中介體復(fù)合物結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制

2021-10-27 08:25張賀橋聶焱

自然雜志 2021年5期

張賀橋，聶焱

上?？萍即髮W(xué) 免疫化學(xué)研究所，上海 201210

1 真核生物轉(zhuǎn)錄及中介體復(fù)合物

中心法則（central dogma）是所有原核和真核生物都遵循的生物學(xué)基本法則。中心法則主要指存儲著遺傳信息的DNA在細(xì)胞核內(nèi)經(jīng)過轉(zhuǎn)錄（transcription）生成信使RNA （messenger RNA，簡稱mRNA），然后mRNA經(jīng)核糖體翻譯（translation）產(chǎn)生蛋白質(zhì)的過程。其中，基因轉(zhuǎn)錄是最基礎(chǔ)的生命活動之一，大致可分為轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄延伸和轉(zhuǎn)錄終止。轉(zhuǎn)錄起始是其中最復(fù)雜的一步。

原核生物的RNA聚合酶只包含5個亞基，并且轉(zhuǎn)錄所需的其他關(guān)鍵組分只有σ因子。真核生物的轉(zhuǎn)錄要復(fù)雜得多，其轉(zhuǎn)錄起始過程需要RNA聚合酶II （RNA polymerase II，簡稱Pol II）、各種通用轉(zhuǎn)錄因子（general transcription factor，簡稱GTF）以及中介體復(fù)合物（Mediator complex）[1-3]。真核生物轉(zhuǎn)錄發(fā)生時，轉(zhuǎn)錄激活子（transcriptional activator，也被稱為基因特異型轉(zhuǎn)錄因子（gene-specific transcription factor））會首先結(jié)合在攜帶有轉(zhuǎn)錄激活信號的上游增強(qiáng)子（enhancer）區(qū)域（也被稱為上游激活序列，upstream activation sequence，簡稱UAS），然后在基因的啟動子（promoter）區(qū)域組裝成一個極其復(fù)雜的超級復(fù)合物——轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物（preinitiation complex，簡稱PIC）（圖1）[3]。轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物包含RNA聚合酶II、各種通用轉(zhuǎn)錄因子以及中介體復(fù)合物。酵母來源的轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物共包含約66種不同的蛋白組分：RNA聚合酶II、通用轉(zhuǎn)錄因子（TFIIA、TFIIB、TBP/TFIID、TFIIE、TFIIF、TFIIH）以及中介體復(fù)合物。這些組分各司其職、共同協(xié)作，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄起始的發(fā)生（圖1）。在轉(zhuǎn)錄起始發(fā)生時，真核生物與原核生物最大的區(qū)別在于：負(fù)責(zé)激活基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄激活子/基因特異型轉(zhuǎn)錄因子在原核生物中直接與核心轉(zhuǎn)錄機(jī)器——RNA聚合酶結(jié)合；在真核生物中，轉(zhuǎn)錄激活子/基因特異型轉(zhuǎn)錄因子不直接與RNA聚合酶II結(jié)合，而是由中介體復(fù)合物介導(dǎo)（圖1）。換句話說，對于真核生物而言，中介體復(fù)合物在轉(zhuǎn)錄激活子/基因特異型轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶II之間起到橋梁的作用。中介體復(fù)合物對真核生物所有基因的轉(zhuǎn)錄都是必需的，是通用轉(zhuǎn)錄機(jī)器必不可少的一部分[3-4]。

圖1 轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物組分示意圖（不同組分用不同顏色的形狀代表），包含RNA聚合酶II（Pol II）、通用轉(zhuǎn)錄因子（TFIIA、TFIIB、TBP、TFIIE、TFIIF、TFIIH）和中介體復(fù)合物（Mediator）。此外還展示了作為轉(zhuǎn)錄模板的DNA及其上的增強(qiáng)子（enhancer）和啟動子（promoter）區(qū)域

