黃容，陳紅莉，姜標(biāo)?

①上?？萍即髮W(xué) 免疫化學(xué)研究所，上海 201210；②上?？萍即髮W(xué) 物質(zhì)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 201210

1 抗體藥物偶聯(lián)物

抗體藥物偶聯(lián)物（antibody-drug conjugates,ADCs）是生物制藥領(lǐng)域中發(fā)展最為迅速的一類生物大分子藥物，由腫瘤抗原特異性單抗、有效的細(xì)胞毒性分子（有效載荷）以及結(jié)合它們的連接子三個(gè)部分組成（圖1）[1-2]。ADCs的誕生是基于一種理想的前藥設(shè)計(jì)理念，希望將藥物分子和抗體二者的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，利用抗體的特異專一性，有效輸送高活性藥物分子到特定靶標(biāo)，到達(dá)目標(biāo)細(xì)胞時(shí)再將藥物分子釋放出來(lái)，限制與非目標(biāo)細(xì)胞的作用，從而降低毒性，實(shí)現(xiàn)藥效。近年來(lái)隨著抗體技術(shù)、小分子毒素及偶聯(lián)技術(shù)的進(jìn)步和突破，全球掀起了研發(fā)ADCs藥物的熱潮，美國(guó)FDA已先后批準(zhǔn)了10款A(yù)DCs藥物上市（Mylotarg、Adcetris、Kadcyla、Besponsa、Padcev、Polivy、Enhertu、Trodelvy、Blenrep和Zynlonta）（圖2），目前還有80多個(gè)ADCs藥物處于臨床研究階段[3-8]。

圖1 ADC藥物的結(jié)構(gòu)

2 抗體藥物偶聯(lián)物的偶聯(lián)方法

目前上市的ADCs都是通過(guò)對(duì)抗體氨基酸殘基直接進(jìn)行化學(xué)修飾偶聯(lián)上細(xì)胞毒素而獲得的，主要分為兩類：一類是使用N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）酯的活化羧基與抗體的賴氨酸殘基進(jìn)行偶聯(lián)，上市藥物Mylotarg、Kadcyla和Besponsa就是通過(guò)該方法制備得到的（圖2）；另一類是通過(guò)使用巰基特異性試劑（如馬來(lái)酰亞胺）與半胱氨酸反應(yīng)來(lái)合成的，上市藥Adcetris、Padcev、Polivy、Enhertu、Trodelvy、Blenrep和Zynlonta都是通過(guò)這種偶聯(lián)方法合成的（圖2）?；谫嚢彼崤悸?lián)所得的ADCs，通過(guò)肽圖已確定偶聯(lián)發(fā)生在重鏈和輕鏈上約40個(gè)不同的賴氨酸殘基上，從而可以產(chǎn)生超過(guò)100萬(wàn)個(gè)不同的異構(gòu)體。因此該方法制得的ADCs均一性差。而基于抗體半胱氨酸的偶聯(lián)，復(fù)雜程度相較而言有所降低?？贵w本身并不含有半胱氨酸殘基，但它含有4對(duì)易于接近的鏈間硫-硫鍵，還原后可得到8個(gè)巰基。因此，當(dāng)8個(gè)巰基全部偶聯(lián)上藥物分子時(shí)，所得ADCs均一性較好。而當(dāng)藥物-抗體比例（drug-antibody ratio,DAR）控制在4左右或更低時(shí)，仍舊為多個(gè)不同修飾位點(diǎn)的混合物。不同載藥量、不同連接位置的混合物將會(huì)極大地影響藥物的質(zhì)量控制、藥代性質(zhì)和治療窗口[9]。因此，通過(guò)定位偶聯(lián)（確定的反應(yīng)位點(diǎn)和偶聯(lián)數(shù)目）獲得均一性產(chǎn)物，在新一代ADCs的發(fā)展中尤為重要[10-12]。

圖2 FDA批準(zhǔn)上市的ADCs藥物

近年來(lái)，隨著科學(xué)家們的不斷努力，多種偶聯(lián)技術(shù)被報(bào)道用于定位合成ADCs，以獲得DAR值均一性好、藥代動(dòng)力學(xué)和安全性更佳的ADCs。隨著生物正交化學(xué)和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域的發(fā)展，科學(xué)家們已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種用于定點(diǎn)修飾抗體的方法，包括定點(diǎn)突變半胱氨酸殘基用于偶聯(lián)的THIOMAB技術(shù)[13]、引入非天然氨基酸的ncAAs技術(shù)[14-15]、引入硒半胱氨酸的selenomabs技術(shù)[16-18]、通過(guò)親和肽或小分子誘導(dǎo)的抗體選擇性修飾的AJICAP技術(shù)[19-21]等等?；诿复呋目贵w選擇性修飾也是一種常用的得到均一性ADCs的手段，如transglutaminases（mTG）介導(dǎo)的偶聯(lián)技術(shù)[22-23]、sortase介導(dǎo)的抗體結(jié)合（SMAC）技術(shù)[24-25]、遺傳編碼一段肽標(biāo)簽用于進(jìn)一步的酶促修飾的SMARTag技術(shù)等等[26-28]。另外，基于抗體糖基化的選擇性修飾也陸續(xù)被報(bào)道[29-30]。

