謝春燕， 謝 剛， 季語竹

（綿陽市中心醫(yī)院病理科，四川綿陽 621000）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種由宿主腸道微生物區(qū)系免疫反應失衡引起的結(jié)腸慢性炎癥性疾病，嚴重威脅患者身心健康［1］。UC 的病理特征是黏膜和黏膜下層炎癥和潰瘍性病變［2］。目前認為，UC 的發(fā)病機制主要與個人遺傳易感性、免疫功能障礙、腸上皮細胞完整性受損和腸道菌群改變有關(guān)［3］。由于病因病機不明，臨床治療UC 較為困難。雖然氨基水楊酸、類固醇、免疫抑制劑和生物制劑可以緩解UC，但它們也有許多副作用［4］，因此，尋找更可靠、更有效的藥物顯得尤為迫切。柚皮素（naringenin）是一種食品添加劑，從葡萄柚、酸橙和柑橘類種子中提取。研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素具有抗炎和抗氧化等多種生物活性［5］。Cao 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷可通過抑制核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎性小體的激活，發(fā)揮對UC 小鼠的治療作用。NLRP3在宿主抗炎和免疫應答的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用。另外，經(jīng)生物信息學預測發(fā)現(xiàn)，NLRP3 的3′-UTR 中 具 有 微 小RNA-22（microRNA-22，miR-22）的結(jié)合位點。因此，本研究中擬通過葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）誘導大鼠，構(gòu)建UC 模型，探究柚皮素調(diào)控miR-22/NLRP3 信號通路對UC大鼠腸屏障的保護作用。

材 料 和 方 法

1 動物

SD 雄性大鼠，8 周齡，體質(zhì)量200～220 g，購自西南醫(yī)科大學，許可證號為SCXK（川）2018-17。在整個飼養(yǎng)和研究期間，所有動物都可以隨意獲得食物和水，溫度（21±2）℃，相對濕度為（45±10）%并保持12 h 的光/暗周期。所有實驗均按照《實驗動物管理及使用指南》進行，并經(jīng)動物倫理委員會批準。

2 主要試劑

大鼠小腸隱窩上皮IEC-6 細胞購自中國農(nóng)業(yè)大學。柚皮素（純度≥98%）購自北京索萊寶生物科技有限公司；白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）測試盒購自南京建成生物工程研究所；引物由上海生工生物工程有限公司合成；總RNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑和TB Green 熒光試劑均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；抗ZO-1、occludin、claudin-1和NLRP3抗體均購自Abcam。

3 主要儀器

H-7650 透射電子顯微鏡購自HITACHI；實時熒光定量PCR 儀和多功能酶標儀購自Thermo Fisher Scientific；化學發(fā)光成像儀購自GE Healthcare；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀購自Bio-Rad；光學顯微鏡購自Leica。

4 主要方法

4.1 動物分組及模型制備 參考Liu 等［7］方法，使用DSS 誘導UC 大鼠模型，先用5% DSS 溶液灌胃5 d，再改用自來水飲水10 d，整個過程重復3 次，建立UC 大鼠模型。每天觀察大鼠一般情況，體重，糞便性狀、潛血或血性情況。死亡大鼠被排除在本研究之外。對照組大鼠只飲用自來水。

4.2 動物分組及給藥 造模成功后，將UC 大鼠分成模型（model）組、低劑量柚皮素（low-dose naringenin）組、高劑量柚皮素（high-dose naringenin）組和柚皮素+miR-22 antagomiR 組，每組10只。另取10只大鼠做對照組處理。低、高劑量柚皮素組大鼠分別以25 和100 mg/kg 劑量腹腔注射［6］，每天1 次。柚皮素+miR-22 antagomiR 組大鼠在給予100 mg/kg 柚皮素腹腔注射的基礎(chǔ)上，再尾靜脈注射5 mL/kg miR-22 antagomiR，每周2 次。對照組和模型組灌胃并尾靜脈注射等量生理鹽水，連續(xù)4周。

