劉元豪，鄭一鳴，王 斌，韋 敏

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，主要發(fā)生在兒童和青少年中，并顯示出向肺轉(zhuǎn)移的趨勢[1]。外科腫瘤切除、全身化療和靶向放療是目前用于治療骨肉瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療策略，但患者5年生存率仍然很低[2]。因此，需要開發(fā)治療骨肉瘤更高效率的新型藥物。異丙酚（2,6-二異丙基苯酚）目前是臨床上最常用的麻醉劑之一[3]。但最近研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚不僅在手術(shù)中用作鎮(zhèn)靜藥或催眠藥，而且還顯示出許多非麻醉作用，例如抗腫瘤活性[4]。異丙酚可以通過上調(diào)胃癌的SGC-7901和MKN45細(xì)胞中的miR-140-5p來顯著抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5]。異丙酚通過下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)的表達(dá)，抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。微小RNA（MicroRNA，miRNA/miR）是一類小的非編碼RNA（19～24個(gè)核苷酸），通過抑制翻譯或促進(jìn)mRNA降解來介導(dǎo)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[7]。資料顯示，miR-506在骨肉瘤中的水平降低，miR-506過表達(dá)減少骨肉瘤細(xì)胞的侵襲，miR-506的抑制導(dǎo)致細(xì)胞侵襲增加[8]。長鏈非編碼RNA RHPN1-AS1充當(dāng)miR-506的競爭性內(nèi)源RNA，在骨肉瘤中發(fā)揮促癌作用[9]。近年來，已經(jīng)證明一些麻醉劑能夠控制腫瘤生長的miRNA，包括異丙酚，其通過調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)來調(diào)節(jié)癌癥的發(fā)展[10]。例如異丙酚通過上調(diào)骨肉瘤中的miR-143表達(dá)產(chǎn)生抗腫瘤潛力[11]。因此，本研究旨在驗(yàn)證異丙酚通過調(diào)節(jié)人骨肉瘤細(xì)胞中的miR-506表達(dá)來抑制增殖、遷移侵襲并誘導(dǎo)凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料 骨肉瘤細(xì)胞株HOS（美國典藏培養(yǎng)物保存中心），RPMI 1640培養(yǎng)基、Opti-MEM（美國Gibco公司），異丙酚（美國Sigma-Aldrich公司 ），miR-506 mimic、miR-506 inhibitor、 對(duì) 照miR-NC、anti-miR-NC（上海GenePharma公司），放射免疫沉淀分析（Radio Immunoprecipitation Assay，RIPA）裂解緩沖液（上海申能博彩生物公司），細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）D1、p21、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、B細(xì)胞淋巴瘤/白 血 病 -2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）、Bcl-2相 關(guān) X蛋 白（Bcl-2 Associated X protein，Bax）抗體（美國Abcam公司），增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL） 試 劑盒（英國Ameshame公司），Trizol試劑（美國Thermo Fisher Scientific公 司 ），miRNeasy Mini Kits、miScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國Qiagen公司），Prime ScriptTMRT reagent kit（日本Takara公司），TaqMan?Universal PCR Master Mix II（美國Biosystems公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與給藥處理 HOS細(xì)胞于含有5% CO2、飽和濕度、37 ℃的培養(yǎng)箱中，在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。HOS細(xì)胞分為NC組（未處理）、Pro-L組（1 μg/mL異丙酚）、Pro-M組（5 μg/mL異丙酚）和Pro-H組（10 μg/mL異丙酚）。其中異丙酚以少量二甲基亞砜助溶，并用培養(yǎng)基進(jìn)一步稀釋，作用時(shí)間為48 h。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 將HOS細(xì)胞接種在6孔板中，細(xì)胞密度達(dá)到30%～50%時(shí)，按照Lipofectamine 2000的說明轉(zhuǎn)染細(xì)胞。使用無血清的 Opti-MEM（250 μL）稀釋miR-506 mimic、miR-506 inhibitor抑制劑和miR-NC，最終濃度為50 nmol/L，然后混合并在室溫下孵育5 min。另 用250 μL無 血 清Opti-MEM稀 釋5 μL Lipofectamine 2000，混合并在室溫下孵育5 min。將上述兩種溶液混合并在室溫下孵育20 min，然后加入HOS細(xì)胞培養(yǎng)孔中。在37℃和5% CO2中孵育6～8 h之后，將HOS細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染miR-506 inhibitor和anti-miR-NC的細(xì)胞另加入10 μg/mL異丙酚作用48 h。將HOS細(xì)胞分為miR-NC組（轉(zhuǎn)染miR-NC）、miR-506組（轉(zhuǎn)染miR-506 mimic）、Pro+anti-miRNC組（轉(zhuǎn)染anti-miR-NC+10 μg/mL異丙酚）和Pro+anti-miR-506組（轉(zhuǎn)染miR-506 inhibitor+10 μg/mL 異丙酚）。