3 二硫鍵橋連技術(shù)

相較而言，基于天然抗體的化學(xué)偶聯(lián)方法在成本和方便性方面更具競(jìng)爭(zhēng)力。近幾年，利用抗體中的4對(duì)鏈間硫-硫鍵，先還原再橋連而發(fā)展的“ThioBridge”技術(shù)逐漸顯示其優(yōu)越性，包括：可以實(shí)現(xiàn)直接對(duì)天然抗體定位修飾、抗體適用性廣、DAR值可控、所得ADCs均一性高等[31-32]。該方法首先對(duì)抗體中的4對(duì)鏈間二硫鍵，用還原性化合物如三（2-羧乙基）膦 （TCEP） 進(jìn)行還原，然后利用與半胱氨酸選擇性反應(yīng)的試劑對(duì)抗體二硫鍵進(jìn)行重新橋連的同時(shí)引入細(xì)胞毒性藥物。該方法不僅能夠保持原有二硫鍵的穩(wěn)定作用，并且可以控制每對(duì)二硫鍵只偶聯(lián)一個(gè)連接分子，從而實(shí)現(xiàn)定位偶聯(lián)。目前，研究較多的二硫鍵橋連試劑主要有雙砜（bissulfones）化合物、新一代馬來(lái)酰亞胺（NGMs）化合物和噠嗪二酮（PDs）類化合物等。近年來(lái)也涌現(xiàn)出許多其他的化合物，包括使用芳炔二丙腈（ADPN）、二乙烯基嘧啶（DVP）、二溴甲基雜環(huán)（C-Lock）、二氯丙酮或鉑（II）配合物、N-苯基雙乙烯基磺酰胺化合物和雙（乙烯基磺?；┻哙海˙VP）化合物等，用于抗體中二硫鍵的重新橋連。

3.1 雙砜化合物

1990年Bioconjugate Chemistry首次報(bào)道了將雙砜化合物用于蛋白質(zhì)中二硫鍵的重新橋連，隨后隨著ADCs研究的興起與發(fā)展，該方法進(jìn)一步應(yīng)用到ADCs的合成中[33-34]。從反應(yīng)機(jī)理來(lái)說(shuō)，反應(yīng)是先通過(guò)原位消除一個(gè)磺酰基生成一個(gè)α,β-不飽和羰基，進(jìn)而與半胱氨酸殘基發(fā)生邁克爾（Michael）加成反應(yīng)生成硫醚鍵。重復(fù)這個(gè)消除-加成過(guò)程使兩個(gè)半胱氨酸殘基通過(guò)一個(gè)三碳橋進(jìn)行共價(jià)橋連。2014年，Badescu等人[35]首次將這一策略應(yīng)用于ADCs的合成，他們報(bào)道了將一種雙砜試劑通過(guò)PEG24的鏈和一個(gè)可裂解的Val-Cit-PABC結(jié)構(gòu)連接到MMAE上，用于曲妥珠單抗二硫鍵的重新橋連（圖3）。用疏水作用色譜法（HIC）分析所得的ADCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約有78%的產(chǎn)物就是預(yù)期的DAR值為4的偶聯(lián)物。其余的組分由于連接子反應(yīng)不足或反應(yīng)過(guò)度，得到了10%的DAR值為3的偶聯(lián)物和11%的DAR值為5的偶聯(lián)物。ADCs在人血清白蛋白（HSA）的存在下，5天內(nèi)表現(xiàn)出極高的穩(wěn)定性，且在小鼠異種移植腫瘤模型中，以20 mg/kg的劑量給藥5次后，ADCs展現(xiàn)出比曲妥珠單抗更好的抗腫瘤活性。在Bryant等人[36]的后續(xù)研究中，對(duì)類似的抗HER2的曲妥珠單抗偶聯(lián)物（該ADCs含有較短的PEG6鏈）進(jìn)行了藥效評(píng)估，并與已上市的HER2靶向ADC藥物T-DM1進(jìn)行對(duì)比。在JIMT-1小鼠異種移植腫瘤模型中，兩個(gè)ADCs在5 mg/kg的劑量時(shí)展現(xiàn)了相似的活性，但是在10 mg/kg的劑量時(shí)雙砜橋連的ADC明顯比T-DM1更有效。

