吳紫欣， 王 菲， 羅青青， 楊 平， 梁文龍， 魏建昌，李冠煒， 魏 芳， 曹 杰， 李旺林

（華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006）

隨著人們對(duì)腸系膜解剖學(xué)及功能的認(rèn)識(shí)，腸系膜逐漸被定義為一個(gè)新的、獨(dú)立的器官［1］。腸系膜是一種雙層皺褶腹膜，附著于腸道及腹腔內(nèi)壁，從十二指腸延伸到直腸呈扇形展開(kāi)，連續(xù)地連接著整個(gè)腸道，懸吊、固定大小腸于腹腔內(nèi)以保證腸道的相對(duì)位置［1］。腸系膜由表面的間皮細(xì)胞、結(jié)締組織間隔及大量脂肪細(xì)胞群組成，脂肪組織通過(guò)表達(dá)被稱(chēng)為脂肪因子的激素和介質(zhì)參與調(diào)節(jié)代謝、炎癥和免疫功能［2-3］。腸系膜內(nèi)除了有血管、淋巴管和神經(jīng)纖維走行，也有較多淋巴結(jié)，與腸道建立了大量血液及淋巴液的交通，是收集腸道信息的最佳位置［1］，參與介導(dǎo)局部及全身反應(yīng)。除淋巴管和淋巴結(jié)外，腸系膜脂肪細(xì)胞間也散在分布著免疫細(xì)胞，正常狀態(tài)下，腸系膜中有大量抑炎免疫細(xì)胞，包括M2型巨噬細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T（regulatory T，Treg）細(xì)胞［4］。然而，腸系膜免疫微環(huán)境內(nèi)淋巴細(xì)胞的組成和表型尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

腸系膜作為腸道血液及淋巴液的輸送途徑，可參與多種腸道疾病，包括結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）和炎性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）等。許多腹腔內(nèi)腫瘤，如卵巢癌［5］、子宮內(nèi)膜癌［6］、胃癌［7］和胰腺癌［8］等都有轉(zhuǎn)移到腹膜的傾向，并且出現(xiàn)腹膜轉(zhuǎn)移的患者疾病進(jìn)展快，預(yù)后非常差。此外，多個(gè)研究顯示脂肪組織尤其內(nèi)臟肥胖顯著促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［9-10］。同樣值得注意的是，腸系膜的臨床意義也不僅僅局限于腹部疾病［11-12］。腸系膜是內(nèi)臟脂肪的最大貢獻(xiàn)者［13］，它在肥胖、糖尿病和代謝綜合征等的病理生理過(guò)程中也發(fā)揮關(guān)鍵的作用［14-15］。因此，深入探究腸系膜免疫微環(huán)境具有重要的科學(xué)及臨床意義。

在本研究中，我們探討了腸系膜的免疫微環(huán)境，尤其是淋巴細(xì)胞的組成和表型及其影響因素，描繪了腸系膜淋巴細(xì)胞圖譜。我們觀(guān)察到腸系膜存在與外周血不同的特定免疫微環(huán)境，其內(nèi)的免疫細(xì)胞主要由淋巴譜系組成，能在一定程度上發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞毒性等功能，同時(shí)性別、年齡、血脂和腸系膜位置影響腸系膜淋巴細(xì)胞的組成和表型，為探討腸系膜在多種疾病中的作用提供了參考資料。

材 料 和 方 法

1 新鮮腸系膜組織及外周血樣本

本研究收集了2018～2020 年間在廣州市第一人民醫(yī)院結(jié)直腸肛門(mén)外科接受手術(shù)的26 例CRC 患者的距腫瘤組織＞10 cm 的正常腸系膜新鮮組織（normal mesentery，NM）和其中13 例CRC 患者的術(shù)前外周血樣本以及所納入患者的臨床資料。所有患者均無(wú)乙肝病毒、梅毒和HIV 感染，無(wú)IBD 病史。廣州市第一人民醫(yī)院倫理審查委員會(huì)已通過(guò)本實(shí)驗(yàn)方案，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

