趙 敏

(徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 江蘇 徐州 221006)

芍藥(PaeonialactifloraPall.)是芍藥亞科(Subfam. Paeonioideae)芍藥屬(Paeonia)落葉亞灌木，不僅是供觀賞的經(jīng)濟(jì)植物，還有很高的藥用價值。近年來，因?yàn)檫B續(xù)栽種芍藥導(dǎo)致土壤中積累很多有致病威脅的病菌，對芍藥的產(chǎn)量構(gòu)成極大威脅。目前芍藥的繁殖方法有播種、嫁接、分株、扦插、壓條等方式，分株和播種是常使用的繁殖方法，采用分株繁殖的方法操作簡便，可行性高，但是成活率低；播種方法培育的后代容易發(fā)生變異，不能將親本的優(yōu)良性狀進(jìn)行有效保留[1]。植物組織培養(yǎng)技術(shù)是植物培育研究中的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)和研究手段，具有繁殖系數(shù)較高、周期短，可很好保留母株的優(yōu)良性狀等有諸多優(yōu)勢，在對植株脫毒、選育新品種、快速繁殖、人工培育種子和植物藥用成分生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用，為植物基因工程創(chuàng)造了前提條件[2]。在組織培養(yǎng)條件中，最重要的是植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度，目前使用最多的生長素有 2，4-D、NAA、IAA、IBA等，而6-BA、TDZ、KT、ZT 這些植物激素是最常用的細(xì)胞分裂素，采用2種及以上生長素與分裂素互相搭配使用，對促進(jìn)愈傷組織誘導(dǎo)、增殖及不定芽的分化有更好的效果。但芍藥的組織培養(yǎng)技術(shù)研究還處于基礎(chǔ)研究階段，研究內(nèi)容主要在選擇外植體和培養(yǎng)基配方方面，少部分研究培育出了生長出根的植株，需要對芍藥的擴(kuò)繁育苗體系進(jìn)行更深入的研究。為此，筆者于2021年4月22日對芍藥外植體選擇與處理、愈傷培養(yǎng)基選擇、組培中存在的褐化問題進(jìn)行研究，以期對利用組培技術(shù)進(jìn)行芍藥離體繁殖提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

芍藥的植物組織采自徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)林系的芍藥試驗(yàn)花田。選擇生長旺盛、枝繁葉茂、枝干粗壯的健康芍藥，采取生長旺盛、無病蟲害的植株葉片作為供試材料。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取在芍藥、牡丹器官培養(yǎng)運(yùn)用較最為廣泛的MS培養(yǎng)基，以 1/2 MS +2，4-D 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+LH 0.5 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L為基本培養(yǎng)基，pH 5.8。在基本培養(yǎng)基中添加不同濃度的 6-BA(0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L)或ZT(0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L)，共設(shè)置7個不同配比處理(表1)，每個配比重復(fù)3瓶，每個瓶內(nèi)接種4個處理好的無菌外植體。培養(yǎng)條件：溫度25℃、濕度60%、光周期12 h/d。

表1 芍藥離體葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的激素組合

將芍藥離體葉片的愈傷組織轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基中，定期觀察愈傷組織是否出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。繼代培養(yǎng)基以 1/2MS 作為基本培養(yǎng)基，加入不同濃度的2，4-D、NAA、6-BA、ZT，組合成7個不同濃度配比(表2)。

表2 芍藥離體葉片愈傷組織繼代培養(yǎng)基的激素組合

1.3 試驗(yàn)方法

于9月選取長勢良好的芍藥植株摘取頂部新生嫩葉，將芍藥葉片放入培養(yǎng)皿中，覆蓋細(xì)密紗布，用自來水沖洗1.5 h，擦干水分后將葉片放入超凈工作臺，徹底消毒滅菌，將外植體表面存在的微生物徹底滅活以避免產(chǎn)生菌斑影響試驗(yàn)結(jié)果，同時要求對外植體組織和表層細(xì)胞的傷害降至最低。先用75%酒精進(jìn)行消毒，持續(xù)30 s，用無菌水沖洗3～5次，再用0.1%氯化汞消毒5 min，再使用無菌水沖洗 3～5次，消毒過程重復(fù)3次，最后再使用無菌水沖洗3～5次，在超凈工作臺將葉片切成 5 mm×5 mm小塊進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)效果