圖3 使用雙砜化合物重新橋連抗體的鏈間二硫鍵產(chǎn)生均一的ADCs

有假設(shè)認(rèn)為可裂解的Val-Cit二肽結(jié)構(gòu)在血液循環(huán)中的提前降解會(huì)降低雙砜橋連的ADC的療效。眾所周知，連接子結(jié)構(gòu)（包括聚乙二醇片段）和偶聯(lián)位點(diǎn)會(huì)影響Val-Cit結(jié)構(gòu)在小鼠血漿中的穩(wěn)定性[37-38]。因此，Pabst等人[39]研究了PEG鏈對(duì)含有Val-Cit-PABC可裂解機(jī)制的雙砜偶聯(lián)ADCs的藥效和穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)在小鼠體內(nèi)，帶有PEG支鏈或沒(méi)有PEG鏈的雙砜橋連ADCs明顯比帶有線性PEG鏈的雙砜橋連ADCs更穩(wěn)定。此外，與已上市的抗CD30的ADC Adcetris相比，帶有支鏈的ADC具有更好的穩(wěn)定性，且在CD30陽(yáng)性的小鼠異種移植腫瘤模型中單劑量（1 mg/kg）治療后腫瘤完全消退，體內(nèi)療效很好（圖3）。

Abzena公司向多家制藥公司授權(quán)其雙砜連接劑技術(shù)，商標(biāo)名ThioBridge。多個(gè)使用此技術(shù)的藥物已經(jīng)處在臨床前和臨床試驗(yàn)的研究中。例如，OBI-999是由OBI制藥公司開(kāi)發(fā)的ADC，是將MMAE有效載荷通過(guò)雙砜連接劑偶聯(lián)至人源抗Globo H抗體上而合成的（圖3）[40]?；谄渑R床前數(shù)據(jù)，F(xiàn)DA授予該ADC治療胃癌和胰腺癌的孤兒藥資格。OBI目前正在招募局部晚期或轉(zhuǎn)移性實(shí)體腫瘤患者，包括胃癌、胰腺癌、食道癌和結(jié)直腸癌，進(jìn)行I/II期臨床研究。另一個(gè)基于雙砜連接劑的ADC——HTI-1511，是由Halozyme公司開(kāi)發(fā)，由靶向EGFR的抗體與有效負(fù)載MMAE偶聯(lián)而得。該ADC在患者來(lái)源的小鼠異種移植腫瘤模型中顯示出有效的腫瘤生長(zhǎng)抑制或退化，包括KRAS/BRAF突變的模型，該突變通常與EGFR靶向治療的耐藥性和不良預(yù)后有關(guān)[40]。此外，HTI-1511已被證明在靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型中具有良好的耐受性。

Pabst等人[39]最近發(fā)表了使用雙砜試劑重新橋連二硫鍵的詳細(xì)步驟，將有助于該試劑更廣泛地應(yīng)用。通用的反應(yīng)條件是非常溫和的，將還原的抗體與5～6當(dāng)量的雙砜試劑在pH為7.5的緩沖液中在22 ℃下共同孵育16 h。約有75%～85%的抗體反應(yīng)形成DAR值為4的偶聯(lián)物，通過(guò)HIC進(jìn)一步純化后，可得到完全均一的DAR值為4的ADCs。OBI-999的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）數(shù)據(jù)表明，ADC是兩種異構(gòu)體的混合物，一種是所有的鏈間二硫鍵以原本的配對(duì)方式全部重新橋連的偶聯(lián)物，而另一種是“半抗體”偶聯(lián)物，即抗體重鏈鉸鏈區(qū)半胱氨酸之間形成了非原生的鏈內(nèi)二硫鍵橋連，而失去了原有的抗體重鏈之間的共價(jià)連接。目前尚不清楚這種異質(zhì)性是否會(huì)影響ADC的性能。

