李源棟，李娟，段焰青，劉志華，尹開(kāi)云，申欽鵬*

1. 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心（昆明 650202）；2. 昆明香冠科技有限公司（昆明 650202）

檸檬（Citrus LimonBurm. f.）系蕓香科（Rutaceae）柑橘屬（Citrus L.）常綠果樹(shù)，主產(chǎn)于印度、墨西哥、阿根廷、巴西及中國(guó)云南，廣東，廣西，四川、海南等地[1]。檸檬枝、葉、花、皮、果均含有精油，其中果皮精油含量占其鮮重的0.5%~2.0%，主要含有單萜與倍半萜烯類化合物及其含氧衍生物如醇類、醛類、酯類等物質(zhì)[2-3]。由于檸檬油富含有檸檬烯、檸檬醛等多種特殊活性成分，廣泛應(yīng)用于藥品和化妝品等領(lǐng)域，具有護(hù)膚保健[4]、預(yù)防阿茲海默病[5]、調(diào)節(jié)神經(jīng)元[6]、抗菌防腐[7-8]、抗腫瘤[9-10]等功效。

目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)檸檬精油提取工藝及香氣成分研究較多，Lota等[11]分析了9種檸檬果皮精油的香氣成分，主成分分析表明所測(cè)定的9個(gè)樣品可分為檸檬烯型、檸檬烯/β-蒎烯/γ-松油烯型和檸檬烯/乙酸芳樟酯/芳樟醇型。何朝飛等[12]采用HS-SPME-GC-MS對(duì)“北京”檸檬、粗檸檬、“尤力克”的香氣成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同品種檸檬香氣成分存在一定差異，此外，檸檬品質(zhì)差異除了受環(huán)境影響外，基因型起決定性作用。涂勛良等[13]采用水蒸氣蒸餾法提取并結(jié)合GC-MS對(duì)檸檬8個(gè)品種香氣成分進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)含量較高成分有檸檬烯、α-松油醇、γ-松油烯等，其中共有成分24種，共有成分含量間的差異和特異成分決定了8 個(gè)不同品種檸檬香氣的差異，也可作為區(qū)分品種的重要特征。賀紅宇等[14]采用GC/MS分析有機(jī)溶劑法、水蒸氣蒸餾法和壓榨方法提取檸檬精油成分，發(fā)現(xiàn)3種方法提取檸檬精油的成分以萜烯類、醇類、醛類和酯類為主，且含量存在顯著差異。

試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，以云南大理、保山、德宏、紅河產(chǎn)“云檸1號(hào)”檸檬為研究對(duì)象，采用壓榨法提取檸檬油結(jié)合GC/MS對(duì)其成分進(jìn)行了對(duì)比分析，經(jīng)質(zhì)譜檢索后，匹配度結(jié)合保留指數(shù)對(duì)其定性，較好地鑒別了同分異構(gòu)體或同系物，避免了在定性過(guò)程中出現(xiàn)誤判，提高定性的準(zhǔn)確性。另外，通過(guò)對(duì)云南不同產(chǎn)地“云檸1號(hào)”壓榨檸檬油成分系統(tǒng)研究，為其在藥品和化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用提供了指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

檸檬：2017年8月至10月，根據(jù)云南大理、保山、德宏、紅河4個(gè)產(chǎn)地的新鮮“云檸1號(hào)”檸檬成熟情況，適時(shí)采摘適量成熟果實(shí)樣品，帶回實(shí)驗(yàn)室-20 ℃保鮮貯藏。

二氯甲烷、甲醇、正己烷，GR級(jí)，由百靈威科技有限公司提供；正構(gòu)烷烴C7-C30：Sigma-Aidrich公司提供。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Agilent7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀+自動(dòng)進(jìn)樣器（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；壓榨機(jī)（新鄉(xiāng)市新源機(jī)械有限公司）；H2050R高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；萬(wàn)分之一電子天平（瑞士Mettler Tloede公司）；10 mL移液器（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 檸檬油提取方法

參照文獻(xiàn)[15]方法，將云南不同產(chǎn)地“云檸1號(hào)”檸檬鮮果洗凈，放入壓榨機(jī)中壓榨，用分液漏斗收集流出的初油。初油靜置20 min，取上層油放入離心機(jī)中于5 000 r/min條件下離心10 min，獲得5種檸檬油備用。

1.2.2 檸檬油成分分析

準(zhǔn)確稱取檸檬油0.20 g，用甲醇：二氯甲烷（體積比為1∶4）混合溶液稀釋到10 mL，用0.45 μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾，直接進(jìn)GC/MS分析。色譜條件：DB-5ms毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣（純度為99.999%），流速：1.0 mL/min。升溫程序：初始溫度50 ℃，保持2 min；以4 ℃/min的速率升溫至230 ℃，保持20 min。進(jìn)樣口溫度：250 ℃，進(jìn)樣量：1.0 μL，分流比：20∶1，溶劑延遲6 min。質(zhì)譜條件：電轟擊電離（EI）源；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：280 ℃；掃描范圍（m/z）：40~450，質(zhì)譜檢索圖庫(kù)：NIST譜庫(kù)。