4.3 疾病活動性指數(shù)（disease activity index，DAI）評估 觀察大鼠體重變化、糞便稠度以及糞便和肛門的血液。DAI 根據(jù)大便稠度、糞便血液和體重下降率3 個參數(shù)得分之和進行評分。（1）體重下降率：0分，0；1 分，1%～5%；2 分，5%～10%；3 分，10%～20%；4分：≥20%。（2）大便稠度：0分，形狀良好；1分，柔軟但仍在形成的小球；2 分，非常軟；3 分，腹瀉。（3）糞血：0分，無血；1分，陽性血塊；2分，大便可見血跡；3分，大便大出血［8］。

4.4 樣本采集 實驗結(jié)束后，將大鼠麻醉采血，離心取上清，置于-20 ℃中保存?zhèn)溆?。然后通過頸椎脫位處死大鼠，收集大鼠腸組織，然后將大鼠部分腸組織固定在10%中性福爾馬林溶液中，另一部分腸組織置于冰塊上，去除腸系膜和脂肪組織，并沿腸系膜一側(cè)進行縱向解剖。根據(jù)Yuan 等［9］描述的評分系統(tǒng)，用肉眼評分對腸黏膜損傷進行量化。評分標準如下：0 分，正常腸黏膜；1 分，黏膜充血無潰瘍病變和出血；2 分，散發(fā)性黏膜潰瘍或輕度出血；3 分，廣泛潰瘍壞死或腸黏膜粘連并出血；4分，嚴重出血，巨結(jié)腸狹窄或穿孔。記分結(jié)束后，用pH 7.4 的PBS 沖洗腸道內(nèi)容物，并用濾紙吸干水分。然后用液氮速凍腸組織，并將其保存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

4.5 血清炎癥因子含量的檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）對血清中促炎癥因子IL-1β 水平進行檢測。

4.6 組織病理學觀察 將10%中性福爾馬林固定的腸組織，石蠟包埋，切成5 μm 厚切片。HE 染色后由光學顯微鏡觀察病理變化。用組織病理學評分來量化腸損傷程度，包括腸上皮細胞損傷程度和炎癥浸潤程度。評分標準概括為：0 分，形態(tài)正常，無炎癥；1 分，杯狀細胞丟失，輕度炎癥浸潤；2 分，杯狀細胞大面積丟失，中度炎癥浸潤；3 分，腺泡丟失，黏膜肌層廣泛炎癥浸潤，黏膜水腫增厚；4分，腺泡大面積丟失，黏膜下層廣泛炎癥浸潤［10］。

4.7 透射電子顯微鏡觀察腸上皮細胞 透射電鏡觀察腸上皮細胞間的緊密連接（tight junctions，TJs）特征。取1 cm 大小的結(jié)腸組織切片，用3%戊二醛固定，然后用0.1 mmol/L PBS 沖洗3 次。然后再用1%鋨酸溶液固定后，丙酮分級脫水，然后包埋，切成50 nm 的超薄切片，使用醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛染色。將處理好切片在透射電子顯微鏡上進行觀察。

4.8 RT-qPCR 檢測腸組織中miR-22 水平 利用Trizol 試劑從腸組織勻漿中提取總RNA。NanoDrop分光光度計測定RNA 的濃度和純度，并使用Prime-Script RT 試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，45 個循環(huán)。以U6 為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法對組織中miR-22 表達水平進行相對定量分析。根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫中基因序列的公開數(shù)據(jù)，設(shè)計引物，序列見表1。

4.9 Western blot 法檢測腸組織中蛋白的表達水平 將保存在-80 ℃的腸組織研磨勻漿，提取總蛋白，并檢測蛋白質(zhì)濃度。使用SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)樣品，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h，然后將膜上的蛋白質(zhì)與抗ZO-1、occludin、claudin-1 和NLRP3 抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜。在室溫下與Ⅱ抗孵育1 h，TBST 洗膜。ECL 發(fā)光液顯色，使用化學發(fā)光成像儀分析蛋白質(zhì)相對表達量，以β-actin為內(nèi)參照。