2 中介體復(fù)合物在轉(zhuǎn)錄之外的其他功能

近年來，越來越多的證據(jù)表明，中介體復(fù)合物不僅參與了轉(zhuǎn)錄起始，還促進(jìn)了轉(zhuǎn)錄延伸過程[5]。此外，美國麻省理工學(xué)院Richard Young研究組發(fā)現(xiàn)中介體復(fù)合物與黏連蛋白（cohesin）復(fù)合物共同介導(dǎo)了染色質(zhì)的環(huán)化。眾所周知，染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)調(diào)控對于所有基因的轉(zhuǎn)錄都是非常關(guān)鍵的。這是因?yàn)樽鳛檫z傳物質(zhì)的DNA在細(xì)胞內(nèi)并不是以線性形式存在的，而是先纏繞在組蛋白八聚體上組裝形成核小體，然后再繼續(xù)被層層壓縮形成染色質(zhì)，乃至最后的染色體。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，染色質(zhì)會發(fā)生環(huán)化，進(jìn)而導(dǎo)致基因的增強(qiáng)子和啟動子之間的距離被大大縮短。這種環(huán)化被認(rèn)為是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的重要因素，而中介體復(fù)合物與黏連蛋白復(fù)合物一起協(xié)作，直接介導(dǎo)了染色質(zhì)的環(huán)化[6]。此外，中介體復(fù)合物在與轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)的相分離過程中可能也發(fā)揮著重要作用。2018年《科學(xué)》雜志發(fā)表的一篇論文表明，中介體復(fù)合物可以通過其中部模塊中的Med1蛋白上內(nèi)在無序區(qū)域（intrinsically disordered region，簡稱IDR）與基因特異型轉(zhuǎn)錄因子的激活結(jié)構(gòu)域非特異性相互作用，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄區(qū)域相分離的發(fā)生[7]。隨著對中介體復(fù)合物研究的不斷深入，人們越來越認(rèn)識到其可能作為一個“多面手”，在轉(zhuǎn)錄外的多種重要生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。

3 中介體復(fù)合物的發(fā)現(xiàn)及組成

中介體復(fù)合物的組分高度復(fù)雜，在釀酒酵母中共包含21個亞基，在哺乳動物中則包含26個亞基，分子量超過1 MDa （表1）。中介體復(fù)合物的發(fā)現(xiàn)要追溯到20世紀(jì)90年代初，美國斯坦福大學(xué)教授Roger Kornberg （2006年諾貝爾化學(xué)獎得主）在研究釀酒酵母基因轉(zhuǎn)錄過程時發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)人工改造過的轉(zhuǎn)錄激活子VP16-GAL4可以抑制另外一種未知轉(zhuǎn)錄激活子的功能[8]。Kornberg教授根據(jù)這種現(xiàn)象推測，細(xì)胞核內(nèi)可能存在一種成分，在轉(zhuǎn)錄激活子和RNA聚合酶II之間發(fā)揮作用。Kornberg實(shí)驗(yàn)室隨后的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過不同的層析柱分離釀酒酵母的細(xì)胞上清后，有一種粗提物可以減弱這種轉(zhuǎn)錄抑制效應(yīng)。Kornberg教授把這種在轉(zhuǎn)錄激活子和RNA聚合酶II之間起到中介作用的蛋白稱為中介體[9]。1994年，Kornberg實(shí)驗(yàn)室在釀酒酵母中純化出了均一的中介體復(fù)合物，并首次發(fā)現(xiàn)中介體復(fù)合物至少包含20種不同的蛋白，且其中少數(shù)組分與之前美國麻省理工學(xué)院的Richard Young教授經(jīng)遺傳篩選發(fā)現(xiàn)的基因產(chǎn)物是重合的。Kornberg實(shí)驗(yàn)室還發(fā)現(xiàn)，中介體復(fù)合物在酵母細(xì)胞中也能以與RNA聚合酶II結(jié)合的方式存在[10]。自從Kornberg實(shí)驗(yàn)室于1994年確切地在釀酒酵母中鑒定出中介體復(fù)合物后，果蠅、線蟲、高等哺乳動物等來源的中介體復(fù)合物也相繼被報(bào)道出來[11-12]。