1.4 細(xì)胞增殖測定 收集1.2和1.3處理的HOS細(xì)胞，并根據(jù)制造商的方案使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（Cell Counting Kit-8，CCK-8）進(jìn)行分析。將HOS細(xì)胞以3×103個(gè)/孔的密度接種到96孔板中，并將CCK-8試劑（10 μL/孔）添加到無血清的培養(yǎng)基中（90 μL/孔），并在37 ℃下與HOS細(xì)胞孵育3 h。使用酶標(biāo)儀測量450 nm處的光密度值，以此反映HOS細(xì)胞增殖情況。

1.5 免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western blotting） 使用RIPA裂解液從HOS細(xì)胞中提取總蛋白。將經(jīng)過上樣處理的蛋白添加到采樣孔（每孔約20 μg），在10%分離膠（120 V）上分離蛋白約2 h，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（30 V電轉(zhuǎn)12 h）上。封閉后，將膜洗滌并與抗Cyclin D1（稀釋比為1∶1 000）、抗p21（稀釋比為 1∶1 000）、抗 MMP-2（稀釋比為 1∶1 000）、抗 MMP-9（稀釋比為 1∶1 000）、抗 Bcl-2（稀釋比為1∶1 000）、抗Bax（稀釋比為1∶1 000）和抗GAPDH（1∶2 500）抗體一起孵育于4 ℃過夜。將膜洗滌并與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的免疫球蛋白G（IgG）二抗（稀釋比為1∶2 000）在37 ℃下孵育4 h?；旌系攘縀CL試劑盒溶液，避光條件下添加到膜中進(jìn)行著色。使用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行條帶的光密度分析，Gel Doc XR成像儀系統(tǒng)和Quantity One軟件分析目標(biāo)蛋白與內(nèi)部參照GAPDH的灰度值比，將其視為目標(biāo)蛋白的表達(dá)。

1.6 遷移侵襲測定 將制備的Matrigel基質(zhì)膠鋪（侵襲測定）/不鋪（遷移測定）在Transwell頂部室中。HOS細(xì)胞處理結(jié)束后，重懸于無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，并在頂部室中添加200 μL細(xì)胞懸浮液（5×104個(gè)細(xì)胞）。在底部室中添加500 μL含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，用70%乙醇將Transwell室固定15 min，結(jié)晶紫染色15 min，室溫下干燥，顯微鏡下隨機(jī)選擇至少3個(gè)視野計(jì)數(shù)，以其平均值作為細(xì)胞侵襲/遷移能力的指標(biāo)。

1.7 細(xì)胞凋亡分析 Annexin V-異硫氰酸熒光素（FITC）/PI雙重染色用于檢測HOS細(xì)胞凋亡。HOS細(xì)胞處理結(jié)束后，根據(jù)美國BioVision的Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的說明，使用Annexin-V-FITC和PI染色。通過流式細(xì)胞儀檢測FITC和PI熒光來分析細(xì)胞凋亡情況。