1.2.3 定性方法

移取正構(gòu)烷烴C7-C30標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷溶液將其稀釋成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%溶液，按照1.2.2儀器操作條件進(jìn)樣，求出正構(gòu)烷烴C7-C30保留時(shí)間，為下一步計(jì)算檸檬油中各成分保留指數(shù)作準(zhǔn)備。

根據(jù)Vanden Dool和Kratz的線性程序升溫的保留指數(shù)原理，利用自編軟件求得保留指數(shù)（KI）值：

式中：tR為保留時(shí)間，下標(biāo)χ表示待分析化合物，下標(biāo)n和n+1分別表示正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)。

樣品檸檬油經(jīng)過(guò)GC/MS分析后，利用儀器自帶NIST質(zhì)譜庫(kù)對(duì)檸檬油中化學(xué)成分進(jìn)行自動(dòng)檢索，然后通過(guò)自我開(kāi)發(fā)的保留指數(shù)軟件求出各成分保留指數(shù)，將軟件計(jì)算的保留指數(shù)與ESO精油數(shù)據(jù)庫(kù)中保留指數(shù)進(jìn)行比對(duì)（可接受誤差不超過(guò)3%），對(duì)其進(jìn)行定性。

1.2.4 定量方法

樣品檸檬油經(jīng)過(guò)GC/MS分析后，采用色譜峰面積歸一化法計(jì)算得出各化學(xué)成分相對(duì)百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬油成分分析

云南不同產(chǎn)地“云檸1號(hào)”壓榨檸檬油經(jīng)GC/MS檢測(cè)所得到總離子流色譜圖見(jiàn)圖1~圖4，其結(jié)果采用Nist 11進(jìn)行檢索后結(jié)合ESO香精保留指數(shù)進(jìn)行對(duì)比對(duì)其定性，利用面積歸一化法計(jì)算得出檸檬油中各成分相對(duì)百分含量，結(jié)果見(jiàn)表1所示。

圖1 大理“云檸1號(hào)”檸檬油氣相色譜/質(zhì)譜總離子流色譜圖

圖4 紅河“云檸1號(hào)”檸檬油氣相色譜/質(zhì)譜總離子流色譜圖

表1 GC/MS方法對(duì)不同產(chǎn)地“云檸1號(hào)”檸檬油成分的定性結(jié)果

接表1

圖2 保山“云檸1號(hào)”檸檬油氣相色譜/質(zhì)譜總離子流色譜圖

圖3 德宏“云檸1號(hào)”檸檬油氣相色譜/質(zhì)譜總離子流色譜圖

通過(guò)質(zhì)譜庫(kù)檢索和人工圖譜解析，結(jié)合保留指數(shù)比對(duì)，從云南大理、保山、德宏、紅河“云檸1號(hào)”壓榨檸檬油中共鑒定60個(gè)化合物，其中從大理檸檬油中共鑒定30個(gè)化合物，占總峰面積的96.58%，保山檸檬油中共鑒定42個(gè)化合物，占總峰面積的95.66%，德宏檸檬油中共鑒定30個(gè)化合物，占總峰面積的93.13%，紅河檸檬油中共鑒定34個(gè)化合物，占總峰面積的95.31%。由表2可見(jiàn)，同一品種云南不同產(chǎn)地的5種壓榨檸檬油中化合物種類及相對(duì)含量間存在差異。

表2 不同產(chǎn)地 “云檸1號(hào)”檸檬油成分類別及相對(duì)含量

2.2 檸檬油揮發(fā)性特征成分及含量分析

云南不同產(chǎn)地的“云檸1號(hào)”壓榨檸檬油均含有檜烯、β-蒎烯、月桂烯、α-松油烯、檸檬烯、(Z)-β-羅勒烯、(E)-β-羅勒烯、γ-松油烯、萜品油烯、(E)-香芹醇、橙花醛、香芹酮、檸檬醛、乙酸橙花酯、乙酸香葉酯。該15個(gè)共有成分分別占云南大理、保山、德宏、紅河“云檸1號(hào)”壓榨檸檬油總峰面積的94.16%，89.73%，89.21%和92.82%，存在一定差異。其中大理檸檬油特有成分為環(huán)小茴香烯，占總峰面積的0.14%，保山檸檬油特有成分為(E)-水合檜烯、對(duì)傘花烴-8-醇，分別占總峰面積的0.31%和0.03%，德宏檸檬油特有成分為辛醛、δ-3-蒈烯、對(duì)異丙烯基甲苯、葑醇、(E)-對(duì)?-2, 8-二烯-1-醇、(Z)-對(duì)?-2, 8-二烯-1-醇、香茅醇、甲酸香茅酯、十二醛，分別占總峰面積的0.70%，0.22%，0.03%，0.03%，0.05%，0.77%，0.33%和0.06%，紅河檸檬油特有成分為(E)-β-松油醇，占總峰面積的0.26%，共有成分種類表明云南不同產(chǎn)地的“云檸1號(hào)”壓榨檸檬油成分具有一定的相似性，而共有成分含量差異和特異成分表明種4種“云檸1號(hào)”壓榨檸檬油成分具有一定差異。