3.2 新一代馬來(lái)酰亞胺（next-generation maleimides,NGMs）化合物

新一代馬來(lái)酰亞胺（NGMs）是一類用兩個(gè)鹵化物或硫代苯酚離去基團(tuán)修飾的馬來(lái)酰亞胺試劑。將這種NGMs試劑用于二硫鍵重新橋連最早是由Smith等人[41]在2010年提出的，當(dāng)時(shí)他們發(fā)現(xiàn)這些試劑可以通過(guò)連續(xù)的加成-消除反應(yīng)有效地實(shí)現(xiàn)二硫鍵的重新橋連，在兩個(gè)半胱氨酸殘基之間插入一個(gè)雙碳橋。2014年，Schumacher等人[42]首次將這種方法應(yīng)用在制備ADCs中。有報(bào)道稱，將還原的曲妥珠單抗與5當(dāng)量的二溴馬來(lái)酰亞胺（dibromomaleimide,DBM）或二硫代苯酚馬來(lái)酰亞胺（dithiophenylmaleimide,DSPh）共孵育，在1 h之內(nèi)就可以將還原的二硫鍵全部重新橋連。這說(shuō)明與傳統(tǒng)的馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)一樣，該反應(yīng)具有很快的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。研究者指出，所產(chǎn)生的偶聯(lián)物是不均一的，同時(shí)存在天然重新橋連的“全抗體”偶聯(lián)物和非天然重新橋連的“半抗體”偶聯(lián)物。研究發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)同時(shí)添加還原劑和連接劑，減少半抗體的形成，這表明減少還原半胱氨酸殘基的停留時(shí)間可以降低它們的錯(cuò)配概率。該改進(jìn)策略已被用于曲妥珠單抗與含有炔基支架的二硫代苯酚馬來(lái)酰亞胺試劑的偶聯(lián)反應(yīng)中，隨后通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)連接上細(xì)胞毒素阿霉素分子，得到具有較好均一性的DAR值為4的ADCs（圖4）。

和傳統(tǒng)的馬來(lái)酰亞胺一樣，NGMs在有游離硫醇存在時(shí)是不穩(wěn)定的，除非將其水解成馬來(lái)酸的形式[43]。Nunes等人[44]證明，含有NGMs的抗體偶聯(lián)物在pH為8.4的緩沖液中72 h后會(huì)完全水解，且得到的水解偶聯(lián)物在人血漿中7天內(nèi)仍完全穩(wěn)定。該水解策略被用于合成DAR值為4的ADC，將曲妥珠單抗與含有不可裂解的PEG12鏈和MMAE有效荷載的二硫代苯酚馬來(lái)酰亞胺連接子偶聯(lián)（圖4）。該ADC的體內(nèi)活性比未經(jīng)修飾的曲妥珠單抗更好，以20 mg/kg的劑量給藥三次可使小鼠的腫瘤完全消退[45]。

圖4 使用新一代馬來(lái)酰亞胺化合物重新橋連抗體的鏈間二硫鍵產(chǎn)生均一的ADCs

在此基礎(chǔ)上，研究人員比較了使用NGM構(gòu)建的ADC和通過(guò)馬來(lái)酰亞胺修飾半胱氨酸殘基得到的平均DAR值為4的不均一的ADCs的體內(nèi)穩(wěn)定性和有效性[46]。使用一種不可裂解的二溴馬來(lái)酰亞胺連接子將MMAF與曲妥珠單抗或抗CD98的抗體IGNX偶聯(lián)，得到均一的DAR值為4的ADCs。在這兩個(gè)實(shí)例中，與它們對(duì)應(yīng)的不均一的ADCs相比，NGM構(gòu)建的ADCs在小鼠體內(nèi)的循環(huán)半衰期顯著增加而且可使腫瘤持續(xù)消退。盡管這些結(jié)果是有前景的，但NGMs試劑的主要缺點(diǎn)是其需要72 h的水解來(lái)保證穩(wěn)定性。Morais等人[47]研究發(fā)現(xiàn)可通過(guò)增加馬來(lái)酰亞胺結(jié)構(gòu)周圍的電子缺失和空間體積來(lái)加速水解過(guò)程。具體來(lái)說(shuō)，在馬來(lái)酰亞胺環(huán)相鄰位置引入甘氨酸衍生結(jié)構(gòu)可將水解時(shí)間從72 h減少到1 h（圖4）。

雖然大多數(shù)報(bào)道的NGMs構(gòu)建的ADCs使用的是不可裂解的連接子，但是，也有報(bào)道它們與組織蛋白酶可裂解連接子的聯(lián)合使用。Bryden等人[48]發(fā)現(xiàn)可以將Val-Ala和Val-Cit二肽結(jié)構(gòu)引入到NGMs連接子中，但是Val-Ala結(jié)構(gòu)的疏水性會(huì)顯著降低反應(yīng)性，而使用Val-Cit-NGM連接子大約也只有50%的抗體能夠轉(zhuǎn)化成預(yù)期的DAR值為4的ADC。后來(lái)通過(guò)引入PEG鏈來(lái)解決疏水性的問(wèn)題，可以分別得到具有這兩個(gè)二肽結(jié)構(gòu)的ADCs。近年來(lái)，科學(xué)家們還研究了不同取代模式對(duì)NGMs穩(wěn)定性和均一性的影響。例如，F(xiàn)orte等人[49]報(bào)道二碘馬來(lái)酰亞胺化合物比二溴馬來(lái)酰亞胺化合物穩(wěn)定。此外，F(xiàn)euillatre等人[50]報(bào)道和二溴馬來(lái)酰亞胺和二硫代苯酚馬來(lái)酰亞胺試劑相比，使用雜化硫溴馬來(lái)酰亞胺（TBMs）試劑可以得到具有更狹窄的DAR分布的更均一的ADCs。NGMs已被多次證明能夠產(chǎn)生具有高度均一性的ADCs。環(huán)水解的優(yōu)化顯著提高了這種方法的應(yīng)用性，可合成具有較高血漿穩(wěn)定性的ADCs。NGMs連接子除了與MMAE和阿霉素等多種傳統(tǒng)有效載荷兼容外，最近研究證明它可以與PROTAC有效載荷偶聯(lián)生成新一代的ADCs，展示了其廣泛的適用性[51]。