表1 酵母、嗜熱真菌及人源中介體復(fù)合物不同模塊亞基組成

早在1999年，Roger Kornberg實(shí)驗(yàn)室首次對從酵母以及小鼠細(xì)胞純化到的中介體復(fù)合物樣品進(jìn)行負(fù)染電鏡觀察，并挑取少量顆粒進(jìn)行了二維分類。他們發(fā)現(xiàn)酵母和小鼠的中介體復(fù)合物整體形狀非常相似，呈現(xiàn)出一種類似于光學(xué)顯微鏡的形狀[13]。Kornberg實(shí)驗(yàn)室把中介體復(fù)合物劃分為三個模塊：頭部模塊（head module）、中部模塊（middle module）以及尾部模塊（tail module）[13]。在釀酒酵母中，頭部模塊包含Med6、Med8、Med11、Med17、Med18、Med20、Med22亞基，而中部模塊包含Med1、Med4、Med7、Med9、Med10、Med19、Med21以及Med31，尾部模塊在三個模塊中分子量最大，柔性最強(qiáng)，它包含Med2、Med3、Med5、Med15、Med16亞基。而哺乳動物細(xì)胞中介體復(fù)合物包含一些哺乳動物特異的亞基，它除了包含與釀酒酵母中Med2、Med3、Med5、Med15、Med16對應(yīng)的Med29、Med27、Med24、Med15和Med16外，還另外編碼了Med23、Med25、Med26和Med30等亞基（表1）[14]。一些嗜熱真菌的尾部模塊不包含Med2和Med3，但是MED15基因編碼的蛋白大很多，整體尾部模塊分子量達(dá)到450 kDa。不管是在釀酒酵母、嗜熱真菌還是哺乳動物細(xì)胞中，Med14亞基都作為一個骨架成分，將各個模塊串聯(lián)到一起，組裝成一個完整的中介體復(fù)合物[15]。研究表明：頭部模塊和中部模塊主要負(fù)責(zé)與RNA聚合酶II結(jié)合，而尾部模塊直接結(jié)合攜帶有轉(zhuǎn)錄激活信號的轉(zhuǎn)錄激活子。后續(xù)的研究表明：中介體復(fù)合物不僅包含這三個模塊，還包含一個可解離的CDK8激酶模塊（CDK8 kinase module，簡稱CKM）。CDK8激酶模塊包括4個亞基：CDK8、CyclinC、Med12和Med13。其中Med12和Med13蛋白均超過1 500個氨基酸。整個CDK8激酶模塊的分子量達(dá)到430 kDa[16-17]。

ChIP-seq數(shù)據(jù)顯示，CDK8激酶模塊在基因組水平上與中介體復(fù)合物分布一致。也就是說，CDK8激酶模塊與中介體復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)是以更大的復(fù)合物形式出現(xiàn)的。體外的生化實(shí)驗(yàn)表明：CDK8激酶模塊（尤其是在轉(zhuǎn)錄起始階段）可以大大抑制中介體復(fù)合物的活性。而CDK8激酶活性對于抑制中介體是否必需，各個研究組報(bào)告的結(jié)果并不一致。目前普遍認(rèn)為：當(dāng)中介體復(fù)合物以單獨(dú)形式存在時，相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄會被激活；而當(dāng)中介體復(fù)合物與CDK8激酶模塊結(jié)合時，相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄活動會被抑制[17]。