1.8 熒光定量PCR測定 使用Trizol試劑分別從HOS細(xì)胞中提取總RNA。miRNeasy Mini Kits分離miRNA。隨后，使用miScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。使用TaqMan?Universal PCR Master Mix II進(jìn)行PCR。所用引物如下：miR-506，正向 5’-TAAGGCACCCTTCTGAGTAGA-3’，反向 miR-506 5’-GCGAGCACAG AATTAATACGAC-3’；U6，正向 5’-CTCGCTTCGF GCAGCACA-3’，反向 5’-AACGCTTCACGAATTT GCGT-3’。miR-506 表達(dá)根據(jù) 2-ΔΔCt法通過 U6 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度異丙酚對(duì)骨肉瘤HOS細(xì)胞增殖的影響 與NC組比較，Pro-L、Pro-M、Pro-H組HOS細(xì)胞抑制率逐漸增加，Cyclin D1蛋白水平逐漸降低，而p21蛋白水平逐漸升高，呈一定的濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1、表1。

圖1 增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

表1 異丙酚對(duì)骨肉瘤HOS細(xì)胞增殖的影響

2.2 異丙酚對(duì)骨肉瘤HOS細(xì)胞遷移侵襲和凋亡的影響 相比于NC組，Pro-L、Pro-M、Pro-H組HOS細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、MMP-2、MMP-9和Bcl-2蛋白水平均逐漸降低，Bax蛋白水平和凋亡率逐漸升高，呈一定的濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖2、表2。

圖2 異丙酚對(duì)骨肉瘤HOS細(xì)胞遷移侵襲和凋亡的影響

表2 異丙酚對(duì)骨肉瘤HOS細(xì)胞遷移侵襲和凋亡的影響

2.3 異丙酚對(duì)骨肉瘤HOS細(xì)胞中miR-506表達(dá)的影響 Pro-L、Pro-M、Pro-H組HOS細(xì)胞中miR-506的表達(dá)水平均高于NC組，且呈一定的濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

表3 異丙酚對(duì)骨肉瘤HOS細(xì)胞中miR-506表達(dá)的影響

2.4 miR-506過表達(dá)對(duì)骨肉瘤HOS細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響 同miR-NC組比較，miR-506組HOS細(xì)胞中miR-506表達(dá)水平、抑制率增加，遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)減少，凋亡率增加，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白水平降低，p21、Bax蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖3、表4。

圖3 miR-NC與miR-506組增殖、遷移侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

表4 miR-506過表達(dá)對(duì)骨肉瘤HOS細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響

2.5 抑制miR-506表達(dá)逆轉(zhuǎn)了異丙酚對(duì)骨肉瘤HOS細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的作用 與Pro+anti-miR-NC組 比 較，Pro+anti-miR-506組HOS細(xì)胞中miR-506表達(dá)水平、抑制率減少，遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)增加，凋亡率減少，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白水平升高，p21、Bax蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖4、表5。

圖4 Pro+anti-miR-NC與Pro+anti-miR-506組增殖、遷移侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

表5 抑制miR-506表達(dá)逆轉(zhuǎn)了異丙酚（10 μg/mL）對(duì)骨肉瘤HOS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用

3 討論

異丙酚已被廣泛用于治療各種疾病，多項(xiàng)研究報(bào)道它具有抗癌作用[12-13]。Zhang等[11]揭示，異丙酚在骨肉瘤中表現(xiàn)出突出的抗增殖和抗轉(zhuǎn)移活性，并能夠在體外加速細(xì)胞凋亡。異丙酚通過調(diào)節(jié)miR-137和成纖維細(xì)胞生長因子9抑制人黑素瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[14]。異丙酚通過下調(diào)miR-374a抑制肝癌細(xì)胞系的增殖、遷移、侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。本研究結(jié)果表明，1、5、10 μg/mL異丙酚在HOS細(xì)胞中以濃度依賴方式降低了細(xì)胞增殖及遷移侵襲，并誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。此外，異丙酚顯著上調(diào)了p21、促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平，并下調(diào)了CyclinD1、MMP-2、MMP-9、抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明，異丙酚可能在骨肉瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，具有一定的抗骨肉瘤活性。然而，異丙酚發(fā)揮抗骨肉瘤的潛在分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