3.3 噠嗪二酮（pyridazinediones,PDs）類化合物

Chudasama等人[52]最初將噠嗪二酮（PDs）類化合物作為一種巰基可裂解的連接子用于多肽偶聯(lián)和前藥開(kāi)發(fā)。與NGMs類似，PDs具有兩個(gè)離去基團(tuán)，通過(guò)連續(xù)的加成-消除反應(yīng)與半胱氨酸殘基發(fā)生反應(yīng)，在兩個(gè)殘基之間插入一個(gè)雙碳橋。雖然形成的連接可以被其他的游離硫基切斷，但通常需要較高濃度的硫基，且許多研究已經(jīng)證明了PD衍生偶聯(lián)物在人血漿中具有很好的穩(wěn)定性。2017年，Robinson等人[45]使用PD連接子將含有組織蛋白酶可裂解或不可裂解的MMAE有效載荷偶聯(lián)到抗HER2的抗體上，合成了DAR值為4的ADCs。質(zhì)譜和HIC分析顯示，其中90%的偶聯(lián)物的DAR值為4，僅有3%的DAR值為3的偶聯(lián)物和7%的DAR值為5的偶聯(lián)物。這兩種ADCs對(duì)抗原陽(yáng)性細(xì)胞系都有很強(qiáng)的殺傷力，可裂解ADC的活性比不可裂解ADC強(qiáng)100倍。兩種ADCs在小鼠模型中均有效且耐受性良好。

因?yàn)镻D試劑環(huán)上的兩個(gè)氮都可作為正交反應(yīng)的支架，所以可將其用于生成雙功能偶聯(lián)物。2015年，Maruani等人[53]利用這一特性，用一個(gè)含有末端炔烴和一個(gè)張力炔烴的二溴噠嗪二酮連接子修飾曲妥珠單抗。隨后通過(guò)正交CuAAC或SPAAC反應(yīng)與阿霉素有效載荷和熒光分子進(jìn)行偶聯(lián)，產(chǎn)生了含有四個(gè)細(xì)胞毒性有效載荷和四個(gè)熒光分子的DAR值為4的ADCs（圖5）。盡管經(jīng)過(guò)雙重修飾，但ADC仍保持對(duì)靶標(biāo)抗原的高親和力，并在體外對(duì)抗原陽(yáng)性細(xì)胞株仍具有高度選擇性。使用PD試劑在抗體上添加第二個(gè)功能性部分的特性也被用來(lái)增強(qiáng)所連有效載荷的親水性[54]。通過(guò)PD試劑將DM1有效載荷和PEG6或PEG26鏈與還原的曲妥珠單抗反應(yīng)，可產(chǎn)生較為均一的DAR值為4的ADCs（圖5）。兩種ADCs在體內(nèi)均顯示出與T-DM1類似的活性，并在小鼠異種移植模型中，以10 mg/kg劑量給藥2次后，可使腫瘤完全消退。