2 方法

2.1 腸系膜組織及外周血樣本單細(xì)胞懸液的制備仔細(xì)分離并去除NM中的淋巴結(jié)與血塊，將剩余組織用PBS進(jìn)行多次清洗，剪碎后轉(zhuǎn)入15 mL離心管并加入10 mL組織消化液（含1 g/L Ⅱ型膠原酶和1%BSA的DMEM/F-12培養(yǎng)液）在37 ℃條件下200 r/min 搖床震蕩30 min。消化結(jié)束后使用200 目尼龍網(wǎng)過(guò)濾未消化組織，收集濾液到新的離心管中，離心收集細(xì)胞沉淀。隨后加入2 mL 紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，4 ℃孵育10 min后加滿(mǎn)PBS，離心收集細(xì)胞沉淀并進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。2 mL外周血離心去除血清后與生理鹽水1∶1 混合稀釋?zhuān)陔x心管下層加入3 mL 人淋巴細(xì)胞分離液，外周血稀釋液沿傾斜的管壁慢慢加到人淋巴細(xì)胞分離液上層，室溫800×g離心20 min。仔細(xì)收集中間白膜層，即外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）于新離心管中，PBS洗滌后離心收集細(xì)胞沉淀并進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.2 流式細(xì)胞術(shù) NM 和PBMCs 的單細(xì)胞懸液首先與野生型小鼠血清孵育進(jìn)行封閉，并在4 ℃條件下與流式抗體（信息見(jiàn)表1）混合液孵育20 min。孵育結(jié)束后加滿(mǎn)PBS 洗滌去除未與抗原結(jié)合的流式抗體，離心收集細(xì)胞沉淀，隨后將細(xì)胞重懸至300 μL并使用200 目尼龍網(wǎng)濾到流式管中，加入6 μL DAPI 染色液后，使用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)熒光表達(dá)。

表1 流式細(xì)胞術(shù)的抗體信息Table 1. Antibody information for flow cytometry

2.3 t 分布隨機(jī)近鄰嵌入（t-distributed stochastic neighbor embedding，t-SNE）算法分析多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù) 在FlowJo 軟件中分別從PBMCs 和NM 的CD45+單個(gè)核細(xì)胞（mononuclear cells，MNCs）進(jìn)門(mén)后，導(dǎo)出包含各個(gè)通道熒光信號(hào)值的表達(dá)矩陣。分別從PBMCs 和NM 的矩陣中隨機(jī)選擇10 000 個(gè)CD45+MNCs，在R3.5.3軟件中將它們合并成一個(gè)矩陣。使用Seurat 包（版本3.1.5）NormalizeData 函數(shù)中的“CLR”算法對(duì)表達(dá)矩陣的每個(gè)通道的熒光表達(dá)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。使用Seurat 包的RunTSNE 函數(shù)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化后的表達(dá)矩陣進(jìn)行t-SNE 降維分析，并通過(guò)FindNeighbors 與FindClusters 函數(shù)進(jìn)行細(xì)胞的聚類(lèi)和分群，隨后基于每個(gè)通道的表達(dá)分布情況對(duì)不同的細(xì)胞亞群進(jìn)行鑒定。用同樣的方法分別從PBMCs和NM的T細(xì)胞或B細(xì)胞進(jìn)門(mén)后，分別隨機(jī)選擇5 500個(gè)T細(xì)胞或2 000個(gè)B細(xì)胞進(jìn)行t-SNE降維分析。

