崔營營，李詩揚(yáng)，趙雅男，迪力娜爾·艾爾肯，劉倩倩，陳玉丙

1.江蘇省蘇北人民醫(yī)院功能檢查科，江蘇揚(yáng)州225000；2.吉林省腫瘤醫(yī)院放療一科，吉林長(zhǎng)春130000；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院腫瘤放療科，吉林長(zhǎng)春130000

國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）2020 年報(bào)告顯示，肺癌以11.4%的比例成為全球第二大癌癥，并成為癌癥相關(guān)死亡的主要原因。非小細(xì)胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）約占全部肺癌病例的 80% ～85%［1］，目前對(duì)于 NSCLC 的治療，逐漸形成手術(shù)、放化療、分子靶向治療、免疫治療的多學(xué)科綜合治療模式。但因放射抵抗及化療、靶向耐藥等，肺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍是臨床面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，其5 年生存率僅為15%［2］。因此，迫切需要尋找新的作用靶點(diǎn)來開發(fā)NSCLC 的新型治療模式。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖（glypican，GPC）是一組細(xì)胞表面糖蛋白，其基因家族在整個(gè)動(dòng)物物種中廣泛表達(dá)，并可作為調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)和分化的多種信號(hào)分子的共受體。GPC1是GPC基因家族的成員之一，其在胰腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等多種惡性腫瘤中過表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及不良預(yù)后相關(guān)［3-6］。NSCLC 中同樣檢測(cè)到GPC1 的高表達(dá)，并與患者的惡性程度及不良預(yù)后相關(guān)，且在放化療后表達(dá)水平顯著降低［7-8］。表明GPC1 在NSCLC 的發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，有望成為NSCLC 新的腫瘤標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。

細(xì)胞周期、凋亡等細(xì)胞途徑是主要的致癌信號(hào)傳導(dǎo)途徑，但在細(xì)胞水平上探討GPC1 對(duì)NSCLC 作用的途徑特征及作用方式的研究較少。本研究以肺腺癌A549 細(xì)胞為研究對(duì)象，通過轉(zhuǎn)染GPC1干擾載體下調(diào)GPC1 的表達(dá)，進(jìn)而探討GPC1 表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖及凋亡的影響，為GPC1 作為肺癌重要參考靶點(diǎn)，開發(fā)新的治療方案提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及GPC1shRNA 肺腺癌A549 細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫；HDMEM 培養(yǎng)基和脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 購自美國Gibco Life Technologies 公司；細(xì)胞周期與凋亡檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒購自上海七海復(fù)泰生物科技公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自北京博邁德科技發(fā)展公司；兔抗GAPDH 多克隆抗體和兔抗GPC1 多克隆抗體購自美國Abcam 公司；HRP Goat anti-Rabbit IgG 購自武漢愛博泰克生物科技公司；GPC1shRNA 套餐（載體類型：pGPU6 ／GFP ／Neo）：shRNA-1（CCCTGACTATTGCCGAAAT）、shRNA-2（GGGACACTGTGCAGTGAGA）、shRNA-3（GCCGGAAGGTCAGCAGGAA）、shRNA-4（GTGCCAACCTGCACCTGGA）、陰性對(duì)照（無意義 shRNA 序列）、陽性對(duì)照（針對(duì)GAPDH的shRNA）均購自蘇州吉瑪基因有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用H-DMEM 培養(yǎng)基 + 胎牛血清 +青霉素 ／ 鏈霉素雙抗配置完全培養(yǎng)基（比例為100 ∶10 ∶1），于 37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)A549 細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及GPC1干擾載體的篩選 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 A549 細(xì)胞，按 2 × 105個(gè) ／ 2 mL 的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至孔板面積80%時(shí)棄去培養(yǎng)基，分別用250 mL 不完全培養(yǎng)基稀釋2 μg質(zhì)粒和4 μL 脂質(zhì)體，靜置5 min 后將二者混勻，在室溫下孵育20 min 后加至培養(yǎng)孔內(nèi)，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h 后，更換為含雙抗的完全培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)染不同GPC1shRNA 序列質(zhì)粒的A549細(xì)胞分別設(shè)為 GPC1-shRNA1、GPC1-shRNA2、GPC1-shRNA3、GPC1-shRNA4 組，轉(zhuǎn)染無意義 shRNA 序列質(zhì)粒的A549 細(xì)胞設(shè)為陰性對(duì)照組（shNC 組），轉(zhuǎn)染GAPDHshRNA 序列質(zhì)粒的A549 細(xì)胞設(shè)為陽性對(duì)照組（GAPDH 組），未轉(zhuǎn)染的A549 細(xì)胞設(shè)為空白對(duì)照組（NC 組），每組均設(shè)3 個(gè)平行樣。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況及生長(zhǎng)狀態(tài)，收集細(xì)胞，提取RNA，采用Real time PCR 檢測(cè)各組細(xì)胞GPC1mRNA 的表達(dá)，篩選沉默效率最高的干擾載體，后續(xù)試驗(yàn)將轉(zhuǎn)染該組的A549 細(xì)胞設(shè)為GPC1沉默組（shGPC1 組）。