圖5 使用噠嗪二酮類化合物重新橋連抗體的鏈間二硫鍵產(chǎn)生均一的ADCs

雖然常規(guī)的PD連接子與每個(gè)二硫鍵反應(yīng)可生成DAR值為4的ADCs，但Lee等人[55]利用PD連接子支架的第二個(gè)功能化載體連接兩個(gè)試劑，從而創(chuàng)建一個(gè)化合物可以與四個(gè)半胱氨酸殘基反應(yīng)的連接子。這種方式適用于連接一個(gè)單一的炔烴支架，合成帶有兩個(gè)有效載荷的抗體藥物偶聯(lián)物。這個(gè)概念已被成功用于合成均一的DAR值為2的阿霉素ADCs。在另一個(gè)研究中，將樹(shù)突狀結(jié)構(gòu)引入至二溴噠嗪二酮試劑中，將4個(gè)基于卟啉的光敏劑載荷附著在每個(gè)PD樹(shù)突狀分子上，可以合成DAR值為16的均一的曲妥珠單抗-ADC[56]。該ADC在抗原陽(yáng)性細(xì)胞系中，在光照下表現(xiàn)出良好的細(xì)胞活性，而在黑暗中無(wú)任何活性，從而證明了PD連接子與光敏劑載荷的相容性。PD連接劑的進(jìn)一步功能化偶聯(lián)主要通過(guò)CuAAC或SPAAC反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，但是也可以使用其他類型的點(diǎn)擊化學(xué)。例如，Marquard等人[57]最近報(bào)道合成了一種含有反式環(huán)辛烯（TCO）功能化支架的二溴噠嗪二酮試劑。這種PD-TCO試劑可成功地與三個(gè)IgG1抗體（曲妥珠單抗、西妥昔單抗和利妥昔單抗）偶聯(lián)，并進(jìn)一步與含四嗪的熒光分子反應(yīng)。所得的三個(gè)熒光偶聯(lián)物均一性好，偶聯(lián)效率高。值得注意的是，即使是利妥昔單抗，已知通過(guò)傳統(tǒng)的NHS酯化學(xué)方法修飾后蛋白大約損失90%，而經(jīng)PD-TCO修飾后有83%的偶聯(lián)產(chǎn)率。這表明，對(duì)容易聚集的抗體進(jìn)行偶聯(lián)時(shí)，二硫鍵重新橋連比隨機(jī)賴氨酸修飾具有更明顯的優(yōu)勢(shì)。

就反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和產(chǎn)物均一性而言，PDs和NGMs一樣，都是最好的二硫鍵重新橋連試劑之一。此外，PDs試劑的“plug-and-play”特性允許其通過(guò)生物正交化學(xué)實(shí)現(xiàn)多種不同載荷的靈活功能化，這對(duì)合成雙功能的ADCs來(lái)說(shuō)是很有吸引力的。

3.4 其他二硫鍵橋連試劑

基于雙砜、NGMs和PDs化合物的大量工作清楚地證明了使用二硫鍵重新橋連策略生成均一ADCs的可行性和實(shí)用性。近年來(lái)，化學(xué)家們開(kāi)發(fā)了各種各樣新的二硫鍵橋連試劑。C-Lock是由Concortis Biotherapeutics公司開(kāi)發(fā)的專利技術(shù)，使用二溴甲基雜環(huán)類化合物，如二溴甲基喹喔啉作為二硫鍵重新橋連的試劑（圖6A）。2013年，Sorrento Therapeutics公司使用C-Lock技術(shù)開(kāi)發(fā)了抗體藥物偶聯(lián)物STI-6129，由一個(gè)duostatin有效載荷和一個(gè)靶向CD38的抗體偶聯(lián)而成，用于治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤。STI-6129在臨床前研究中表現(xiàn)出良好的活性，最近已進(jìn)入I期臨床試驗(yàn)，用于治療復(fù)發(fā)或難治性系統(tǒng)性AL淀粉樣變性。Zova Biotherapeutics公司也應(yīng)用C-Lock技術(shù)開(kāi)發(fā)了一款A(yù)DC藥物ZV0508，由二溴甲基喹喔啉連接子將duostatin有效載荷與靶向5T4癌胎糖蛋白的抗體偶聯(lián)而成[58]。HIC分析顯示，在僅與5摩爾當(dāng)量的連接子孵育后，約有90%的抗體轉(zhuǎn)化為DAR值為4的ADC。但是，與用其他二硫鍵重新橋連技術(shù)開(kāi)發(fā)的ADCs一樣，經(jīng)CE-SDS分析發(fā)現(xiàn)使用C-Lock技術(shù)開(kāi)發(fā)的ADC也是全抗體和半抗體組成的混合物。然而，在臨床前的體內(nèi)研究中，與使用馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)產(chǎn)生的類似ADC相比，ZV0508表現(xiàn)出更加出色的耐受性和有效性。

同時(shí)，諾華公司報(bào)道了將1,3-二鹵代丙酮試劑如1,3-二氯丙酮或1,3-二溴丙酮用于抗體的二硫鍵重新橋連。在所得的偶聯(lián)物中，每一對(duì)半胱氨酸通過(guò)一個(gè)含有活性酮的三碳鏈連接。這種酮可以進(jìn)一步與含羥胺修飾的有效載荷反應(yīng)形成肟連接（圖6B）。在一個(gè)應(yīng)用中，這種方法被用于構(gòu)建DAR值為3.8的抗HER2的ADC。在另一個(gè)應(yīng)用中，引入的酮與含有兩個(gè)羥胺基團(tuán)的連接子-有效載荷反應(yīng)連接，從而構(gòu)建了含有MMAF的DAR值為1.8的抗HER2的ADC。質(zhì)譜和SDSPAGE分析顯示這兩種ADCs高度均一，約90%的抗體轉(zhuǎn)化為目標(biāo)偶聯(lián)物，且形成了較少的半抗體。