2.4 免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）染色和多重?zé)晒釯HC（multiplex IHC，mIHC）染色 （1）IHC染色即厚度為6 μm的腸系膜組織石蠟切片經(jīng)過(guò)環(huán)保透明劑脫臘、梯度乙醇水化、高溫抗原修復(fù)、3%過(guò)氧化氫-甲醇消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性、10%山羊血清封閉孵育后，每張切片滴加Ⅰ抗（CD4、CD8和CD19）后在濕盒中室溫孵育2 h 或4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗滌后滴加Ⅱ抗，TBST 洗滌后使用DAB 顯色液顯色。隨后經(jīng)蘇木素復(fù)染、大量自來(lái)水返藍(lán)、梯度乙醇脫水、環(huán)保透明劑透明和中性樹(shù)膠封片，最后使用Aperio CS2 數(shù)字病理掃描系統(tǒng)掃描。（2）mIHC 染色則是TBST 洗滌Ⅱ抗后使用酪胺信號(hào)放大（tyramide signal amplification，TSA）熒光染料標(biāo)記，TBST洗滌后切片重新抗原修復(fù)、封閉后進(jìn)行下一輪染色，使用不同的酪胺-熒光團(tuán)偶聯(lián)物進(jìn)行染色，直至染色完成。本研究mIHC 的Ⅰ抗配色方案為CD69 配620熒光染料、CD4 配690 熒光染料、Foxp3 配570 熒光染料和CD8 配520 熒光染料。最后滴加DAPI 染色液染細(xì)胞核，在濕盒中室溫孵育5 min，超純水漂洗后中性樹(shù)膠封片，使用Vectra Polaris 全自動(dòng)定量病理成像系統(tǒng)掃描。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用FlowJo 10 軟件和t-SNE 算法分析多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)；利用AperioImageScope 12.4.0 軟件和Phenochart 1.0.12 軟件進(jìn)行IHC 圖像分析；利用GraphPad Prism 8.0.1 軟 件、SPSS 25.0 軟 件 和R 3.5.3軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間差異分析采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 患者臨床資料和正常腸系膜組織的位置

本研究共納入26例2018年10月～2020年9月在廣州市第一人民醫(yī)院結(jié)直腸肛門(mén)外科接受手術(shù)的CRC 患者，其中14 例為男性（53.80%），12 例為女性（46.20%）；平均年齡為61.92歲，其中55歲以下的有5 例（19.20%），55 歲及以上的有21 例（80.80%）；身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）及血液指標(biāo)如白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞絕對(duì)值、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、白蛋白、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）如表2 所示。收集的NM 位于左半結(jié)腸的有15 例（57.70%），位于右半結(jié)腸的有11例（42.30%），見(jiàn)表2。

表2 患者的臨床資料及正常腸系膜組織的位置Table 2. Clinical data of patients and the location of the normal mesentery（NM）

2 腸系膜免疫細(xì)胞以T細(xì)胞為主

首先對(duì)腸系膜進(jìn)行IHC 染色和mIHC 染色，結(jié)果顯示腸系膜脂肪細(xì)胞之間散在分布了CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、B 細(xì)胞（CD19+）、CD4+CD69+T 細(xì)胞、CD8+CD69+T 細(xì)胞和Treg 細(xì)胞（CD4+Foxp3+），見(jiàn)圖1。接著我們根據(jù)細(xì)胞表面分子包括CD3、CD56、CD161、TCRVα7.2 和CD19 的表達(dá)對(duì)PBMCs 和NM的CD45+MNCs 進(jìn)行t-SNE 降維分析并界定出6 個(gè)免疫細(xì)胞群，包括B 細(xì)胞（CD19+）、黏膜相關(guān)恒定T（MAIT）細(xì)胞（CD3+TCRVα7.2+CD161+）、NK 細(xì)胞（CD3-CD56+）、T細(xì)胞（CD3+CD56-）、CD3+CD56+細(xì)胞和其他細(xì)胞（單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等），見(jiàn)圖2A 及 圖3A、B。從PBMCs 和NM 中的CD45+MNCs 的t-SNE 降維圖可以看出二者的B 細(xì)胞、T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞和CD3+CD56+細(xì)胞的組成和分布存在差異，見(jiàn)圖3A。同時(shí)，根據(jù)圖2A所示CD45+MNCs的畫(huà)門(mén)策略對(duì)流式數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示NM 中B 細(xì)胞、MAIT 細(xì)胞、CD3+CD56+細(xì)胞、NK 細(xì)胞、T 細(xì)胞和其他細(xì)胞（包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等）分別約占CD45+MNCs 的9.96%、2.42%、4.79%、5.12%、58.65%和18.01%，即NM 中的免疫細(xì)胞以T細(xì)胞為主，見(jiàn)圖3C。與PBMCs 相比，NM 中的NK 細(xì)胞的比例顯著降低（P＜0.01），而T 細(xì)胞的比例顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)圖3C。