4 中介體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究進(jìn)展

中介體復(fù)合物自1994年被首次鑒定后，全世界多個實(shí)驗(yàn)室持續(xù)對其開展結(jié)構(gòu)和功能研究。首個對中介體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究成果是上文中提及的，Kornberg實(shí)驗(yàn)室于1999年發(fā)表在《科學(xué)》上的低分辨率負(fù)染電鏡研究結(jié)果[13]。在冷凍電鏡革命性的時代到來之前[18]，針對中介體復(fù)合物結(jié)構(gòu)的高分辨率研究僅局限于使用X射線晶體學(xué)或者溶液核磁共振的方法解析單個亞基及其結(jié)構(gòu)域，或者含2～3個亞基的亞復(fù)合物。例如，德國馬克斯·普朗克生物物理化學(xué)研究所Patrick Cramer實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用X射線晶體學(xué)和核磁共振的方法，成功解析了Med7-Med21、Med8-Med18-Med20、Med7-Med31、Med25-VP16、Med11-Med22等一系列亞復(fù)合物的高分辨率結(jié)構(gòu)[19-27]（圖2）。

圖2 2020年以前利用X射線晶體學(xué)或核磁共振方法解析的中介體部分亞基高分辨率結(jié)構(gòu)

2011—2012年間，美國印第安納大學(xué)Yuichiro Takagi實(shí)驗(yàn)室、德國馬克斯·普朗克生物物理化學(xué)研究所Patrick Cramer實(shí)驗(yàn)室以及美國斯坦福大學(xué)Roger Kornberg實(shí)驗(yàn)室分別獨(dú)立地解析了來自釀酒酵母或裂殖酵母的中介體復(fù)合物頭部模塊的晶體結(jié)構(gòu)，分辨率分別為4.3 ?、3.4 ? （圖3a）和4.5 ?[25,28-29]。尤其值得注意的是，Roger Kornberg實(shí)驗(yàn)室解析的頭部模塊還包含RNA聚合酶II的部分CTD （C-terminal domain）肽段，首次闡明了RNA聚合酶II-CTD與中介體復(fù)合物的結(jié)合方式[29]。2014年，美國斯克里普斯研究所的Francisco Asturias研究組通過單顆粒冷凍和負(fù)染電鏡技術(shù)，結(jié)合MBP （maltose-binding protein）標(biāo)簽融合標(biāo)記、遺傳突變、化學(xué)交聯(lián)等方法，糾正了之前基于低分辨率電鏡結(jié)構(gòu)所提出的中介體復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型（發(fā)現(xiàn)頭部模塊應(yīng)位于中介體復(fù)合物的頂部，而非原先所認(rèn)為的底部），并大致確定了酵母以及人源中介體復(fù)合物各個亞基的位置[14]（圖3a）。

冷凍電鏡革命性的時代到來之后，中介體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究迎來了快速發(fā)展。首先在2017年，《自然》雜志先后發(fā)表了兩篇關(guān)于中介體復(fù)合物中頭部模塊-中部模塊亞復(fù)合物高分辨結(jié)構(gòu)的論文。第一篇論文來自美國斯克里普斯研究所Francisco Asturias研究組，他們用單顆粒冷凍電鏡技術(shù)解析了頭部模塊-中部模塊亞復(fù)合物4.4 ?的近原子分辨率結(jié)構(gòu)，大致厘清了這兩個模塊中各個亞基之間的相互作用方式[30]；第二篇論文來自德國馬克斯·普朗克生物物理化學(xué)研究所Patrick Cramer實(shí)驗(yàn)室，他們經(jīng)過上千次蛋白重組表達(dá)和結(jié)晶篩選條件的摸索，成功解析了頭部模塊-中部模塊亞復(fù)合物3.4 ?的晶體結(jié)構(gòu)，并對前一篇4.4 ?冷凍電鏡的模型進(jìn)行了糾正，使中介體復(fù)合物頭部模塊和中部模塊以及它們的相互作用方式以高分辨率形式呈現(xiàn)在我們面前[31]（圖3a）。此外，已搬遷至美國科羅拉多大學(xué)的Francisco Asturias實(shí)驗(yàn)室于2019年和2021年3月先后報(bào)道了分辨率為5.9 ?和4.0 ?的小鼠中介體復(fù)合物冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，大致確定了各個亞基的位置（圖3b）[32-33]。

