范珉玨， 段永強(qiáng)， 虎峻瑞， 羅 強(qiáng)， 楊曉軼， 李能蓮， 馬 駿， 鞏子漢

（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730000；4中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700）

胃潰瘍（gastric ulcer）是發(fā)生于賁門與幽門之間的消化性潰瘍，與炎癥關(guān)系密切［1］。目前西醫(yī)治療以抑酸類藥物、胃黏膜保護(hù)劑及抗菌治療為主，注重胃潰瘍病理層面的修復(fù)，而中醫(yī)治療則根據(jù)患者胃部疼痛的特點(diǎn)及伴隨癥狀進(jìn)行辨證論治［2］，在促進(jìn)胃潰瘍愈合的同時(shí)，減輕患者伴隨癥狀，提高患者生活質(zhì)量。脾胃虛寒為最常見的證型之一［3］，表現(xiàn)為胃脘部隱痛，喜溫喜按，得食痛減，并伴有四肢疲倦、畏寒肢冷、大便溏薄等癥狀，舌淡或舌邊齒痕，舌苔薄白，脈虛弱或遲緩。張仲景《金匱要略》的甘溫建中理論可有效地指導(dǎo)治療脾胃虛寒型胃潰瘍［4］。景芪愈潰膠囊（Jingqi-Yukui capsule，JQYK）為甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，發(fā)掘于敦煌古醫(yī)方大陽旦湯，以甘溫的黃芪和飴糖為君藥，行溫中益氣健脾之效。前期研究發(fā)現(xiàn)，JQYK 可有效提高胃內(nèi)前列腺素E2及血中表皮生長因子的含量，促進(jìn)胃潰瘍愈合［5］。在此基礎(chǔ)上，本研究擬通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察JQYK 對(duì)脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠胃組織中血管細(xì)胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）和細(xì)胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）表達(dá)水平及促炎因子［白細(xì)胞介素1（interleukin-1，IL-1）和IL-6］和抗抑炎因子（IL-4 和IL-13）含量的影響，探討該復(fù)方對(duì)脾胃虛寒型胃潰瘍的療效及作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)Wistar 大鼠70 只，雌雄各半，體重（200±20）g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)為SCXK（甘）2015-0002，合格證號(hào)為62001000000449。本實(shí)驗(yàn)獲得甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為2019001。

1.2 主要藥物 JQYK（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，每粒0.4 g），成人口服劑量為4.5 g/d，批號(hào)181101；雷貝拉唑鈉腸溶膠囊（rabeprazole sodium entericcoated capsule，RBPZ）購自濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司（每粒10 mg），成人口服劑量為20 mg/d，批號(hào)1807015；安胃瘍膠囊（An-Weiyang capsule，AWY）購自惠州市九惠制藥股份有限公司（黃酮類化合物每粒0.2 g），成人口服劑量為1.6 g/d，批號(hào)181014。

1.3 試劑和儀器 冰乙酸（批號(hào)20170327，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；大鼠IL-1、IL-4、IL-6 和IL-13 ELISA 試劑盒（上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司）；Trizol試劑（批號(hào)152104；Ambion）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)AI40704A）和RT-qPCR試劑盒（批號(hào)AI61180A）均購自TaKaRa；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（H+L）抗體（批號(hào)RS23710）和抗GAPDH 抗體（批號(hào)YM3215）均購自ImmunoWay；抗VCAM-1 抗體（批號(hào)GTX12133）和抗ICAM-1 抗體（批號(hào)GTX22213）均購自GeneTex。