Figure 1. Scattered distribution of T cells and B cells in the mesentery. A：scattered distribution of CD4+ T cells（red arrows）in the mesentery；B：scattered distribution of CD8+ T cells（red arrows）in the mesentery；C：scattered distribution of B cells（CD19+；red arrows）in the mesentery；D：mIHC showed the expression of CD4（red），CD8（green），F(xiàn)oxp3（white）and CD69（yellow）in the mesentery［DAPI（blue）indicated the nuclei］，and CD4+T cells，CD4+CD69+T cells，CD8+cells，CD8+CD69+T cells and Treg cells（CD4+Foxp3+）were scattered in the mesentery.圖1 腸系膜內(nèi)散在分布著T細(xì)胞和B細(xì)胞亞群

Figure 2. Gating strategy of CD45+MNC subsets，T-cell subsets and B-cell subsets. A：gating strategy of CD45+MNC subsets and Tcell subsets；B：gating strategy of B-cell subsets.圖2 CD45+MNCs、T細(xì)胞和B細(xì)胞亞群的畫(huà)門(mén)策略

Figure 3. Immune cells in the mesentery were mainly T cells. A：t-SNE plot of CD45+ MNCs in the PBMCs and NM with main subsets indicated；B：feature plot of CD45+ MNC markers；C：percentages of CD45+ MNC subsets in the PBMCs（n=13）and NM（n=26）. Mean±SD.**P＜0.01 vs PBMCs.圖3 腸系膜免疫細(xì)胞以T細(xì)胞為主

3 腸系膜中浸潤(rùn)高比例的記憶T 細(xì)胞和組織駐留記憶T（tissue-resident memory T，TRM）細(xì)胞

根 據(jù) CD4、CD8、CD25、CD127、CD45RA、CD45RO、CD69 和CD103 等特定T 細(xì)胞表面分子對(duì)PBMCs和NM 的T細(xì)胞作進(jìn)一步降維及細(xì)分亞群，鑒定出包括記憶CD4+T 細(xì)胞（CD4+CD45RO+）、幼稚CD4+T 細(xì)胞（CD4+CD45RA+）、記憶CD8+T 細(xì)胞（CD8+CD45RO+）、幼稚CD8+T細(xì)胞（CD8+CD45RA+）、雙陰性（DN）細(xì)胞（CD4-CD8-）、Treg 細(xì)胞（CD4+CD25+CD127-）、CD4+TRM 細(xì) 胞（CD4+CD45RO+CD69+）和CD8+TRM 細(xì)胞（CD8+CD45RO+CD69+）等不同的T 細(xì)胞亞群，見(jiàn)圖4A、B。結(jié)果顯示CD69 在PBMCs 中的T 細(xì)胞幾乎不表達(dá)，而在NM 的T 細(xì)胞中有著顯著表達(dá)，即NM 存在大量CD4+TRM 細(xì)胞和CD8+TRM 細(xì)胞，見(jiàn)圖4A。此外，根據(jù)圖2A 所示T 細(xì)胞亞群的畫(huà)門(mén)策略對(duì)流式數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明NM 中的CD4+T 細(xì)胞與CD8+T 細(xì)胞的比值約為2.26；Treg細(xì)胞、記憶CD4+T細(xì)胞、記憶CD8+T細(xì)胞、CD4+TRM 細(xì)胞和CD8+TRM 細(xì)胞分別約占CD4+T 細(xì)胞 或CD8+T 細(xì) 胞 的10.71%、80.26%、61.90%、58.27%和51.36%，見(jiàn)圖4C～F。與PBMCs 相比，NM的記憶CD4+T 細(xì)胞（P＜0.01）、記憶CD8+T 細(xì)胞（P＜0.01）、CD4+TRM 細(xì)胞（P＜0.01）和CD8+TRM 細(xì)胞（P＜0.01）的比例顯著升高，見(jiàn)圖4E、F。

Figure 4. Higher percentages of memory T cells and tissue-resident memory T（TRM）cells were infiltrated in the mesentery. A：t-SNE plot of T cells in the PBMCs and NM with main subsets indicated；B：feature plot of T-cell markers；C：CD4/CD8 ratio in the PBMCs（n=11）and NM（n=23）；D：percentage of Treg cells in the PBMCs（n=8）and NM（n=15）；E：percentages of memory CD4+ T cells and memory CD8+ T cells in the PBMCs（n=13）and NM（n=22）；F：percentages of CD4+TRM cells and CD8+TRM cellsin the PBMCs（n=12）and NM（n=18）. Mean±SD.**P＜0.01 vs PBMCs.圖4 腸系膜中浸潤(rùn)高比例的記憶T細(xì)胞和組織駐留記憶T細(xì)胞