圖3 （a）已解析的中介體復(fù)合物頭部模塊、中部模塊高分辨率結(jié)構(gòu)模型（冷凍電鏡、X射線晶體學(xué)）及酵母低分辨率完整中介體冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（右列頭部模塊晶體結(jié)構(gòu)模型不同亞基用不同顏色表示，左列頭部-中部模塊結(jié)構(gòu)模型不同亞基用其他不同顏色表示）；（b）4.0 ?小鼠來源完整中介體復(fù)合物冷凍電鏡結(jié)構(gòu)模型

如前所述，中介體復(fù)合物最主要的功能有兩個：一是結(jié)合上游的轉(zhuǎn)錄激活子蛋白；二是結(jié)合核心轉(zhuǎn)錄機(jī)器RNA聚合酶II。它的第二個功能主要由頭部模塊和中部模塊完成，而第一個功能則主要由分子量更大、構(gòu)象更柔性多變的尾部模塊完成。有意思的是，作為真核生物的最主要的轉(zhuǎn)錄共激活子（co-activator），中介體復(fù)合物是幾乎所有轉(zhuǎn)錄激活子共同的結(jié)合目標(biāo)。而這些結(jié)構(gòu)各異、幾乎沒有序列和結(jié)構(gòu)同源性的轉(zhuǎn)錄激活子在酵母細(xì)胞中就有幾百種，幾乎都可以直接結(jié)合中介體復(fù)合物的尾部模塊，由此可見尾部模塊的重要性，同時也能解釋它的構(gòu)象為何需要如此靈活多變。盡管中介體復(fù)合物頭部模塊-中部模塊亞復(fù)合物的高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)以及晶體結(jié)構(gòu)得到解析，但是在2020年之前，關(guān)于酵母和哺乳動物細(xì)胞中介體復(fù)合物尾部模塊高分辨率結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究一直是空白的。

我們實(shí)驗(yàn)室于2021年1月發(fā)表在《分子細(xì)胞》（Molecular Cell）的工作，集中在研究嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophilum）這一嗜熱真菌的中介體復(fù)合物上。由于傳統(tǒng)的釀酒酵母中介體復(fù)合物樣品柔性較強(qiáng)、均一性較差，國際上多個實(shí)驗(yàn)室近30年的研究表明，解析釀酒酵母完整中介體復(fù)合物高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)非常困難。因此，我們借鑒了Ada Yonath （2009年諾貝爾化學(xué)獎得主）選擇嗜熱細(xì)菌來源的核糖體進(jìn)行X射線晶體學(xué)研究，并成功解析得到高分辨率晶體結(jié)構(gòu)的研究經(jīng)驗(yàn)[34]，決定純化來源于一種嗜熱真菌——嗜熱毛殼菌的中介體復(fù)合物用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究（嗜熱毛殼菌是極少數(shù)幾種能夠在50 ℃以上環(huán)境中生存的真核生物，最高耐受溫度可達(dá)到60 ℃）。這是因?yàn)橄鄬τ趤碜葬劸平湍负土阎辰湍傅戎袦厣铮╩esophile）的蛋白質(zhì)而言，嗜熱毛殼菌來源的蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性更高，所以結(jié)構(gòu)一般更穩(wěn)定、構(gòu)象剛性更強(qiáng)，更適合用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究。