Invictus Oncology公司則開(kāi)發(fā)了一種鉑（II）試劑用于二硫鍵的重新橋連（圖6C）[59]。先將拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑喜樹(shù)堿連接到一種二價(jià)胺配體上，該配體隨后與氯化鉑（II）絡(luò)合，從而得到了一種基于鉑（II）的連接子-有效載荷偶聯(lián)物。該連接子-有效載荷偶聯(lián)物可與還原的曲妥珠單抗、利妥昔單抗或西妥昔單抗反應(yīng)，得到DAR值為8的ADCs。與類似的馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)物相比，這些ADCs表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性和均一性，但是也觀察到大量半抗體的生成。隨后驗(yàn)證了西妥昔單抗-ADC體內(nèi)外的生物活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADCs的活性僅略高于未修飾的西妥昔單抗，這可能是選擇了不合適的有效載荷或釋放機(jī)制導(dǎo)致的，而不是連接子的問(wèn)題。

Koniev等人[60]在2018年開(kāi)發(fā)了一種芳炔二丙腈（ADPN）試劑可用于二硫鍵的重新橋連并將其應(yīng)用于ADCs中（圖6D）。這項(xiàng)工作的靈感來(lái)自先前的研究發(fā)現(xiàn)——單芳炔丙腈鍵可與半胱氨酸殘基形成非常穩(wěn)定的鍵合[61]。為了將其轉(zhuǎn)化為一種二硫鍵重新橋連的策略，對(duì)ADPN的三種區(qū)域異構(gòu)體進(jìn)行了比較。研究發(fā)現(xiàn)，間位ADPNs比鄰位或?qū)ξ籄DPNs有更高的轉(zhuǎn)化率，但得到的偶聯(lián)物也是全抗體和半抗體的混合物。間位ADPN連接子隨后被用于構(gòu)建含有MMAE和β-半乳糖苷酶可裂解連接子的曲妥珠單抗-ADCs中。質(zhì)譜分析顯示約50%的抗體轉(zhuǎn)化為理想的DAR值為4的偶聯(lián)物，同時(shí)存在大量的DAR值為3和DAR值為5的偶聯(lián)物。在體外藥效評(píng)估中，ADC顯示出與T-DM1相當(dāng)?shù)募?xì)胞毒性。

圖6 其他用于抗體二硫鍵重新橋連的方法：（A）二溴甲基喹喔啉；（B）1,3-二氯丙酮；（C）鉑（II）試劑；（D）芳炔二丙腈；（E）二乙烯基嘧啶

2019年，Walsh等人[62]報(bào)道了將二乙烯基嘧啶（DVP）試劑作為新型二硫鍵重新橋連試劑用于構(gòu)建ADCs。與間位ADPNs類似，DVPs可以通過(guò)兩個(gè)連續(xù)的邁克爾加成反應(yīng)進(jìn)行二硫鍵的重新橋連，在兩個(gè)半胱氨酸殘基之間插入一個(gè)靈活的七碳橋（圖6E）。這種方法被用于合成了幾個(gè)DAR值為4的曲妥珠單抗靶向的ADCs，這些ADCs由組織蛋白酶可裂解連接子、硫酸酯酶可裂解連接子或不可裂解的連接子和MMAE、hemiasterlin或阿霉素等有效載荷構(gòu)成[62-64]。在這些偶聯(lián)物中，均觀察到大約90%的抗體轉(zhuǎn)化為理想的DAR值為4的偶聯(lián)物，但也都是全抗體和半抗體的混合物。這些偶聯(lián)物在人血漿中顯示出很好的穩(wěn)定性，在體外也展現(xiàn)出很強(qiáng)的細(xì)胞毒性和選擇性。最近，雙功能DVP連接子的開(kāi)發(fā)進(jìn)一步擴(kuò)大了該方法的應(yīng)用范圍[65]。該連接子可在曲妥珠單抗上同時(shí)偶聯(lián)上MMAE細(xì)胞毒性藥物和熒光分子，實(shí)現(xiàn)抗體的雙重功能化，且不對(duì)抗體或載荷的活性產(chǎn)生任何影響。二乙烯基三嗪試劑也被證明在使用接近化學(xué)計(jì)量的試劑時(shí)就可以有效地進(jìn)行二硫鍵的重新橋連，構(gòu)建負(fù)載為4的抗體偶聯(lián)物[66]。

