有吸煙史患者35例，無(wú)吸煙史患者33例；根據(jù)腫瘤組織分化程度分組：高分化鱗癌40例，中低分化鱗癌28例；根據(jù)TNM分組：T1～T2期30例，T3～T4期38例。根據(jù)有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組：存在轉(zhuǎn)移25例，不存在轉(zhuǎn)移43例。對(duì)照組為2018年—2020年間哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔頜面外科二病房非腫瘤患者的正?？谇火つOM組織，共30例。

1.2 主要試劑

兔抗人SRPX2蛋白抗體(bs-11967R)和兔抗人ras基因相關(guān)蛋白R(shí)ab31抗體(bs-19710R)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。免疫組化S-P試劑盒和DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化方法

將所有蠟塊修整后，切成厚度為5 μm的切片，放入熱水中燙平，貼載玻片上并烘干。常規(guī)HE染色，鏡下確認(rèn)病理分型。免疫組織化學(xué)SP法：將切片室溫下放置60 min，二甲苯脫蠟。無(wú)水、90%、85%、75%酒精逐級(jí)降濃度入水。PBS沖洗三次，5 min/次。80%甲醛滴加后室溫孵育10 min，PBS沖洗三次，5 min/次?？乖迯?fù)后PBS沖洗三次，5 min/次。滴加兔抗人SRPX2蛋白抗體一抗(1∶100)，兔抗人ras基因相關(guān)蛋白R(shí)ab31抗體一抗(1∶100)，在37℃下靜置1 h。常規(guī)PBS沖洗后滴加廣譜二抗，37℃下靜置1 h后PBS沖洗。室溫下DAB顯色10 min后蒸餾水沖洗中斷顯色過程。復(fù)染后沖洗10 min，常規(guī)脫水、透明、封片。

1.4 結(jié)果判定

結(jié)果判定由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行。每張片子先于低倍鏡下尋找細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、染色均勻的區(qū)域。轉(zhuǎn)高倍鏡(400×)后，于該區(qū)域隨機(jī)選取5個(gè)不重疊的視野。按鏡下呈現(xiàn)的染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性著色計(jì)分為0；淺黃色計(jì)分為1；棕黃色計(jì)分為2；深褐色計(jì)分為3。陽(yáng)性細(xì)胞百分率評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：≤10%計(jì)分為0；10%～50%計(jì)分為1；50%～80%計(jì)分為2；>80%計(jì)分為3。將兩種評(píng)分的結(jié)果相乘，乘積作為切片的最終評(píng)分：乘積<3分為低表達(dá)，記為陰性(-)；乘積≥3分為高表達(dá)，記為陽(yáng)性。

1.5 生物信息學(xué)分析

基于Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.oncomine.org/resource/login.html)對(duì)SRPX2和Rab31進(jìn)行分析，分析兩者在OSCC組織和NOM組織中的表達(dá)差異。SRPX2和Rab31數(shù)據(jù)均來(lái)自Peng Head-Neck數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集包含57例口腔鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本和22例正?？谇唤M織標(biāo)本，共計(jì)18 148個(gè)被測(cè)基因。

1.6 隨訪

對(duì)實(shí)驗(yàn)組的68例OSCC患者進(jìn)行電話隨訪，篩除隨訪時(shí)間小于6個(gè)月、隨訪期間接受外院其他治療患者10人，剩余58例患者隨訪時(shí)間范圍(8～82)個(gè)月，中位隨訪時(shí)間25.5個(gè)月。隨訪患者自確診為OSCC開始至隨訪截止或因任何原因引起的死亡的時(shí)間為總生存期(OS)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 26.0軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用χ2檢驗(yàn)分析OSCC組織和NOM組織中SRPX2和Rab31的表達(dá)差異及兩種蛋白表達(dá)與OSCC患者臨床病理特征的關(guān)系。應(yīng)用卡方檢驗(yàn)計(jì)算φ系數(shù)分析OSCC中SRPX2和Rab31的相關(guān)性。應(yīng)用R 4.05軟件進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，分析Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中OSCC組織和NOM組織中SRPX2和Rab31的表達(dá)差異。采用Kaplan-Meier方法和Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SRPX2和Rab31在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)情況

基于Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，SRPX2和Rab31在OSCC組織中的表達(dá)高于NOM組織(P<0.05)(圖1)。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中口腔鱗癌和正?？谇火つぶ蠸RPX2和Rab31的表達(dá)