許多不同的癌癥顯示出miR-506的失調(diào)[16-17]。通過調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的生長，miR-506被認(rèn)為是多種細(xì)胞功能的重要調(diào)節(jié)劑。miR-506充當(dāng)抑癌因子還是致癌因子取決于不同的腫瘤類型[18]。一方面，結(jié)腸癌組織中觀察到miR-506的表達(dá)水平高于癌旁正常結(jié)腸黏膜組織[19]，miR-506在皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中均上調(diào)，能夠促進(jìn)皮膚鱗狀細(xì)胞癌的惡性增殖和轉(zhuǎn)移[20]。另一方面，miR-506的表達(dá)水平在骨肉瘤中均低于正常對(duì)照，具有抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖的作用[21]。miR-506表達(dá)在膀胱癌、甲狀腺乳頭狀癌組織和細(xì)胞系中下調(diào)，miR-506過表達(dá)導(dǎo)致膀胱癌、甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖、侵襲或遷移減弱[22-23]。肝癌組織和細(xì)胞中miR-506水平顯著下調(diào)，miR-506下調(diào)促進(jìn)了肝癌HepG2和Hep3B細(xì)胞的增殖并阻止了凋亡[24]。可見miR-506是骨肉瘤、膀胱癌、肝癌、甲狀腺乳頭狀癌等腫瘤的抑制劑。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-506過表達(dá)后，HOS細(xì)胞的增殖、遷移侵襲、CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2 蛋白水平被降低，凋亡、p21、Bax蛋白水平則被提高，提示與前述報(bào)道[17-20]相符，miR-506是骨肉瘤中的抗癌因子，參與骨肉瘤細(xì)胞生長與轉(zhuǎn)移進(jìn)程。

某些麻醉劑已被證明在通過miRNA發(fā)揮對(duì)人類癌癥的調(diào)節(jié)作用，包括骨肉瘤[25]。Yu等[26]證明，異丙酚通過下調(diào)miR-24誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。異丙酚通過抑制miR-21表達(dá)來抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[27]。本研究表明，1、5、10 μg/mL異丙酚誘導(dǎo)了骨肉瘤細(xì)胞HOS中miRNA異常表達(dá)，即異丙酚處理在HOS細(xì)胞中以濃度依賴的方式上調(diào)miR-506的表達(dá)。相反，抑制miR-506表達(dá)消除了異丙酚對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)染的抑制作用，表現(xiàn)為抑制miR-506表達(dá)后，異丙酚減弱HOS細(xì)胞增殖、遷移侵襲和增強(qiáng)其凋亡的功能被逆轉(zhuǎn)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，異丙酚可能通過上調(diào)人骨肉瘤細(xì)胞中的miR-506表達(dá)而降低細(xì)胞增殖、遷移侵襲并誘導(dǎo)凋亡。

綜上，本研究結(jié)果表明，1、5、10 μg/mL異丙酚發(fā)揮抗癌作用，以防止骨肉瘤發(fā)生發(fā)展。在人骨肉瘤細(xì)胞中，異丙酚以濃度依賴的方式減輕細(xì)胞增殖、遷移侵襲，并誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡和異常的miRNA表達(dá)，且miR-506參與了異丙酚誘導(dǎo)的抗癌機(jī)制。這些為異丙酚誘導(dǎo)人骨肉瘤惡性細(xì)胞過程的分子機(jī)制提供了新穎的見解。