1.4 轉(zhuǎn)染GPC1干擾載體后A549 細(xì)胞中GPC1 表達(dá)的檢測(cè)

1.4.1 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549 細(xì)胞分為 3 組：shGPC1、NC 和 shNC 組，按 1.3 項(xiàng)轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒，每組設(shè)3 個(gè)平行樣。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，檢測(cè)GPC1mRNA 及蛋白的表達(dá)。

1.4.2GPC1mRNA 表達(dá)的檢測(cè) 采用Real time PCR法。提取各組細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以其為模板，進(jìn)行Realtime PCR。反應(yīng)體系：9μL ddH2O，12.5 μL SYBR Premix Ex taqⅡ（2 ×），0.5 μL ROX Reference DyeⅡ（50×），上下游引物各 1 μL（100 pmol ／ L），1 μL cDNA。置于PCR 儀進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，采用NCBI-primer-blast 設(shè)計(jì)GPC1引物，F(xiàn)：5′-GTGGCCAGCGACGTGGT C-3′，R：5′-AGGCAGTGAGCACAGTAGACC-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。記錄各組Ct值，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算各組細(xì)胞中GPC1mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4.3 GPC1 蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用Western blot法。各組細(xì)胞中加入適量的蛋白裂解液，置于-70 和37 ℃條件下各1 h。用BCA 蛋白定量試劑盒對(duì)樣品蛋白進(jìn)行定量，經(jīng)12% SDS-PAGE 分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，加入封閉液，37 ℃水平搖床孵育1 h；加入一抗（1 ∶700 稀釋），于 4 ℃冰箱過夜；TBST 緩沖液洗膜 3 次，加入二抗（1 ∶1 000 稀釋），37 ℃水平搖床孵育1 h；PBS 緩沖液洗膜3 次，加入ECL 顯色液，置化學(xué)發(fā)光儀內(nèi)顯色，用Image J 檢測(cè)灰度值。

1.5 沉默GPC1表達(dá)對(duì)A549 細(xì)胞增殖影響的檢測(cè)采用CCK8 試驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549 細(xì)胞，按2 × 103個(gè) ／（100 μL·孔）接種至 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜，將細(xì)胞分為 shGPC1、NC、shNC 組，同時(shí)設(shè)無細(xì)胞的空白對(duì)照孔，每組6 個(gè)平行樣。細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加入10 μL 7sea-Cell Counting kit，輕輕吹打混勻，避免產(chǎn)生氣泡，培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀450 nm 處檢測(cè)吸光度值（A），并按下式計(jì)算細(xì)胞抑制率。

1.6 沉默GPC1表達(dá)對(duì)A549 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期影響的檢測(cè)

采用流式細(xì)胞術(shù)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549 細(xì)胞，按 2 × 105個(gè) ／（2 mL·孔）接種至 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜，將細(xì)胞分為 shGPC1、NC、shNC 組，每組 3個(gè)平行樣。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別收集各組細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期。

1.6.1 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 各EP 管加入400 μL 緩沖液、5μLAnnexinV，充分混勻，室溫條件下避光孵育15 min；加入 10 μL 碘化丙啶 PI，冰上孵育 5 min，30 min 內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6.2 細(xì)胞周期檢測(cè) 各EP 管中的細(xì)胞沉淀用預(yù)冷的1 mL 70%乙醇輕輕混勻，4 ℃固定過夜；PBS 洗滌后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞周期緩沖液500 μL（1 mL緩沖液、25 μL 碘化丙啶 PI、20 μL RNase A），輕輕混勻，37 ℃，避光溫育30 min；5 h 內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)488 nm 處的紅色熒光。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用IBM SPSS Statistics 21 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1GPC1干擾載體的篩選 Real time PCR 檢測(cè)顯示，GPC1-shRNA3 組 A549 細(xì)胞中GPC1mRNA 的表達(dá)水平最低，且較NC 組和shNC 組顯著降低（F=76.117，P＜ 0.001），見圖 1。倒置熒光顯微鏡下觀察顯示，轉(zhuǎn)染GPC1干擾載體的A549 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，可見綠色熒光蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率較高，見圖2。篩選出沉默效率最高的GPC1-shRNA3 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 各組A549 細(xì)胞中GPC1 mRNA 的表達(dá)水平Fig.1 Expression levels of GPC1 mRNA in A549 cells of various groups