BX51-32H01 顯微鏡（Olympus）；DF110 電子分析天平（江蘇常熟衡器工業(yè)有限公司）；SCIENTZ-48高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；CT14RD高速低溫離心機(jī)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴箱（江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所）；BIOMATE 3S 核酸蛋白測定儀、10705 Benchmark Plus 酶聯(lián)免疫檢測儀、CFX96 Optics Module PCR 儀、S1000逆轉(zhuǎn)錄儀、ChemiDoc XRS 凝膠成像分析系統(tǒng)和PowerPac WB 電泳及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（Bio-Rad）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組、造模及動(dòng)物給藥 除空白（blank）組（n=8，雌雄各半）大鼠正常飼養(yǎng)不予造模外，其余大鼠（n=62）造模參照文獻(xiàn)［6-7］方法：（1）大黃苦寒瀉下法：4 ℃的100%大黃水煎液，20 mL/kg，每日灌胃1次。（2）饑飽失常喂養(yǎng)法：單日禁食，雙日足量喂養(yǎng)，連續(xù)造模10 d。大鼠扎堆抱團(tuán)，精神萎靡、瞇眼，皮毛枯槁雜亂無光澤，脫毛明顯，便稀或便溏，體重增長緩慢，攝食量減少（適應(yīng)造模藥物后，每日攝食量維持在每只19 g 左右），肛溫降低，評(píng)定脾胃虛寒模型建立成功。（3）改良Okabe 法：禁食24 h，予10%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉，劍突下0.5 cm縱向切開腹壁，將胃移出腹腔，用內(nèi)徑5 mm 的玻璃管垂直置于胃前壁體竇交界處靠胃竇側(cè)漿膜面，管內(nèi)加入冰乙酸0.2 mL，1 min 后用棉簽蘸出冰乙酸，然后將胃放回腹腔，大網(wǎng)膜覆蓋，逐層縫合，溫覆保暖待醒。手術(shù)3 d 后，隨機(jī)處死造模大鼠3 只，觀察胃潰瘍形成情況，包括胃潰瘍的大小，黏膜的色澤及瘀血。評(píng)價(jià)脾胃虛寒型胃潰瘍模型大鼠胃潰瘍形成后開始治療，用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型（model）組，JQYK 高（JQYK-H）、中（JQYK-M）、低（JQYK-L）劑量組，中藥陽性對(duì)照（AWY）組，以及西藥陽性對(duì)照（RBPZ）組，每組8只，分籠飼養(yǎng)。

分組后開始灌胃給藥，每日1 次，連續(xù)14 d。blank 組和model 組取2 mL 蒸餾水灌胃，其余各干預(yù)組按體表面積折算法計(jì)算大鼠等效劑量（相當(dāng)于臨床成人用量的5.4 倍），取相應(yīng)劑量藥物膠囊內(nèi)容物與蒸餾水制成2 mL 混懸液灌胃。JQYK 的高、中、低劑量分別為0.81、0.405 和0.202 g/kg，AWY 的劑量為0.144 g/kg，RBPZ的劑量為1.8 mg/kg。

2.2 取材 末次灌胃給藥后禁食不禁水24 h，測體重后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，剖腹取胃，沿胃大彎剪開以冰冷的生理鹽水沖洗，濾紙吸干，測量后截取胃竇部組織，一部分置于4%多聚甲醛中固定，其余置于-80 ℃冰箱保存待測；大鼠尸體集中交于科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行無害化處理。

2.3 潰瘍指數(shù)（ulcer index，UI）檢測 使用游標(biāo)卡尺測量潰瘍最大長徑，胃黏膜UI計(jì)算公式為：UI=π×（潰瘍最大長徑/2）2。

2.4 HE染色 取4%多聚甲醛中已固定的胃竇部組織，經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后，光鏡下觀察。

2.5 ELISA法檢測胃組織IL-1、IL-4、IL-6和IL-13的含量 制備各組胃組織10%組織勻漿，使用大鼠IL-1、IL-4、IL-6 和IL-13 ELISA 試劑盒，嚴(yán)格按照說明書操作，經(jīng)過加樣、溫育、洗滌、加酶標(biāo)試劑、溫育、洗滌、顯色、測定等步驟，檢測并計(jì)算目標(biāo)蛋白的含量。2.6 RT-qPCR 檢測mRNA 表達(dá) 采用Trizol 法提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成模板cDNA 并擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物序列并由TaKaRa 公司合成，見表1。以βactin 為內(nèi)參照，相同模板相同基因設(shè)3 個(gè)復(fù)孔、6 次平行實(shí)驗(yàn)，得到各擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值，用2-ΔΔCt法定量。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The primer sequences for RT-qPCR

2.7 Western blot 檢測蛋白水平 提取各組胃組織總蛋白，BCA 試劑盒測定總蛋白濃度，配制SDSPAGE 凝膠，蛋白取每泳道4 μg 上樣，電泳并轉(zhuǎn)膜，5% 牛血清白蛋白封閉，加入Ⅰ抗（抗GAPDH、VCAM-1 和ICAM-1 抗體與封閉液配制比例分別為1∶5 000、1∶2 000 和1∶2 000）4 ℃過夜，次日TBST 洗膜后加入Ⅱ抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 與封閉液配制比例1∶1 0000），室溫孵育1 h，TBST 洗滌曝后光顯影，用Bio-Rad Quantity One 圖像分析軟件進(jìn)行掃描并用ImageJ 圖像處理軟件進(jìn)行分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 24.0軟件處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用采用SNK-q檢驗(yàn)；由于model 組、JQYK-M 組及AWY 組大鼠的UI 數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布，故采用多個(gè)獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠胃組織的病理學(xué)觀察