我們實(shí)驗(yàn)室也發(fā)展了兩種試劑可用于多肽和蛋白質(zhì)的二硫鍵重新橋連并將其應(yīng)用于ADCs的制備中。一類是苯環(huán)類雙乙烯基磺酰胺連接子（圖7A）[67-68]，乙烯基磺酰胺可與半胱氨酸發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，在優(yōu)化的條件下，可實(shí)現(xiàn)多肽二硫鍵的重新橋連。隨后選用不同的連接方式在苯環(huán)上引入炔基活性支架，設(shè)計(jì)合成了三個(gè)不同的連接子（兩個(gè)通過(guò)給電子基團(tuán)引入，一個(gè)通過(guò)吸電子基團(tuán)引入）。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，苯環(huán)上包含給電子基團(tuán)的N-苯基雙乙烯基磺酰胺連接子可以重新橋連抗體的二硫鍵以構(gòu)建均一的DAR值為4的ADCs。ADCs在體外展現(xiàn)了很好的抗原選擇性細(xì)胞毒性，在體內(nèi)也顯示出顯著的抗腫瘤活性，并且具有較好的耐受性。另一類是雙（乙烯基磺?；┻哙海˙VP）連接子（圖7B）[69]，可以選擇性地重新橋連抗體Fab區(qū)域的二硫鍵，并構(gòu)建DAR值為2的ADCs且不出現(xiàn)二硫鍵的錯(cuò)配。這一試劑首次實(shí)現(xiàn)了利用橋連試劑對(duì)抗體Fab區(qū)域二硫鍵進(jìn)行選擇性的修飾，從而避免了半抗的形成。使用BVP連接子將MMAE與曲妥珠單抗偶聯(lián)可獲得有效的ADCs。偶聯(lián)物保留了與原抗一樣的受體親和力和內(nèi)在化效率。同時(shí)，研究還證明了ADCs在體外細(xì)胞毒性中的高活性和抗原選擇性，并且發(fā)現(xiàn)它們與T-DM1相比在某種程度上具有更寬的治療窗口。我們還開(kāi)發(fā)了康普瑞?。–A4）作為新型有效載荷（圖7B）[70]，基于BVP連接子的二硫鍵重新橋連，將CA4衍生的藥物-連接子偶聯(lián)物與靶向EGFR的抗體西妥昔單抗偶聯(lián)，生成較為均一的抗體藥物偶聯(lián)物。所得的抗體藥物偶聯(lián)物均保持與原抗相當(dāng)?shù)挠H和力和內(nèi)吞作用，且展現(xiàn)出很好的體外活性，在EGFR陽(yáng)性異種移植腫瘤模型中顯示出顯著的抗腫瘤活性。

圖7 苯環(huán)類雙乙烯基環(huán)酰胺化合物（A）和雙（乙烯基磺?；┻哙海˙）用于抗體二硫鍵重新橋連

4 總結(jié)和展望

抗體藥物偶聯(lián)物是近年來(lái)腫瘤靶向治療研究領(lǐng)域內(nèi)的熱門(mén)方向。它汲取了傳統(tǒng)抗癌化學(xué)小分子藥物和生物抗體藥物的優(yōu)點(diǎn)，又最大程度上減弱了這兩種單一藥物的缺點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療。影響ADCs臨床成功的因素有很多，包括抗體的選擇、異質(zhì)性和靶點(diǎn)抗原表達(dá)水平、有效載荷效力和作用機(jī)制、偶聯(lián)策略以及可裂解和不可裂解連接子的選擇等，因此開(kāi)發(fā)療效好、毒性低的ADCs仍面臨較大的挑戰(zhàn)。其中，連接子部分決定了ADCs中有效載荷的數(shù)量和位置，從而影響ADCs的藥代動(dòng)力學(xué)、藥物釋放速率、生物活性和治療窗口，在ADCs設(shè)計(jì)中起著至關(guān)重要的作用。與現(xiàn)有的需要抗體改造的方法相比，基于天然抗體的化學(xué)位點(diǎn)特異性修飾有更快的可操作性和有效性。二硫鍵的重新橋連策略已被多次證明在構(gòu)建均一性ADCs中有著顯著的優(yōu)勢(shì)。目前諸多的二硫鍵橋連新方法尚未被用于臨床研究中，所得的ADCs大多還處于臨床前的研究中，研究者們正在努力將這些方法真正應(yīng)用于臨床研究中，使ADCs藥物在腫瘤領(lǐng)域及其他領(lǐng)域進(jìn)一步大放光彩。