饒家瑞， 張 欣， 余用秀

(1.貴州省茶葉研究所， 貴州 貴陽(yáng) 550006； 2.貴州省生物技術(shù)研究所， 貴州 貴陽(yáng) 550006)

瑞士科學(xué)家PAUL于1938年發(fā)現(xiàn)合成化合物雙對(duì)氯苯基三氯乙烷(DDT)具有殺蟲活性后，使得農(nóng)藥進(jìn)入了有機(jī)合成時(shí)代[1]。有機(jī)農(nóng)藥具有活性高、見效快等特點(diǎn)，但自然降解慢、毒副作用較大和生態(tài)破壞力較強(qiáng)[2]。隨著人們對(duì)糧食安全生產(chǎn)問題的日益重視，研究對(duì)動(dòng)植物及環(huán)境友好、安全的生物農(nóng)藥成為解決上述問題的重要途徑之一[3]。植物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物超過(guò)40萬(wàn)種[4]，是篩選抗菌活性化合物的天然寶庫(kù)。植物源農(nóng)藥作為生物農(nóng)藥的重要組成部分，因其可降解、無(wú)殘留和綠色安全的特點(diǎn)而受到重視。植物源農(nóng)藥可通過(guò)微波法[5]、牛津杯法[6]、超聲波提取法[7]等提取植物有效成分，用于田間有關(guān)病害的綠色防治。研究表明，大蒜提取物對(duì)病原菌有一定的抑制作用，如大蒜素對(duì)伽師瓜貯藏過(guò)程中常致腐爛的毛霉菌、鐮飽菌、鏈格孢菌和青霉菌4種病原菌的最小抑菌濃度分別為2.3 g/L、1.7 g/L、2.2 g/L和2.6 g/L[8]；大蒜素對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的平均半抑制濃度為(0.30±0.09)mg/mL[9]；大蒜素對(duì)真菌黑曲霉和繩狀青霉的最低抑制生長(zhǎng)濃度均為0.063%，對(duì)細(xì)菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌最低抑制生長(zhǎng)濃度均為0.125%[10]。

茶輪斑病(Pestalotiopsistrachicarpicola)是一種廣泛分布于世界各地茶園的茶樹茶葉病害，為茶輪斑病的綠色高效防控提供參考，以威寧紫皮大蒜為材料，二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇為溶劑，利用浸提法[11]提取威寧紫皮大蒜的天然產(chǎn)物，研究不同溶劑提取物對(duì)茶輪斑病病原菌的抑菌活性，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 茶輪斑病病原菌 該病菌由張欣等[12]2020年7月采集于銅仁市石阡縣茶園，經(jīng)單孢分離、形態(tài)學(xué)鑒定和DNA測(cè)序等手段鑒定，病原菌為茶輪斑病(Pestalotiopsistrachicarpicola)，由貴州省生物技術(shù)研究所提供。

1.1.2 藥劑 二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇，購(gòu)于天津市富宇精細(xì)化工有限公司；吐溫80，購(gòu)于天津市大茂化學(xué)試劑廠；土豆培養(yǎng)基(PDA)，購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其他試劑，購(gòu)于上海安耐吉化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器 超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)，電子天平(型號(hào)：BSA224S-CW)，恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，高溫蒸汽滅菌鍋(上海沉匯儀器有限公司)，BHC-1300II A/B3生物潔凈安全柜，研缽80 mm(河北鼎盛隆華實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)IKA)，Mill-Q型超純水制備儀，20～200 μL、100～1 000 μL和1～5 mL移液槍等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大蒜天然產(chǎn)物的提取 將威寧紫皮大蒜(購(gòu)買于市場(chǎng))去皮，在電子天平上分別稱量4組，每組30 g。將稱量好的大蒜切碎后分別放入4個(gè)研缽中反復(fù)研磨，參照浸提法[11]，遵循溶劑與天然產(chǎn)物的相似相容性，將溶劑二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇各30 mL分別加入4個(gè)研磨大蒜的研缽中，攪拌3 min后靜置10 min。用濾紙過(guò)濾提取液，將過(guò)濾液分別裝入100 mL圓底燒瓶中旋轉(zhuǎn)蒸餾去掉溶劑，得到提取天然產(chǎn)物。

1.2.2 提取天然產(chǎn)物的抑菌活性試驗(yàn)