4 腸系膜中漿母細(xì)胞和記憶B細(xì)胞浸潤(rùn)增加

根據(jù)CD38、IgD、IgM、IgA 和IgG 等特定B 細(xì)胞表面分子對(duì)B 細(xì)胞進(jìn)行降維分析，將B 細(xì)胞分成5 個(gè)亞群，包括漿母細(xì)胞（CD38+IgD-）、IgM+和IgM-未轉(zhuǎn)化的B 細(xì)胞（CD38-IgD+）及IgA+和IgG+記憶B 細(xì)胞（CD38-IgD-），見(jiàn)圖5A、B。降維圖顯示PBMCs和NM之間表達(dá)IgA 或IgG 的記憶B 細(xì)胞的組成和分布存在差異，見(jiàn)圖5A。根據(jù)圖2B 的B 細(xì)胞亞群畫(huà)門(mén)策略對(duì)流式數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示NM 中漿母細(xì)胞、記憶B 細(xì)胞、未轉(zhuǎn)化B 細(xì)胞、IgA+記憶B 細(xì)胞、IgG+記憶B 細(xì)胞和IgM+未轉(zhuǎn)化B 細(xì)胞分別約占B 細(xì)胞的24.93%、31.99%、35.60%、12.83%、13.72% 和32.31%，見(jiàn)圖5C、D。與PBMCs 相比，NM 的漿母細(xì)胞（P＜0.05）、記憶B 細(xì)胞（P＜0.01）和IgA+記憶B 細(xì)胞（P＜0.05）的比例顯著升高，而IgM+未轉(zhuǎn)化B 細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖5C、D。

Figure 5. Higher percentages of plasmablasts and memory B cells were infiltrated in the mesentery. A：t-SNE plot of B cells in the PBMCs and NM with main subsets indicated；B：feature plot of B-cell markers；C：percentages of plasmablasts，memory B cells and unswitched B cells in the PBMCs（n=5）and NM（n=14）；D：percentages of IgA+ memory B cells，IgG+ memory B cells and IgM+unswitched B cells in the PBMCs（n=5）and NM（n=13）. Mean±SD.*P＜0.05，**P＜0.01 vs PBMCs.圖5 腸系膜中漿母細(xì)胞和記憶B細(xì)胞浸潤(rùn)增加

5 性別、年齡、血脂和腸系膜位置影響腸系膜T 細(xì)胞和B細(xì)胞亞群的組成

相比于男性，女性腸系膜B 細(xì)胞的比例更高（P＜0.01），而記憶CD8+T 細(xì)胞的比例更低（P＜0.05），見(jiàn)圖6A、B。年齡也會(huì)影響腸系膜T細(xì)胞和B細(xì)胞的組成，其中55 歲及以上患者腸系膜中有更高比例的CD8+TRM 細(xì)胞（P＜0.05）和CD8+CD103-TRM 細(xì)胞（P＜0.01），見(jiàn)圖6C；同時(shí)年齡與腸系膜CD8+TRM 細(xì)胞、CD8+CD103-TRM 細(xì)胞和漿母細(xì)胞比例呈正相關(guān)，與腸系膜未轉(zhuǎn)化B 細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)圖6D～H。此外，血脂也會(huì)影響腸系膜T 細(xì)胞和B細(xì)胞的組成，血TC 和LDL-C 的含量均與腸系膜記憶CD8+T 細(xì)胞（P＜0.05）、CD4+TRM 細(xì)胞（P＜0.01）、CD4+CD103-TRM 細(xì)胞（P＜0.01）、CD8+TRM 細(xì)胞（P＜0.05）和CD8+CD103-TRM 細(xì)胞（P＜0.05）比例呈正相關(guān)，見(jiàn)圖7A～J；血HDL-C含量與腸系膜IgA+記憶B 細(xì)胞比例呈正相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)圖7K?；颊叩难猅G 含量、血白蛋白含量和BMI 與腸系膜淋巴細(xì)胞亞群均無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）。以脾曲為界劃分右半結(jié)腸和左半結(jié)腸，結(jié)果顯示左半結(jié)腸腸系膜與右半結(jié)腸腸系膜的T細(xì)胞和B細(xì)胞亞群組成存在差異，右半結(jié)腸腸系膜的CD4+T 細(xì)胞與CD8+T 細(xì)胞比值（P＜0.01）和CD8+CD103+TRM 細(xì)胞（P＜0.05）比例更高，見(jiàn)圖6I～K。