圖2 A549 細(xì)胞轉(zhuǎn)染GPC1 shRNA 質(zhì)粒48 h 的熒光顯微鏡觀察（× 200）Fig.2 Fluorescent microscopy of A549 cells 48 h after transfection with GPC1 shRNA plasmid（× 200）

2.2 轉(zhuǎn)染GPC1干擾載體后A549 細(xì)胞中GPC1 的表達(dá)

2.2.1GPC1mRNA 的表達(dá) Real time PCR 結(jié)果顯示，與 NC 組和 shNC 組比較，shGPC1 組 A549 細(xì)胞中GPC1mRNA 的表達(dá)水平顯著降低（F= 24.714，P= 0.001），NC 組與 shNC 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 24.714，P= 0.671）；轉(zhuǎn)染GPC1shRNA 可沉默A549 細(xì)胞中GPC1mRNA 的表達(dá)，沉默效率可達(dá)64%。見表1。

2.2.2 GPC1 蛋白的表達(dá) Western blot 結(jié)果顯示，與 NC 組和 shNC 組比較，shGPC1 組 A549 細(xì)胞中GPC1 蛋白的表達(dá)水平亦顯著降低（F= 24.714，P=0.001），NC 組與 shNC 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=24.714，P= 0.321）；轉(zhuǎn)染GPC1shRNA 可沉默 A549細(xì)胞中GPC1 蛋白的表達(dá)，沉默效率達(dá)48%。見圖3和表1。

圖3 Western blot 分析各組A549 細(xì)胞中GPC1 蛋白的表達(dá)Fig.3 Western blotting of expression of GPC1 protein in A549 cells of various groups

表1 各組 A549 細(xì)胞中 GPC1 mRNA 和蛋白的表達(dá)（，n = 3）Tab.1 Expressions of GPC1 mRNA and protein in A549 cells of various groups（，n = 3）

表1 各組 A549 細(xì)胞中 GPC1 mRNA 和蛋白的表達(dá)（，n = 3）Tab.1 Expressions of GPC1 mRNA and protein in A549 cells of various groups（，n = 3）

注：aa 表示與 NC 組和 shNC 組比較，P ＜ 0.01。

組別mRNA 相對(duì)表達(dá)量（2-ΔΔCt）蛋白相對(duì)表達(dá)量NC 1.010 ± 0.176 1.007 ± 0.013 shNC 1.060 ± 0.112 0.992 ± 0.025 shGPC1 0.366 ± 0.112aa 0.517 ± 0.011aa

2.3 沉默GPC1表達(dá)對(duì)A549 細(xì)胞增殖的影響 CCK8試驗(yàn)結(jié)果顯示，shGPC1、NC 和 shNC 組 A549 細(xì)胞的A450值分別為（0.756± 0.003）、（1.266± 0.005）和（1.255 ± 0.003），與 NC 組及 shNC 組比較，shGPC1組A549 細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯受到抑制（F= 35 620.284，P＜0.001），細(xì)胞抑制率分別可達(dá)40.32%和39.82%。

2.4 沉默GPC1表達(dá)對(duì)A549 細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC 組及shNC 組比較，shGPC1 組A549 細(xì)胞凋亡率分別增加9.9%和9.06%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 1 048.334，P＜ 0.001），見圖4 和表2。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組A549 細(xì)胞凋亡率Fig.4 Flow cytometry of apoptosis rates of A549 cells in various groups

2.5 沉默GPC1表達(dá)對(duì)A549 細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC 組及shNC 組比較，shGPC1 組 A549 細(xì)胞 G2／M 期比例分別增加 16.01%和15.07%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 3 301.016，P＜ 0.001），見圖 5 和表 2。

表2 各組 A549 細(xì)胞的凋亡率及處于 G1、S、G2／ M 期的比例（%，，n = 3）Tab.2 Percentages of A549 cells in G1，S and G2 ／ M phases in various groups（%，，n = 3）

表2 各組 A549 細(xì)胞的凋亡率及處于 G1、S、G2／ M 期的比例（%，，n = 3）Tab.2 Percentages of A549 cells in G1，S and G2 ／ M phases in various groups（%，，n = 3）

注：aaa 表示與 NC 組比較，P ＜ 0.001；與 shNC 組比較，b 表示 P ＜ 0.05，bbb 表示 P ＜ 0.001。

細(xì)胞周期比例G1 S G2／ M NC 4.93 ± 0.12 91.27 ± 0.60 5.17 ± 0.67 3.57 ± 0.18 shNC 5.77 ± 0.19 89.01 ± 0.13 6.49 ± 1.33 4.51 ± 0.32 shGPC1 14.83 ± 0.46aaa，bbb 75.82 ± 0.44aaa，bbb 4.60 ± 0.61b 19.58 ± 0.29aaa，bbb組別 細(xì)胞凋亡率