2.2 OSCC和NOM組織中SRPX2和Rab31的表達(dá)

OSCC組織和NOM組織中，SRPX2主要定位于細(xì)胞質(zhì)，Rab31主要定位于細(xì)胞膜。68張OSCC組織切片中，SRPX2呈陽(yáng)性表達(dá)的切片共48張，陽(yáng)性表達(dá)率70.6%，Rab31呈陽(yáng)性表達(dá)的切片共45張，陽(yáng)性表達(dá)率66.2%；30張NOM組織切片中，SRPX2呈陽(yáng)性表達(dá)的切片共10張，陽(yáng)性表達(dá)率為33.3%。Rab31呈陽(yáng)性表達(dá)的切片共12張，陽(yáng)性表達(dá)率為40.0%。OSCC組織中SRPX2和Rab31的陽(yáng)性表達(dá)率高于NOM組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2，表1)。

圖2 SRPX2、Rab31在OSCC組織與NOM組織中的表達(dá)分布(400×)

表1 SRPX2和Rab31在OSCC組織與NOM組織中的表達(dá)

2.3 SRPX2和Rab31的表達(dá)與OSCC患者臨床病理特征的關(guān)系

OSCC組織中，SRPX2和Rab31的表達(dá)與患者的性別、年齡、吸煙史、TNM分期無(wú)關(guān)(P>0.05)，與腫瘤病理分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)(表2)。

表2 68例OSCC患者中SRPX2、Rab31的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 OSCC組織中SRPX2和Rab31表達(dá)的相關(guān)性

SRPX2與Rab31同時(shí)呈陽(yáng)性表達(dá)的共40例，同時(shí)呈陰性表達(dá)的共15例。OSCC組織中SRPX2和Rab31的表達(dá)存在相關(guān)性(φ=0.562，P<0.001)(表3)。

表3 OSCC組織中SRPX2和Rab31表達(dá)的相關(guān)性

2.5 SRPX2、Rab31高表達(dá)組和低表達(dá)組生存曲線

SRPX2高表達(dá)的患者較SRPX2低表達(dá)的患者預(yù)后較差(χ2=7.738，P=0.005)，且Rab31高表達(dá)的患者預(yù)后同樣明顯較Rab31低表達(dá)的患者差(χ2=8.577，P=0.003)(圖3)。

圖3 SRPX2和Rab31高表達(dá)及低表達(dá)患者的生存曲線

3 討論

OSCC靶向治療中使用高效、敏感的治療靶點(diǎn)可提高癌癥患者生存率，最大限度的保留患者咀嚼、語(yǔ)言功能，最大程度的減輕術(shù)后牙頜面畸形的程度，從而提高患者生活質(zhì)量。本研究利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)SRPX2和Rab31在OSCC組織和NOM組織中的表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SRPX2與Rab31在OSCC組織中的表達(dá)均高于NOM組織。通過免疫組化法，檢測(cè)OSCC組織和NOM組織中SRPX2和Rab31的表達(dá)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析兩種蛋白的表達(dá)與OSCC的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SRPX2與Rab31在OSCC組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，且兩者存在相關(guān)性，在NOM組織呈現(xiàn)低表達(dá)或不表達(dá)，生存曲線證實(shí)SRPX2和Rab31與OSCC患者的不良預(yù)后相關(guān)，提示SRPX2和Rab31可以聯(lián)合作為OSCC的靶向治療和預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)。

SRPX2作為腫瘤治療的新靶標(biāo)已在國(guó)內(nèi)外進(jìn)行了廣泛研究，目前多靶點(diǎn)治療已經(jīng)成為靶向治療的普遍模式，我們積極尋找另一個(gè)靶點(diǎn)與SRPX2相匹配。Rab31一直被認(rèn)為是重要的腫瘤啟動(dòng)因子，所以我們聚焦于Rab31，并將SRPX2和Rab31聯(lián)合研究，猜想兩者聯(lián)合應(yīng)用的廣闊前景。SRPX2是一種硫酸軟骨素蛋白多糖，近年來(lái)已有多位學(xué)者研究證實(shí)其在肝癌[6]、食管鱗狀細(xì)胞癌[7]、非小細(xì)胞肺癌[8]等多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)。SRPX2可以調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路，增高多種惡性腫瘤對(duì)順鉑的耐藥性[7]，降低腫瘤的化療敏感性。在鱗狀細(xì)胞癌組織中，SRPX2可以通過調(diào)節(jié)血管、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)來(lái)促進(jìn)血管、淋巴管再生[9]，為癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移提供途徑。PI3K/AKT通過直接調(diào)節(jié)、影響細(xì)胞存活調(diào)控作用等途徑抑制細(xì)胞凋亡，在腫瘤細(xì)胞中影響下游多種效應(yīng)分子發(fā)揮抗凋亡作用促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[10]。目前研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)SRPX2的表達(dá)，可以抑制前列腺癌細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR通路的激活，并因此抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移[11]。