Figure 6. Sex，age and location of the mesentery affect the composition of mesenteric T-cell and B-cell subsets. A：percentage of mesenteric B cells in males（n=12）and females（n=9）；B：percentage of mesenteric memory CD8+ T cells in males（n=11）and females（n=11）；C：percentages of mesenteric CD8+ TRM cells and CD8+ CD103- TRM cells in the patients ＜50 years old（n=4）and ≥50 years old（n=14）；D，E and F：correlations between age and the percentages of mesenteric CD8+TRM cells，CD8+ CD103- TRM cells and Treg cells（n=18）；G and H：correlations between age and the percentages of plasmablasts and unswitched B cells（n=14）；I：CD4/CD8 ratio in the left hemicolon（n=11）and right hemicolon（n=7）；J：percentage of mesenteric CD8+ CD103+ TRM cells in the left hemicolon（n=10）and right hemicolon（n=5）；K：percentage of mesenteric plasmablasts in the left hemicolon（n=6）and right hemicolon（n=6）. Mean±SD.*P＜0.05，**P＜0.01 vs male；#P＜0.05，##P＜0.01 vs ＜50 years old；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs left hemicolon.圖6 性別、年齡和腸系膜位置影響腸系膜T細(xì)胞和B細(xì)胞亞群的組成

Figure 7. Blood lipids affected the composition of mesenteric T-cell and B-cell subsets. A to E：correlations between blood TG levels and the percentages of mesenteric memory CD8+ T cells，CD4+ TRM cells，CD4+ CD103- TRM cells，CD8+ TRM cells and CD8+CD103-TRM cells；F to J：correlations between blood LDL-C levels and the percentages of mesenteric memory CD8+T cells，CD4+TRM cells，CD4+CD103-TRM cells，CD8+TRM cells and CD8+CD103-TRM cells；K：correlation between blood HDL-C and the percentage of IgA+memory B cells. n=10 to 14.圖7 血脂影響腸系膜T細(xì)胞和B細(xì)胞亞群的組成

討 論

腸系膜近年來(lái)被認(rèn)為是一個(gè)獨(dú)立的器官，其組織學(xué)特征是表面的間皮細(xì)胞、結(jié)締組織間隔及大量脂肪細(xì)胞群［1］。腸系膜作為腸道血液及淋巴液的輸送途徑，在多種腹部及非腹部疾病的病理生理過(guò)程中具有重要作用，如CRC可以侵襲到鄰近的腸系膜，發(fā)生腸系膜轉(zhuǎn)移的CRC 患者往往累積生存率較差［16-17］，而且研究表明腸系膜是一個(gè)潛在的腫瘤殘留部位，可導(dǎo)致CRC 的術(shù)后復(fù)發(fā)［18-20］。此外，許多腹腔內(nèi)腫瘤，如卵巢癌［5］、子宮內(nèi)膜癌［6］、胃癌［7］和胰腺癌［8］等傾向轉(zhuǎn)移腹膜，發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移的患者疾病進(jìn)展快、預(yù)后差。腸系膜是內(nèi)臟脂肪的最大貢獻(xiàn)者［13］，多個(gè)研究也顯示脂肪組織尤其內(nèi)臟肥胖顯著促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［9-10］。然而，腸系膜的免疫微環(huán)境尚不清楚。在本研究中，我們首次證實(shí)了腸系膜中存在與外周血不同的特定免疫微環(huán)境，其內(nèi)的免疫細(xì)胞主要由淋巴譜系組成，以T 細(xì)胞為主。與PBMCs 相比，腸系膜中顯著浸潤(rùn)更高比例的記憶T 細(xì)胞、TRM 細(xì)胞、漿母細(xì)胞和記憶B 細(xì)胞。此外，性別、年齡、血脂和腸系膜位置可影響腸系膜T細(xì)胞和B細(xì)胞亞群的組成。總的來(lái)說(shuō)，本研究揭示了腸系膜中淋巴細(xì)胞亞群的組成與表型及其影響因素，為探討腸系膜在多種疾病中的作用提供了參考資料。