與blank 組比較，model 組大鼠胃部積食嚴(yán)重，生理鹽水洗去食物殘?jiān)罂梢娚钪良拥妮^大糜爛潰瘍面，黏膜壁潰瘍處凹陷，潰瘍周邊皺襞消失；100倍鏡下觀察可見黏膜層、黏膜下層和肌層大面積缺失、壞死，血管和胃底腺基本消失，有大量炎癥細(xì)胞滲出。與model 組比較，JQYK-H 組大鼠胃黏膜完整光滑，局部顏色稍淡，皺襞清晰，未見潰瘍點(diǎn)；100 倍鏡下觀察可見黏膜單層柱狀上皮分布完整均勻，柱狀細(xì)胞間分界清楚，排列較整齊，黏膜固有層、黏膜肌層、黏膜下層和肌層結(jié)構(gòu)清晰完整，可見少量炎癥細(xì)胞滲出，但與blank組最為接近。見圖1。

Figure 1. HE staining results of the gastric tissue in rats（×10）. RBPZ：rabeprazole sodium enteric-coated capsule；JQYK-H：highdose Jingqi-Yukui capsule；JQYK-M：medium-dose Jingqi-Yukui capsule；JQYK-L：low-dose Jingqi-Yukui capsule；AMY：An-Weiyang capsule.圖1 各組大鼠胃組織HE染色結(jié)果

2 各組大鼠UI 和胃組織IL-1、IL-6、IL-4 和IL-13蛋白含量的比較

7 個(gè)組潰瘍指數(shù)的平均秩次由高到低依次是：model 組、JQYK-L 組、JQYK-M 組、AWY 組、RBPZ 組、JQYK-H 組和blank 組（P＜0.01，即7 個(gè)組的潰瘍指數(shù)不全相同）。與blank 組比較，model 組大鼠胃組織IL-1 和IL-6 含量顯著升高（P＜0.01）；與model 組比較，各干預(yù)組大鼠IL-1 和IL-6 含量有不同程度的降低，尤以JQYK-H 組效果顯著（P＜0.05）。與blank 組比較，model 組大鼠胃組織IL-4 和IL-13 含量顯著降低（P＜0.01）；與model 組比較，各干預(yù)組大鼠IL-4 和IL-13 含量有不同程度的升高，尤以JQYK-H 組效果顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠UI及胃組織IL-1、IL-6、IL-4和IL-13含量的比較Table 2. Comparison of ulcer index（UI）and levels of IL-1，IL-6，IL-4 and IL-13 in gastric tissue of the rats（Mean±SD. n=8）

3 各組大鼠胃組織VCAM-1 和ICAM-1 mRNA 和蛋白表達(dá)的比較

與blank 組比較，model 組大鼠胃組織VCAM-1和ICAM-1 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與model 組 比 較，除JQYK-M 和JOYK-L 組VCAM-1 的mRNA 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）外，其余各干預(yù)組大鼠胃組織VCAM-1 和ICAM-1 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），尤 以JQYK-H 組 效 果 顯 著（P＜0.01），見圖2、3。

Figure 2. The mRNA expression of VCAM-1 and ICAM-1 in the gastric tissues of different groups detected by RT-qPCR. JQYK-H：high-dose Jingqi-Yukui capsule；JQYK-M：medium-dose Jingqi-Yukui capsule；JQYK-L：low-dose Jingqi-Yukui capsule；AMY：An-Weiyang capsule；RBPZ：rabeprazole sodium enteric-coated capsule. Mean±SD. n=8.**P＜0.01 vs blank group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs model group.圖2 RT-qPCR檢測大鼠胃組織VCAM-1和ICAM-1的mRNA表達(dá)水平