2.3 保留指數(shù)在定性鑒定中的應(yīng)用

通過(guò)質(zhì)譜庫(kù)檢索，結(jié)合ESO精油數(shù)據(jù)庫(kù)輔助定性，提高了天然化合物定性準(zhǔn)確性，減少了誤判和錯(cuò)判。對(duì)檢索出60種化合物進(jìn)行定性分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)許多萜烯類、醇類等化合物，若僅用質(zhì)譜庫(kù)檢索定性會(huì)難以判定甚至誤判，尤其是同系物和同分異構(gòu)體的確定[17]。

如表1所示，需確認(rèn)化合物為α-松油烯，根據(jù)質(zhì)譜相似度定性結(jié)果顯示，幾種同分異構(gòu)體的匹配度都很高，無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分，經(jīng)比對(duì)保留指數(shù)庫(kù)可知上述α-松油烯、γ-松油烯、δ-杜松烯保留指數(shù)分別為1 015，1 063和1 524，根據(jù)實(shí)測(cè)保留指數(shù)1 019，可判斷化合物應(yīng)為α-松油烯。此外，β-蒎烯、β-沒(méi)藥烯、α-水芹烯等化合物定性同樣須經(jīng)保留指數(shù)輔助方可確認(rèn)。通過(guò)質(zhì)譜庫(kù)檢索結(jié)合保留指數(shù)法，可準(zhǔn)確判定檸檬油成分。

3 討論

萜烯類化合物是柑橘水果精油中最主要成分，主要包括檸檬烯、檜烯、月桂烯、β-蒎烯、γ-松油烯等，其中檸檬烯在云南不同產(chǎn)地的“云檸1號(hào)”壓榨檸檬油中含量最高（47.78%~65.19%），該研究結(jié)果比Lota等[11]、何朝飛等[12]對(duì)檸檬烯含量報(bào)道高，低于朱春華等[18]、賀紅宇等[14]對(duì)檸檬烯含量報(bào)道，檸檬烯含量差異可能與栽培地理環(huán)境、材料選取、提取方法等[19-20]有關(guān)。另外，檜烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-松油烯、萜品油烯含量與產(chǎn)地密切相關(guān)，其中檜烯在保山檸檬油中含量最高達(dá)到3.01%，而在德宏檸檬油中只占0.74%，為后者的3.01倍；β-蒎烯德宏檸檬油含量最高達(dá)到14.56%，在紅河檸檬油中占10.26%；γ-松油烯在大理檸檬油中含量最高達(dá)到12.84%，而在德宏檸檬油中占9.22%；月桂烯在德宏檸檬油含量最高達(dá)到2.34%，而在大理檸檬油中含量占1.76%，萜品油烯德宏檸檬油中含量最高，達(dá)到1.40%。

含氧類化合物主要有醛類、酯類、醇類和酮類等化合物，其中醛類主要包括檸檬醛、橙花醛，大理檸檬油中檸檬醛含量最高達(dá)到2.09%，而保山檸檬油中檸檬醛含量?jī)H含0.04%；德宏檸檬油中橙花醛含量最高達(dá)到1.27%，而德宏檸檬油中橙花醛含量占0.03%。

酯類主要是乙酸橙花酯和乙酸香葉酯，其中乙酸橙花酯在保山檸檬油中含量最高達(dá)到1.01%，瑞麗檸檬油中占0.51%，云南4個(gè)不同產(chǎn)地的檸檬油中乙酸香葉酯含量均未達(dá)到1%，相對(duì)含量為0.05%~0.82%；醇類和酮類含量和種類都不多，醇類化合物主要包括芳樟醇、4-松油醇、α-松油醇等，瑞麗檸檬油中醇類化合物含量總量最高達(dá)1.65%，大理檸檬油中醇類化合物含量占0.34%，為后者的3.85倍；酮類化合物含有香芹酮、葑酮等，大理檸檬油酮類化合物含量最高達(dá)到1.79%，紅河檸檬油酮類化合物含量?jī)H為0.02%。

4 結(jié)論

研究采用GC/MS結(jié)合保留指數(shù)對(duì)云南4個(gè)產(chǎn)地的“云檸1號(hào)”壓榨檸檬油成分進(jìn)行對(duì)比分析，共鑒定60種化合物，其中大理、保山、德宏、紅河、瑞麗檸檬油中分別鑒定30，42，30和34種成分，各占峰面積總量的96.58%，95.66%，93.13%和95.31%。主要成為為檜烯、β-蒎烯、月桂烯、檸檬烯、γ-松油烯、檸檬醛、乙酸橙花酯、乙酸香葉酯等，其中共有成分15種，共有成分含量間的差異和特異成分決定了云南4個(gè)產(chǎn)地的“云檸1號(hào)”壓榨檸檬油成分的差異。該研究為其在藥品和化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用提供了指導(dǎo)。