根據(jù)行使免疫功能的不同，淋巴細(xì)胞亞群可分為效應(yīng)細(xì)胞、調(diào)節(jié)細(xì)胞和記憶細(xì)胞。目前研究最多的調(diào)節(jié)細(xì)胞是Treg 細(xì)胞，它具有免疫應(yīng)答低下和免疫抑制兩大特征，可通過(guò)細(xì)胞接觸或分泌抑制性細(xì)胞因子作用于抗原提呈細(xì)胞或效應(yīng)T 細(xì)胞，發(fā)揮免疫負(fù)向調(diào)節(jié)的作用［21］。記憶T 細(xì)胞由記憶CD4+T 細(xì)胞和記憶CD8+T 細(xì)胞組成，各自又可分成效應(yīng)性記憶T（effector memory T，TEM）細(xì)胞、中樞性記憶T（central memory T，TCM）細(xì)胞和TRM 細(xì)胞。其中TEM 細(xì)胞承擔(dān)保護(hù)性記憶形式速發(fā)型效應(yīng)功能；TCM 細(xì)胞負(fù)責(zé)反應(yīng)性記憶，在抗原再次刺激時(shí)重新分化為效應(yīng)細(xì)胞，如CD4+輔助性T（T helper，Th）細(xì)胞、CD8+細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic T-lymphocytes，CTLs）等［22］。其中CD4+Th 細(xì)胞主要通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子在腫瘤免疫、自身免疫等發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［23］；而CD8+CTLs 是免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)細(xì)胞，可以特異性結(jié)合靶細(xì)胞并釋放顆粒酶和穿孔素使其裂解和分泌TNF-α、IFN-γ 和IL-2 等協(xié)同殺傷靶細(xì)胞，在腫瘤免疫和抗病毒免疫中發(fā)揮重要作用［24-25］。CD69 的表達(dá)意味著T 細(xì)胞的早期活化及其在組織中的駐留［26-27］，TRM 細(xì)胞表現(xiàn)為上調(diào)CD69 的表達(dá)從而維持在組織中的駐留及其細(xì)胞毒性特征［28-30］。TRM 細(xì)胞在成年人中數(shù)量居所有記憶T 細(xì)胞之首，定居于與外周非淋巴組織，是在應(yīng)答第一線(xiàn)發(fā)揮作用的記憶細(xì)胞［28-30］。CD8+CD69+T 細(xì)胞已經(jīng)被證明具有更高的細(xì)胞毒性［31］。此外，B細(xì)胞是體液免疫中最主要的免疫細(xì)胞，同時(shí)B 細(xì)胞還可以誘導(dǎo)性表達(dá)參與提呈抗原的MHC II 類(lèi)分子和共刺激分子，具有攝取、加工和提呈抗原，協(xié)助啟動(dòng)T 細(xì)胞應(yīng)答的功能。B 細(xì)胞同時(shí)還能分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答［32］。根據(jù)CD38 和IgD 的表達(dá)，B 細(xì)胞可以分為漿母細(xì)胞（CD38+IgD-）、未轉(zhuǎn)化的B 細(xì)胞（CD38-IgD+）和記憶B 細(xì)胞（CD38-IgD-）［33］。B 細(xì)胞接受抗原刺激之后可分化為體積較大的漿母細(xì)胞，而后進(jìn)一步分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中有大量糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，能合成和分泌特異性抗體，介導(dǎo)體液免疫。而記憶B細(xì)胞在再次遇到抗原刺激時(shí)，記憶B細(xì)胞可再次分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生記憶性應(yīng)答。此外，在抗原的刺激下，B 細(xì)胞可以發(fā)生類(lèi)別轉(zhuǎn)換重組，從初始表達(dá)膜結(jié)合IgM 和IgD到表達(dá)膜結(jié)合的IgG、IgA或IgE［34］。我們的研究結(jié)果顯示腸系膜免疫細(xì)胞主要由淋巴譜系組成，以T 細(xì)胞為主，與外周血相比，腸系膜中顯著浸潤(rùn)更高比例的T 細(xì)胞（P＜0.01）、記憶T 細(xì)胞（P＜0.01）、TRM 細(xì)胞（P＜0.01）、漿母細(xì)胞（P＜0.05）和記憶B 細(xì)胞（P＜0.01），即腸系膜除了作為腸道的支撐結(jié)構(gòu)，其內(nèi)也浸潤(rùn)多種淋巴細(xì)胞亞群，表明腸系膜一定程度上在抗感染免疫、自身免疫和腫瘤免疫中能發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞毒性等免疫功能。