Rab31最先克隆于黑素細(xì)胞cDNA中[12]，在機(jī)體中參與調(diào)控囊泡運(yùn)輸、胞吞胞吐等生理過程，在惡性腫瘤組織中通過多種分子通路廣泛參與腫瘤的發(fā)展過程[13]。Rab31過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增長(zhǎng)，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，激活細(xì)胞周期[14]。在乳腺癌細(xì)胞中，過表達(dá)的Rab31可以導(dǎo)致癌細(xì)胞由侵襲性表型向增殖性表型轉(zhuǎn)變，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力，降低黏附、侵襲能力[15]。Rab31可以通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路提高肝癌細(xì)胞中Bcl-2/BAX等級(jí)，抑制癌細(xì)胞凋亡[16]，提示SRPX2和Rab31存在共同的信號(hào)通路，再一次佐證兩者聯(lián)合治療的可行性。本次研究結(jié)果顯示，SRPX2與Rab31在OSCC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于NOM組織的表達(dá)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步研究分析發(fā)現(xiàn)，SRPX2和Rab31陽(yáng)性表達(dá)率與OSCC患者腫瘤分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。這提示我們通過檢測(cè)SRPX2與Rab31的表達(dá)水平，可以做到評(píng)估OSCC的惡性等級(jí)、作為患者預(yù)后評(píng)估指標(biāo)等，通過下調(diào)兩者的表達(dá)來(lái)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，從而抑制口腔鱗癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。

尿激酶型纖溶酶原激活物(Urokinase type plasminogen activator，uPA)和其特異性的受體纖溶酶原激活物受體(Urokinase type plasminogen activator receptor，uPAR)組成uPA/uPAR系統(tǒng)，uPA/uPAR系統(tǒng)可以將纖溶酶原激活為纖溶酶，而纖溶酶又裂解并激活基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPs)[17]。在腫瘤組織中，MMPs通過將細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)組分降解來(lái)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞遷徙、增殖的能力[18]。在OSCC的腫瘤微環(huán)境中，uPA可以影響全長(zhǎng)和uPAR(Ⅱ～Ⅲ)的比值，潛在的影響OSCC細(xì)胞的遷移和侵襲[19]。目前研究發(fā)現(xiàn)SRPX2是uPAR的一種新型配體[20]，可以通過uPAR通路和整合素/FAK通路的協(xié)同作用來(lái)促進(jìn)血管生成[21]。新生的血管可以為腫瘤細(xì)胞帶來(lái)氧氣和營(yíng)養(yǎng)，為腫瘤細(xì)胞提供轉(zhuǎn)移的途徑。uPAR與活性不依賴二價(jià)離子的甘露糖6-磷酸受體(CI-M6PR)相互作用可使uPAR進(jìn)入核內(nèi)體降解從而調(diào)節(jié)細(xì)胞表面uPAR的水平，而Rab31則負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)CI-M6PR從高爾基體到核內(nèi)體的轉(zhuǎn)運(yùn)。Rab31可能通過調(diào)節(jié)CI-M6PR的轉(zhuǎn)運(yùn)從而控制uPAR的活性，影響腫瘤的發(fā)生和侵襲[22]。在OSCC組織中，SRPX2和Rab31可能共同參與調(diào)節(jié)uPA/uPAR系統(tǒng)，增強(qiáng)OSCC細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力。這可能是SRPX2、Rab31和OSCC患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的原因之一。

綜上所述，本研究結(jié)果提示SRPX2和Rab31聯(lián)合應(yīng)用可以為OSCC患者治療和預(yù)后分析提供新方向。通過對(duì)SRPX2和Rab31在OSCC中的陽(yáng)性表達(dá)率以及兩者的相關(guān)性進(jìn)行了分析后，結(jié)合當(dāng)前兩種蛋白分別對(duì)uPA/uPAR系統(tǒng)的影響，我們雖然有理由猜測(cè)SRPX2和Rab31可能共同通過調(diào)節(jié)uPA/uPAR系統(tǒng)促進(jìn)OSCC的轉(zhuǎn)移，但仍需要進(jìn)一步的研究確認(rèn)兩者促進(jìn)OSCC發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制。