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組A549 細(xì)胞周期Fig.5 Flow cytometry of cell cycles of A549 cells in various groups

3 討 論

細(xì)胞外信號(hào)可顯著調(diào)節(jié)癌癥的特征［9-10］，在癌癥發(fā)展中發(fā)揮重要作用。GPC1 屬于硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycan，HSPG）家族成員，主要存在于細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)，對(duì)生長(zhǎng)因子信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)起調(diào)節(jié)作用。目前已證實(shí)，GPC1 在肺癌等多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，其參與腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展，介導(dǎo)腫瘤對(duì)化療藥物的耐受。但對(duì)于GPC1表達(dá)在NSCLC 中的作用途徑及機(jī)制研究較少。

本研究以肺癌A549 細(xì)胞為基礎(chǔ)，通過轉(zhuǎn)染GPC1干擾載體成功沉默GPC1 表達(dá)，進(jìn)而探究GPC1 表達(dá)對(duì)A549 細(xì)胞增殖、凋亡及周期進(jìn)程的影響。結(jié)果顯示，shGPC1 組A549 細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，抑制率可達(dá)40.32%。有報(bào)道在人角質(zhì)形成細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞系中也觀察到類似現(xiàn)象［11-12］，當(dāng)下調(diào)這些細(xì)胞系中GPC1 的表達(dá)時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)受限。推測(cè)GPC1可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子的反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，當(dāng)下調(diào)其表達(dá)時(shí)，可表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞增殖的抑制，使細(xì)胞生長(zhǎng)速率明顯下降。細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，shGPC1組細(xì)胞的凋亡率較NC 組及shNC 組顯著增加（P＜0.05），即沉默GPC1 表達(dá)可進(jìn)一步促進(jìn)A549 細(xì)胞凋亡。在食管鱗癌細(xì)胞（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）中同樣出現(xiàn)該結(jié)果，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，GPC1高表達(dá)時(shí)，細(xì)胞中caspase-3 的活化顯著降低，下調(diào)GPC1 表達(dá)后，促凋亡蛋白Bim 和Bik 的表達(dá)水平增高，同時(shí)抗凋亡蛋白Bcl-w 的表達(dá)水平下降，進(jìn)而促進(jìn) ESCC 細(xì)胞的凋亡［13］。由此可見，GPC1 抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的作用途徑可能是活化抗凋亡相關(guān)基因的同時(shí)抑制凋亡相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

沉默GPC1表達(dá)可抑制A549 細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡，推測(cè)可能與抑制有絲分裂的發(fā)生相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，與 NC 組比較，shGPC1 組 A549 細(xì)胞的 G1期及S 期比例下降，而G2／M 期比例增加16.01%（P＜0.001），即沉默GPC1 表達(dá)使A549 細(xì)胞被阻滯在G2／M 期，影響其正常有絲分裂的進(jìn)行。從另一角度分析，放射抵抗是造成NSCLC 患者放療失敗的常見原因。細(xì)胞周期在不同時(shí)相具有不同的輻射敏感性，S 期、G0／ G1期和 G2／ M 期的細(xì)胞分別具有抗輻射性、相對(duì)輻射敏感性和輻射敏感性［14］，因此，調(diào)控細(xì)胞周期成為影響輻射敏感性的重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默GPC1 表達(dá)后，引起A549 細(xì)胞阻滯在G2／ M 期，該期的放射敏感性較高，考慮下調(diào)GPC1表達(dá)可增強(qiáng)NSCLC 的放射敏感性。有報(bào)道已證實(shí)，M2-型丙酮酸激酶基因敲除后，顯著增加了處于G2／M 期的細(xì)胞比例，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡［15］，從而提高了放射敏感性。另有研究發(fā)現(xiàn)，沉默Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白4 表達(dá)引起細(xì)胞在G2／ M 期的阻滯，從而提高了細(xì)胞的凋亡能力，進(jìn)一步提高了三陰性乳腺癌的放射敏感性［16］。因此，靶向GPC1 與放射治療聯(lián)合可能提高NSCLC 的放射敏感性，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，為開發(fā)新型NSCLC 治療方案提供理論基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，沉默A549 細(xì)胞GPC1的表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并引起細(xì)胞發(fā)生G2／ M 期阻滯，為以GPC1 作為重要的參考靶點(diǎn)來研發(fā)新的靶向治療藥物提供了參考，也為探索新型NSCLC 治療方案提供了思路。