此外，我們的數(shù)據(jù)表明性別、年齡、血脂和腸系膜位置影響腸系膜T細(xì)胞和B細(xì)胞亞群的組成，其中女性腸系膜B 細(xì)胞的比例更高（P＜0.01），記憶CD8+T 細(xì)胞的比例更低（P＜0.05），不同性別的免疫差異可能是性染色體、基因、激素和環(huán)境等共同影響的結(jié)果［35-37］。我們還觀(guān)察到年齡越大的患者的腸系膜CD8+TRM 細(xì)胞和CD8+CD103-TRM 細(xì)胞的比例更高（P＜0.05），這可能是由于機(jī)體衰老伴隨著免疫功能降低，機(jī)體長(zhǎng)期暴露在抗原（包括腫瘤抗原、病原體或自身抗原）下，導(dǎo)致初始細(xì)胞向記憶細(xì)胞分化［38］。已有文獻(xiàn)報(bào)道，多種脂質(zhì)參與調(diào)節(jié)許多生理活動(dòng)，如能量?jī)?chǔ)存、細(xì)胞凋亡和信號(hào)傳導(dǎo)等，膽固醇和LDL-C 等脂質(zhì)在調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增殖、分化、激活及分泌細(xì)胞因子能力中發(fā)揮重要作用［39-40］。我們的研究結(jié)果顯示，血TC 和LDL-C 含量均與腸系膜記憶CD8+T 細(xì)胞（P＜0.05）、CD4+TRM 細(xì)胞（P＜0.01）、CD4+CD103-TRM 細(xì)胞（P＜0.01）、CD8+TRM 細(xì)胞（P＜0.05）和CD8+CD103-TRM 細(xì)胞（P＜0.05）比例呈正相關(guān)，HDL-C含量與腸系膜IgA+記憶B細(xì)胞比例呈正相關(guān)（P＜0.05），表明TC 和LDL-C 等血脂的增加可能促進(jìn)腸系膜T 細(xì)胞向記憶T 細(xì)胞和TRM 細(xì)胞分化。此外，臨床上常以脾曲為界將結(jié)腸劃分為右半結(jié)腸和左半結(jié)腸；它們的胚胎起源也不同，右半結(jié)腸起源于胚胎的中原腸，而左半結(jié)腸則是起源于后原腸［41］；左右半結(jié)腸疾病如結(jié)腸癌等在臨床表現(xiàn)、病理分型、免疫環(huán)境、分子生物學(xué)特征及預(yù)后等方面均存在差異［42］。我們的研究結(jié)果顯示，左半結(jié)腸腸系膜與右半結(jié)腸腸系膜的T 細(xì)胞和B 細(xì)胞亞群組成也同樣存在差異，即右半結(jié)腸腸系膜CD4+T 細(xì)胞與CD8+T 細(xì)胞的比值（P＜0.01）和CD8+CD103+TRM 細(xì)胞的比例（P＜0.05）更高，表明不同位置的腸系膜在疾病中的作用可能存在差異。

綜上所述，我們揭示了腸系膜中存在與外周血不同的特定免疫微環(huán)境，并描繪了腸系膜的淋巴細(xì)胞圖譜，這些細(xì)胞在一定程度上能發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞毒性等免疫功能，同時(shí)性別、年齡、血脂和腸系膜位置影響腸系膜淋巴細(xì)胞的組成和表型。