4.10 螢光素酶報告基因?qū)嶒?利用microRNA.org預測miR-22 與NLRP3 的靶向結(jié)合位點。從含有miR-22 編碼區(qū)的NLRP3 3′-UTR 啟動子區(qū)域擴增序列，構(gòu)建NLRP3-3′-UTR-WT 質(zhì)粒。然后根據(jù)質(zhì)粒分離試劑盒中的說明，突變結(jié)合位點以構(gòu)建NLRP3 3′-UTR-MUT 質(zhì)粒。將對數(shù)生長期的IEC-6 細胞接種到96 孔板中，直到細胞達到70%融合為止。然后，用Lipofectamine 2000 試劑盒轉(zhuǎn)染細胞。將NLRP3-3′-UTR-WT 質(zhì)粒與miR-22 模擬物（mimics）充分混合共轉(zhuǎn)染到IEC-6 細胞中。同時將NLRP3-3′-UTR-WT+miR-22 NC（對照組）、NLRP3-3′-UTR-MUT+miR-22 NC 和NLRP3-3′-UTR-MUT+miR-22 mimics 分別轉(zhuǎn)染IEC-6細胞。孵育6 h后，將IEC-6細胞與10%胎牛血清一起培養(yǎng)48 h，使用雙螢光素酶試劑盒檢測螢光素酶活性。

5 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)分析均使用SPSS 22.0 軟件進行。統(tǒng)計數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。單因素方差分析用于多組間比較，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 UC大鼠腸組織中miR-22表達水平

與對照組相比，模型組大鼠miR-22 水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，低、高劑量柚皮素組大鼠的miR-22 水平顯著升高（P＜0.05）；與高劑量柚皮素組相比，柚皮素+miR-22 antagomiR 組大鼠的miR-22水平顯著降低（P＜0.05），見圖1。

2 柚皮素對UC 大鼠DAI 和腸黏膜損傷肉眼評分的影響

與對照組相比，模型組大鼠DAI 和腸黏膜損傷肉眼評分顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，低、高劑量柚皮素組大鼠DAI 和腸黏膜損傷肉眼評分顯著降低（P＜0.05）；與高劑量柚皮素組相比，柚皮素+miR-22 antagomiR 組大鼠DAI 和腸黏膜損傷肉眼評分顯著升高（P＜0.05），見表2。

3 柚皮素對UC大鼠血清中炎癥因子水平的影響

與對照組相比，模型組大鼠血清中IL-1β 的水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，低、高劑量柚皮素組大鼠血清中IL-1β的水平顯著降低（P＜0.05）；與高劑量柚皮素組相比，柚皮素+miR-22 antagomiR 組大 鼠 血 清 中IL-1β 的 水 平 顯 著 升 高（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠DAI、腸黏膜損傷肉眼評分和血清中IL-1β水平的比較Table 2. Comparison of disease activity index（DAI），intestinal mucosal injury naked-eye score and the serum levels of IL-1β of the rats in each group（Mean±SD. n=10）

4 柚皮素對UC大鼠腸組織病理變化的影響

對照組大鼠腸組織結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠腸組織黏膜結(jié)構(gòu)破壞嚴重，隱窩廣泛缺失，黏膜及黏膜下層有出血、水腫及大量炎癥細胞浸潤；低、高劑量柚皮素組大鼠腸組織結(jié)構(gòu)清晰可見，黏膜和黏膜下層有輕度或中度炎癥細胞浸潤和水腫，較模型組明顯減輕；柚皮素+miR-22 antagomiR 組大鼠腸組織較高劑量柚皮素組大鼠腸組織損傷明顯嚴重，炎癥細胞浸潤增加。

與對照組相比，模型組大鼠腸組織病理學評分明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，低、高劑量柚皮素組大鼠腸組織病理學評分顯著降低（P＜0.05）；與高劑量柚皮素組相比，柚皮素+miR-22 antagomiR 組大鼠腸組織病理學評分顯著升高（P＜0.05），見圖2。

Figure 2. The histopathological changes（×200）and histological scores of rat intestine tissues in each group. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs high-dose naringenin group.圖2 各組大鼠腸組織病理學變化及組織學評分的比較

5 柚皮素對UC大鼠腸上皮細胞TJs的影響

對照組腸上皮細胞與橋粒之間的接觸結(jié)構(gòu)清晰，提示腸黏膜屏障完整；模型組腸黏膜屏障受損，橋粒消失，細胞間隙增寬；與模型組相比，柚皮素給藥可減輕腸上皮TJs 損傷；與高劑量柚皮素組相比，柚皮素+miR-22 antagomiR 組腸上皮TJs 損傷嚴重，見圖3。