我們實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了可以純化內(nèi)源中介體復(fù)合物的嗜熱毛殼菌細(xì)胞系，利用融合在Med6亞基羧基端Protein A標(biāo)簽進(jìn)行純化。大致步驟為：首先利用穿梭質(zhì)粒對制備好的嗜熱毛殼菌原生質(zhì)體（protoplast）進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并在固體培養(yǎng)基平板中加入特比萘芬（Terbinafine，一種具有廣譜抗真菌活性的丙烯胺類藥物）來篩選陽性克隆；隨后，通過發(fā)酵罐培養(yǎng)以及IgG親和層析等純化方法成功獲得了毫克級別高純度的中介體復(fù)合物樣品，并使用單顆粒冷凍電鏡技術(shù)成功解析了首個近原子分辨率的完整中介體復(fù)合物（6.6 ?）及其與RNA聚合酶II的復(fù)合物結(jié)構(gòu)（4.3 ?）。我們據(jù)此搭建了迄今為止最完整的中介體復(fù)合物原子模型[35]。由于中介體復(fù)合物，尤其是尾部模塊相對于其他兩個模塊柔性較大，我們采用冷凍電鏡中常見的局部分類（focused classification）方法對尾部模塊進(jìn)行單獨(dú)處理，使其分辨率提高到了3.6 ?。在尾部模塊中：Med5幾乎全部由α螺旋組成，位于該模塊的最遠(yuǎn)端；Med16則由氨基端WD40結(jié)構(gòu)域以及羧基端α螺旋型結(jié)構(gòu)域組成，位于該模塊中間，連接Med5和Med15；Med5與Med16氨基端的WD40結(jié)構(gòu)域相互堆積，而Med16羧基端α螺旋型結(jié)構(gòu)域與Med15以及Med14的羧基端結(jié)構(gòu)域相互作用[35]（圖4）。需要指出的是，Med14的羧基端與Med16的α螺旋型結(jié)構(gòu)域和Med15相互堆積在一起，這種相互作用模式被發(fā)現(xiàn)在哺乳動物細(xì)胞來源的中介體復(fù)合物中也是保守的。值得一提的是，Med15是酵母中轉(zhuǎn)錄激活子的主要結(jié)合靶點(diǎn)，且已經(jīng)被證明是中介體復(fù)合物中柔性最強(qiáng)的亞基之一，核磁共振都不容易捕捉到確定的構(gòu)象。我們首次解析了Med15包含7個α螺旋的螺旋束結(jié)構(gòu)，確定了Med15在整個中介體復(fù)合物中的空間位置，并指出了轉(zhuǎn)錄激活子可能的結(jié)合位點(diǎn)（activator binding site，圖4）[35]。嗜熱毛殼菌的Med15亞基包含1 625個氨基酸，我們解析的Med15結(jié)構(gòu)中只能確切地定位不到200個氨基酸，仍有超過1 400多個氨基酸無法被確切定位，說明這些部分是非常靈活的。這些靈活性可能賦予了Med15可以結(jié)合多種轉(zhuǎn)錄激活子的能力。

另外，通過對比完整中介體復(fù)合物及其與RNA聚合酶II的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，我們發(fā)現(xiàn)中介體復(fù)合物在結(jié)合RNA聚合酶II前后有三處明顯的構(gòu)象變化：尾部模塊發(fā)生轉(zhuǎn)動；Med1蛋白發(fā)生輕微平移；RNA聚合酶II-CTD結(jié)合位點(diǎn)處的缺口發(fā)生關(guān)閉。這些構(gòu)象變化為闡明中介體復(fù)合物與轉(zhuǎn)錄激活子的結(jié)合方式，及其調(diào)控轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物轉(zhuǎn)錄活性的分子機(jī)制提供了重要啟示。有意思的是，Med14作為一個骨架成分，連接了中介體尾部模塊、中部模塊和頭部模塊，并一直延伸到了中部模塊的Hook部位（圖4）。由于尾部模塊可以直接結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活子，而Hook部位的運(yùn)動被認(rèn)為對于組裝轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物至關(guān)重要，因此，中介體復(fù)合物很可能在尾部模塊接收轉(zhuǎn)錄激活子攜帶的轉(zhuǎn)錄激活信號后，在Med14亞基的幫助下，將此信號通過整體構(gòu)象變化傳遞給核心轉(zhuǎn)錄機(jī)器——RNA聚合酶II，激活后續(xù)的轉(zhuǎn)錄步驟（圖5）。當(dāng)然，更具體的轉(zhuǎn)錄信號傳遞機(jī)制還需要進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物化學(xué)乃至細(xì)胞生物學(xué)的工作來驗(yàn)證。