1) 培養(yǎng)基配制。按照購(gòu)買的土豆培養(yǎng)基(PDA)配方，在2.5 L超純水中加入PDA 100 g和瓊脂32 g，攪拌均勻，然后在攪拌狀態(tài)下以每瓶45 mL倒入100 mL錐形瓶中并封口，121℃高壓滅菌 20 min，冷卻后備用。

2) 藥液配制。按1 mg天然產(chǎn)物加入20 μL二甲基亞砜的比例溶解后備用。稱量提取天然產(chǎn)物配置成溶液，即處理1(二氯甲烷提取大蒜天然產(chǎn)物)、處理2(乙酸乙酯提取大蒜天然產(chǎn)物)、處理3(甲醇提取天大蒜然產(chǎn)物)、處理4(乙醇提取大蒜天然產(chǎn)物)，另設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組處理5(CK1，藥物為春雷霉素)、空白對(duì)照組處理6(CK2，等量滅菌吐溫水)。在200 mL滅菌水中加入200 μL吐溫80，攪拌均勻，然后依次在10 mL離心管中加入0.8 mL吐溫水、200 μL對(duì)應(yīng)天然產(chǎn)物配置液和4 mL吐溫水。將配置好的5 mL藥液倒入PDA培養(yǎng)基中混勻(使50 mL含藥液的培養(yǎng)基終濃度為200 μg/mL)，再平均倒入3個(gè)培養(yǎng)皿中冷卻備用。

3) 接種真菌。提前打開超凈工作臺(tái)紫外燈殺菌30 min以上，將提前活化好的茶輪斑病病原菌餅置于工作臺(tái)，用打孔器在其邊緣打孔，制成直徑為 4.0 mm的菌餅，再用無(wú)菌接種針將菌餅分別移動(dòng)到含有藥液的培養(yǎng)基中央，每組重復(fù)3次。最后將接種的培養(yǎng)皿置于25℃、80%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。待空白對(duì)照組菌絲長(zhǎng)至6.0 cm左右時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量生長(zhǎng)菌絲的菌餅直徑，并計(jì)算抑制率(I)。

I= [(C-T)/(C-0.4)]×100%

式中，C為空白對(duì)照菌餅直徑，T為藥物處理菌餅直徑。

1.2.3 提取天然產(chǎn)物抗茶輪斑病的毒力測(cè)定 根據(jù)提取天然產(chǎn)物在200 μg/mL濃度下的初篩抑制率，選擇處理1和處理2的濃度梯度為200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL和12.5 μg/mL，處理3和處理4的濃度梯度為1 600 μg/mL、800 μg/mL、400 μg/mL、200 μg/mL和100 μg/mL進(jìn)行4組天然產(chǎn)物的EC50測(cè)定。另設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組處理5(CK1，藥物為春雷霉素)、空白對(duì)照組處理6(CK2，等量滅菌吐溫水)。利用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定抑菌活性，采用十字交叉法測(cè)量生長(zhǎng)菌絲的菌餅直徑，抑制率計(jì)算方法同上，濃度取對(duì)數(shù)與抑制率做線性回歸方程，從而計(jì)算得出EC50。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010和DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜提取天然產(chǎn)物的產(chǎn)率

從表1看出，不同溶劑提取大蒜天然產(chǎn)物的產(chǎn)率為甲醇>乙醇>乙酸乙酯>二氯甲烷，其產(chǎn)率分別為3.19%、1.61%、0.15%和0.22%。說(shuō)明，甲醇、乙醇提取到的大蒜天然產(chǎn)物比乙酸乙酯和二氯甲烷提取的高且天然產(chǎn)物以親水性為主。

表1 4種溶劑提取大蒜天然產(chǎn)物的產(chǎn)率

2.2 不同處理茶輪斑病病原菌的抑制率

從表2看出，4種溶劑提取大蒜天然產(chǎn)物200 μg/mL對(duì)茶輪斑病病原菌的抑制率以處理1最高，為95.10%，較CK1高64.55百分點(diǎn)；處理2其次，為91.64%，較CK1高61.09百分點(diǎn)；且處理1和處理2均極顯著高于CK1。處理3、處理4的抑制率分別為8.36%和15.27%，比CK1低22.19百分點(diǎn)和15.28百分點(diǎn)，且均極顯著低于CK1。說(shuō)明，大蒜中以脂溶性為主的天然產(chǎn)物對(duì)茶輪斑病病原菌的抑菌活性優(yōu)于水溶性為主的天然產(chǎn)物。