Figure 3. The effect of naringenin on tight junctions of intestinal epithelial cells in UC rats was observed under transmission electron microscope. →：tight junctions. A：control group；B：model group；C：low-dose naringenin group；D：high-dose naringenin group；E：naringenin+miR-22 antigomiR group.圖3 透射電鏡觀察柚皮素對UC大鼠腸上皮細胞緊密連接的影響

6 柚皮素對UC 大鼠腸組織TJs 蛋白表達水平的影響

與對照組相比，模型組大鼠腸組織ZO-1、occludin和claudin-1的蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，低、高劑量柚皮素組大鼠腸組織ZO-1、occludin和claudin-1的蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與高劑量柚皮素組相比，柚皮素+miR-22 antagomiR 組大鼠腸組織ZO-1、occludin 和claudin-1 的蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖4。

Figure 4. The expression of tight junction-related proteins in the intestinal tissue of UC rats. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs high-dose naringenin group.圖4 緊密連接相關(guān)蛋白在UC大鼠腸組織中的表達

7 柚皮素對UC 大鼠腸組織NLRP3 蛋白表達水平的影響

與對照組相比，模型組大鼠腸組織NLRP3 的蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，低、高劑量柚皮素組大鼠腸組織NLRP3的蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與高劑量柚皮素組相比，柚皮素+miR-22 antagomiR 組大鼠腸組織NLRP3 的蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖5。

Figure 5. The expression of NLRP3 protein in the intestinal tissue of UC rats. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs high-dose naringenin group.圖5 NLRP3蛋白在UC大鼠腸組織中的表達

8 miRNA-22與NLRP3靶向關(guān)系的預測與驗證

通過microRNA.org 數(shù)據(jù)庫分析得到，miR-22 與NLRP3 mRNA 序列之間存在互補（圖6）。miR-22 NC+NLRP3 WT 組的螢光素酶活性為1.03±0.09，miR-22 mimics+NLRP3 WT 組的螢光素酶活性為0.57±0.06、miR-22 NC+NLRP3 MUT 組的螢光素酶活性為1.05±0.12，miR-22 mimics+NLRP3 MUT 組的螢光素酶活性為1.16±0.10。與miR-22 NC+NLRP3 WT 組相比，miR-22 mimics+NLRP3 WT 組的螢光素酶活性顯著降低（P＜0.05），miR-22 mimics+NLRP3 MUT 組和miR-22 NC+NLRP3 MUT 組的螢光素酶活性無明顯變化（P＞0.05）。

Figure 6. Bioinformatic prediction of the binding sites between miR-22 and 3′-untranslated region（UTR）of NLRP3.圖6 生物信息學預測miR-22與NLRP3 3′-UTR的結(jié)合位點

討 論

UC 是一種以慢性復發(fā)性炎癥為特征的特發(fā)性炎癥性腸道疾病，是結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌的危險因素?，F(xiàn)有藥物療效有限，患者容易復發(fā)且疼痛難忍并需支付高昂的醫(yī)療費用。UC 患者表現(xiàn)出黏膜下水腫、潰瘍、血性腹瀉、粒細胞浸潤等特征［11］。由于DSS 誘導的實驗性UC 模型具有相似的臨床表現(xiàn)，被認為是最成功和最合適的UC 模型制備方法之一［12-13］。DAI 評分是評價UC 嚴重程度的主要參數(shù)。因此，本研究采用DSS 誘導大鼠UC 模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UC 大鼠DAI 評分升高，腸組織黏膜結(jié)構(gòu)破壞嚴重，黏膜及黏膜下層有出血、水腫及大量炎癥細胞浸潤，表明UC 大鼠模型構(gòu)建成功。柚皮素是一種黃酮類化合物，主要存在于柑橘類水果和西紅柿中。研究報道稱，柚皮素具有抗炎、抗氧化應激、抗菌、抗腫瘤、抗糖尿病、保護神經(jīng)和保護心臟等多種藥理作用［14］。研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素對DSS 誘導的小鼠腸水腫有一定的減輕作用。在本研究中，UC 大鼠經(jīng)柚皮素治療后，大鼠的DAI 評分顯著降低，且腸組織結(jié)構(gòu)損傷減輕，黏膜和黏膜下層僅有輕度或中度炎癥細胞浸潤。