從表3看出，芍藥離體葉片愈傷誘導(dǎo)率最高為A-4，達(dá)83.3%，誘導(dǎo)出離體葉片愈傷組織的速度最快，為26 d，且誘導(dǎo)的愈傷組織體積大、長勢好，在3～4 d出現(xiàn)褐化；A-3、A-6誘導(dǎo)離體葉片愈傷組織的效果次之，誘導(dǎo)率分別為66.7%、58.3%，誘導(dǎo)出愈傷組織的時間分別為27 d、29 d，且誘導(dǎo)出的愈傷組織在4～5 d出現(xiàn)褐化；A-2、A-5、A-7誘導(dǎo)離體葉片愈傷組織的效果較差，誘導(dǎo)率分別為25.0%、41.7%、50.0%，誘導(dǎo)出愈傷組織的時間分別為30 d、31 d、32 d，在3～5 d出現(xiàn)不同程度褐化?？傮w而言，使用6-BA和ZT具有細(xì)胞分裂活性的分裂素都能夠有效誘導(dǎo)生長點(diǎn)的分化，且6-BA的效果比ZT好，最佳離體葉片誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基的配方為1/2 MS +2，4-D 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+LH 0.5 g/L+6-BA 1.5 mg/L。

表3 不同培養(yǎng)基對芍藥愈傷組織的誘導(dǎo)效果

2.2 愈傷組織的繼代培養(yǎng)效果

芍藥是一種多年生草本植物，次生代謝比較旺盛，而且植株內(nèi)還含有很多自身合成的酚類化合物，因此在組織培養(yǎng)過程中外植體很容易發(fā)生褐化。從表4看出，B-7誘導(dǎo)出愈傷組織到褐化的時間最長，達(dá)117 d，說明B-7培養(yǎng)基能夠有效抑制酚類物質(zhì)的產(chǎn)生和延緩愈傷組織發(fā)生褐化的時間，這對于芍藥愈傷組織的繼代培養(yǎng)十分有利。因此，在芍藥愈傷繼代培養(yǎng)中應(yīng)選用B-7號培養(yǎng)基。

表4 不同濃度激素對芍藥愈傷組織的繼代培養(yǎng)效果

3 小結(jié)

用1/2 MS作為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度6-BA或ZT，對芍藥離體葉片愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明，6-BA和ZT具有細(xì)胞分裂活性的分裂素都能夠有效誘導(dǎo)生長點(diǎn)的分化，且6-BA的效果比ZT好，當(dāng) 6-BA濃度為 1.5 mg/L時芍藥離體葉片愈傷組織的誘導(dǎo)效果最好(誘導(dǎo)率83.3%)，即最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS +2，4-D 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+LH 0.5 g/L+蔗糖 30 g/L+瓊脂 7 g/L+6-BA 1.5 mg/L；最適繼代培養(yǎng)基為1/2 MS 0.1 mg/L+2，4-D 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L+ZT 1.0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+6-BA 1.5 mg/L。

在試驗(yàn)操作中芍藥愈傷組織易被污染，培養(yǎng)基、超凈工作臺及容器等器具在前期一定要做到徹底消毒、規(guī)范操作等。芍藥組織培養(yǎng)一般難生根，這也是芍藥組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)難以應(yīng)用于生產(chǎn)的原因。芍藥離體組織快速繁殖技術(shù)在理論上已經(jīng)被證實(shí)具有可行性，但與實(shí)際生產(chǎn)試驗(yàn)中有較大差距，主要是繼代時間、激素類型、生根方法等多因素會影響到誘導(dǎo)生根，還存在過高的外植體褐化率、很低的不定芽增殖率等較多問題。因此，芍藥離體組織快速繁殖技術(shù)還需要進(jìn)一步深入研究，以建立高效率且穩(wěn)定的植株再生及離體快繁技術(shù)體系。