圖4 嗜熱毛殼菌來源完整中介體復(fù)合物近原子分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)模型

圖5 中介體復(fù)合物促進(jìn)轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物組裝以及激活轉(zhuǎn)錄起始過程的可能機(jī)制。左圖展示了中介體復(fù)合物在結(jié)合RNA聚合酶II之前的構(gòu)象（pre-conformation），Med14亞基的位置由圖中白色數(shù)字“14”標(biāo)示；中間圖顯示中介體復(fù)合物結(jié)合RNA聚合酶II后的過渡構(gòu)象（intermediate conformation），位于頭部模塊和中部模塊之間的RNA聚合酶II-CTD結(jié)合位點(diǎn)處的缺口開始關(guān)閉；右圖顯示最終正確的構(gòu)象（correct conformation）：尾部模塊發(fā)生轉(zhuǎn)動，Med1蛋白發(fā)生輕微平移，RNA聚合酶II-CTD結(jié)合位點(diǎn)處的缺口關(guān)閉。這些構(gòu)象變化為解釋中介體復(fù)合物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的分子機(jī)制提供了重要線索和啟示

5 總結(jié)和展望

近年來，由于冷凍電鏡技術(shù)的革命性突破，中介體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物學(xué)取得了極大進(jìn)展。尤其在2021年上半年，來源于嗜熱真菌、小鼠和人的單獨(dú)完整中介體復(fù)合物，以及含有中介體復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物的多個高分辨率結(jié)構(gòu)不斷被發(fā)表出來。包括我們實(shí)驗(yàn)室在內(nèi)的多個實(shí)驗(yàn)室，如上文中提到的Francisco Asturias實(shí)驗(yàn)室和Patrick Cramer實(shí)驗(yàn)室，以及美國西北大學(xué)何源實(shí)驗(yàn)室和復(fù)旦大學(xué)徐彥輝實(shí)驗(yàn)室，都在該領(lǐng)域取得了重要進(jìn)展，將我們對于中介體復(fù)合物調(diào)控真核轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識推到了一個新的高度[36-38]。然而，中介體復(fù)合物在轉(zhuǎn)錄起始中發(fā)揮功能的許多細(xì)節(jié)仍有待于通過進(jìn)一步研究來闡明。例如：

（1）目前的模型認(rèn)為，中介體復(fù)合物頭部模塊Med6和中部模塊Med7-Med31之間的距離很關(guān)鍵。距離大，也就是該區(qū)域處于開放構(gòu)象時，是一種有利于結(jié)合RNA聚合酶II CTD的狀態(tài)；而結(jié)合了RNA聚合酶II CTD之后，頭部模塊和中部模塊相對距離縮短，隨后通用轉(zhuǎn)錄因子TFIIH的激酶模塊TFIIK對CTD進(jìn)行磷酸化，促使RNA聚合酶II與中介體復(fù)合物解離，發(fā)生由轉(zhuǎn)錄起始向轉(zhuǎn)錄延伸過程的轉(zhuǎn)變。然而，RNA聚合酶II的CTD被磷酸化后如何與中介體復(fù)合物發(fā)生解離，這一過程的細(xì)節(jié)尚不清楚。

（2）轉(zhuǎn)錄激活子/基因特異型轉(zhuǎn)錄因子如何與中介體復(fù)合物結(jié)合這一更關(guān)鍵的問題還沒有明確答案。如前所述，中介體復(fù)合物的兩個主要功能之一就是結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活子/基因特異型轉(zhuǎn)錄因子。然而，直到目前，中介體復(fù)合物如何結(jié)合這些因子，以及結(jié)合之后是否以及如何發(fā)生構(gòu)象變化來傳遞調(diào)控信號給核心轉(zhuǎn)錄機(jī)器——RNA聚合酶II尚不完全明確。這一過程的詳細(xì)分子機(jī)制還需要更多的結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物化學(xué)的研究來揭示。