UC 的發(fā)病機制尚不清楚，通常認為是多種因素共同作用的結(jié)果。其中，腸黏膜屏障功能在UC 的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［15-16］。腸黏膜屏障是抵御惡劣環(huán)境的第一道屏障，主要由上皮細胞的緊密連接形成。TJs 由跨膜蛋白（occludins 和claudins）和輔助蛋白（zonula occludens，ZO）組成，以防止病原體和有害抗原在上皮內(nèi)傳播［17］。ZOs、occludin和claudins可封閉相鄰腸上皮細胞之間的縫隙，并將抗原和微生物等物質(zhì)保留在腸腔內(nèi)，在維持腸道通透性、組織分化和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起著重要作用［18］。因此，調(diào)節(jié)TJs以保持UC 上皮屏障的完整性至關(guān)重要。Nakashima等［19］研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素和槲皮素等橘柑類黃酮可保障上皮細胞TJs 完整性。在本研究中，我們觀察到UC 大鼠腸黏膜屏障受損，橋粒消失，細胞間隙增寬，經(jīng)柚皮素治療后，腸上皮TJs 損傷明顯減輕，且腸組織ZO-1、occludin 和claudin-1 蛋白表達水平上調(diào)，表明柚皮素可促進TJs蛋白表達，從而維持腸黏膜屏障功能，減輕UC。

促炎細胞因子的產(chǎn)生是DSS 誘導結(jié)腸炎的一個標志，在這些細胞因子中，IL-1β 在腸道炎癥中起重要作用。在本研究中，柚皮素以劑量依賴的方式成功地抑制了UC 大鼠IL-1β 水平的上調(diào)。IL-1β 產(chǎn)生需要caspase-1 激活，caspase-1 依賴于激活的炎癥小體將IL-1β轉(zhuǎn)化為成熟的活性形式。因此，炎癥小體介導宿主對微生物病原體的防御，并促進炎癥性疾病和結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展［20］。NLRP3炎性小體是由核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs）、含胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）和胱天蛋白酶1（caspase-1）組成的多蛋白復合體［21］。NLRP3 是NLRP3 炎性小體的關(guān)鍵成分，其表達是NLRP3 炎癥小體激活的限速步驟。因此，它的表達必須受到嚴格的調(diào)控。我們發(fā)現(xiàn)，UC 大鼠腸組織NLRP3 蛋白水平升高，在柚皮素的作用下，NLRP3蛋白水平下降，表明柚皮素可抑制NLRP3炎癥小體的激活。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一種小的（18～24 個核苷酸）非編碼RNA，在動植物中發(fā)揮著重要調(diào)控作用，是多細胞生物體中含量較豐富的基因調(diào)控分子之一。miRNAs 與特定靶標mRNA 的3′-UTR 的互補序列結(jié)合，可以阻止蛋白質(zhì)合成。越來越多的證據(jù)表明miRNAs 在調(diào)節(jié)炎癥過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。我們研究發(fā)現(xiàn)，UC 大鼠腸組織中miR-22 水平顯著下調(diào)。另外，經(jīng)microRNA.org 數(shù)據(jù)庫分析顯示，miR-22 與NLRP3 具有靶向關(guān)系，miR-22 可負向調(diào)控NLRP3 炎癥小體活性。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-22 可通過抑制NLRP3 炎癥小體途徑，降低促炎細胞因子水平，保護冠狀動脈內(nèi)皮細胞［22］。在本研究中，與高劑量柚皮素組大鼠相比，miR-22 antagomiR 處理可明顯逆轉(zhuǎn)柚皮素對UC 大鼠的改善作用，促進NLRP3 蛋白表達，造成嚴重的腸屏障損傷。因此我們推測，柚皮素可通過上調(diào)miR-22 水平，抑制NLRP3 炎癥小體激活，減輕UC 大鼠炎癥反應。

綜上所述，柚皮素對DSS 誘導的腸上皮屏障功能障礙大鼠具有保護作用，其機制可能與miR-22 水平上調(diào)，抑制NLRP3 炎癥小體激活有關(guān)。本研究表明柚皮素可作為治療UC 的有效候選藥物，具有潛在的臨床應用價值。然而，充分了解柚皮素的治療作用還需進行全面的安全性評估，尚需進一步研究和探索。