Figure 3. The protein expression of VCAM-1 and ICAM-1 in the gastric tissues of different groups determined by Western blot. JQYKH：high-dose Jingqi-Yukui capsule；JQYK-M：medium-dose Jingqi-Yukui capsule；JQYK-L：low-dose Jingqi-Yukui capsule；AMY：An-Weiyang capsule；RBPZ：rabeprazole sodium enteric-coated capsule. Mean±SD. n=8. **P＜0.01 vs blank group；##P＜0.01 vs model group.圖3 Western blot檢測各組大鼠胃組織VCAM-1和ICAM-1的蛋白表達(dá)

討 論

JQYK 以敦煌古醫(yī)方大陽旦湯加烏貝散為主，方中以生黃芪和飴糖為君藥，益氣健脾、養(yǎng)血生??；桂枝、白芍和紅參三藥同用，發(fā)揮溫中健脾、通脈止痛之功；海螵蛸和浙貝母同用抑酸斂瘡，且浙貝母藥性偏寒，使全方不至過于溫補(bǔ)；紅景天益氣通脈活血；白及和三七共奏止血斂瘡生肌之功；生姜、大棗和陳皮合而升騰中焦生發(fā)之氣行津液和營衛(wèi)；炙甘草緩急止痛、調(diào)和諸藥。全方具有益氣溫陽、健脾和胃、斂瘡生肌、抑酸止痛之效。

細(xì)胞黏附分子（cell adhesion molecules，CAMs）是指由細(xì)胞產(chǎn)生，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)間相互接觸并結(jié)合的一類分子，主要包括ICAM-1 和VCAM-1。CAMs 與炎癥關(guān)系密切［8］。在IL-1、IL-6 和TNF-α 等炎癥細(xì)胞因子的作用下，ICAM-1 在白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)可迅速上調(diào)，與此同時(shí)，在體內(nèi)炎癥的病理?xiàng)l件下，VCAM-1也在血管內(nèi)皮和血管平滑肌細(xì)胞上表達(dá)［9］；ICAM-1 和VCAM-1 的高表達(dá)促進(jìn)了炎癥細(xì)胞的滲透，促使炎癥持續(xù)發(fā)生，導(dǎo)致炎癥因子IL-1 和IL-6 等的持續(xù)產(chǎn)生，形成了炎性通路的循環(huán)從而加重胃黏膜的損傷。因此下調(diào)粘附分子可抑制炎癥細(xì)胞滲透［10］，從而抑制炎癥反應(yīng)促進(jìn)黏膜修復(fù)［11］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，降低ICAM-1 和VCAM-1 表達(dá)水平可減緩炎癥反應(yīng)而發(fā)揮抗胃潰瘍的作用［12］；減少IL-1β的分泌，抑制炎癥反應(yīng)可發(fā)揮對(duì)胃潰瘍的治療作用［13］；降低胃組織勻漿IL-6、IL-8 及TNF-α 的水平可減輕局部炎癥細(xì)胞浸潤，促進(jìn)胃潰瘍愈合［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠胃組織中ICAM-1 和VCAM-1 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平及IL-1和IL-6 含量均顯著升高；JQYK 各劑量組大鼠胃組織ICAM-1 和VCAM-1 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平及IL-1和IL-6含量均有不同程度降低，提示JQYK 可抑制細(xì)胞粘附分子VCAM-1 和ICAM-1 的表達(dá)進(jìn)而減少促炎因子IL-1和IL-6的含量，從而發(fā)揮抗炎作用。

此外，相關(guān)研究指出，炎癥因子釋放增多，改變機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，可誘發(fā)Th1/Th2 細(xì)胞間失去平衡，從而改變胃黏膜的屏障功能和免疫反應(yīng)導(dǎo)致胃潰瘍的產(chǎn)生［15］。IL-4和IL-13都是由活化的Th2細(xì)胞分泌的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子［16］，可作用于巨噬細(xì)胞，使其活化為M2 型巨噬細(xì)胞［17］，發(fā)揮抗炎作用，促進(jìn)創(chuàng)面愈合［18］。研究表明，降低IL-6 和TNF-α 含量，升高IL-4 含量可減少胃潰瘍面積［19］。本研究表明，脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠胃組織IL-4 和IL-13 含量顯著降低；JQYK 各劑量組大鼠胃組織IL-4 和IL-13 含量不同程度的升高，提示JQYK 可提高抗炎因子IL-4 和IL-13 的含量而發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，JQYK 可有效降低脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠的UI，促進(jìn)胃潰瘍的愈合，其機(jī)制可能與其抑制VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控炎癥因子的平衡有關(guān)。