表2 不同處理茶輪斑病病原菌的抑制率

2.3 不同處理濃度對(duì)茶輪斑病的毒力強(qiáng)度與EC50

從表3可知，對(duì)應(yīng)菌落的生長(zhǎng)直徑隨提取大蒜天然產(chǎn)物濃度下降而增大，抑制率均隨提取大蒜天然產(chǎn)物濃度的下降而降低，各濃度間差異均達(dá)極顯著。說(shuō)明，抑制率與其對(duì)應(yīng)提取大蒜天然產(chǎn)物的濃度均呈較好的線性關(guān)系，測(cè)定EC50的可信度高。二氯甲烷提取大蒜天然產(chǎn)物(處理1)12.5～200 μg/mL對(duì)茶輪班病的抑制率為24.78%～93.95%，比對(duì)照藥劑春雷霉素(CK1)800～50 μg/mL濃度的高27.67～11.24百分點(diǎn)；乙酸乙酯提取大蒜天然產(chǎn)物(處理2)的抑制率略低于處理1。乙醇提取大蒜天然產(chǎn)物(處理4)100～1 600 μg/mL對(duì)茶輪斑病病原菌的抑制率優(yōu)于甲醇提取大蒜天然產(chǎn)物(處理3)，處理3的抑制率低于CK1，處理4的抑制率略高于CK1。

2.4 不同處理對(duì)茶輪斑病的毒力強(qiáng)度

從表4可知，4種溶劑提取大蒜天然產(chǎn)物對(duì)茶輪斑病病原菌的毒力方程的相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.95，表明4種溶劑提取大蒜天然產(chǎn)物、對(duì)照藥劑春雷霉素的濃度與抑制率間均存在良好的線性關(guān)系。處理1和處理2的EC50分別為31.58 μg/mL和47.59 μg/mL，分別比春雷霉素(382.08 μg/mL)減少用藥量350.50 μg/mL和334.49 μg/mL；處理3和處理4的EC50分別為919.33 μg/mL和658.50 μg/mL，分別比春雷霉素增加用藥量537.25 μg/mL和276.42 μg/mL。說(shuō)明，二氯甲烷和乙酸乙酯溶劑提取大蒜天然產(chǎn)物抗茶輪斑病的效果均優(yōu)于對(duì)照藥劑春雷霉素，并以二氯甲烷提取的毒力強(qiáng)度最大。

3 結(jié)論

1) 用二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇溶劑浸提威寧紫皮大蒜天然產(chǎn)物的產(chǎn)率分別為0.15%、0.22%、3.19%和1.61%，即不同溶劑提取的大蒜天然產(chǎn)物產(chǎn)率為甲醇>乙醇>乙酸乙酯>二氯甲烷。

2) 抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果表明，4種溶劑提取大蒜天然產(chǎn)物200 μg/mL對(duì)茶輪斑病病原菌的抑制率為二氯甲烷>乙酸乙酯>乙醇>甲醇，并以二氯甲烷和乙酸乙酯溶劑提取大蒜天然產(chǎn)物的抑制率較高，分別為95.10%和91.64%，比對(duì)照藥劑春雷霉素(30.55%)分別高64.55百分點(diǎn)和61.09百分點(diǎn)。在試驗(yàn)濃度下4種溶劑提取大蒜天然產(chǎn)物對(duì)茶輪斑病病原菌的抑制率均隨濃度下降而降低，且各濃度間差異均達(dá)極顯著。

3) 毒力強(qiáng)度試驗(yàn)結(jié)果表明，二氯甲烷和乙酸乙酯溶劑提取大蒜天然產(chǎn)物的EC50分別為31.58 μg/mL和47.59 μg/mL，分別比春雷霉素(382.08 μg/mL)減少用藥量350.50 μg/mL和334.49 μg/mL，即2種溶劑提取大蒜天然產(chǎn)物抗茶輪斑病效果均優(yōu)于對(duì)照藥劑春雷霉素，并以二氯甲烷溶劑提取大蒜天然產(chǎn)物的毒力強(qiáng)度最大。