陳旭青， 周龍?jiān)疲?史 軍， 吳繼勇， 嚴(yán)芮雯， 嚴(yán)道南， 馬華安△

（1南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻喉科，江蘇南京 210029；2南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)中心，江蘇南京 210029）

自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞是人體非特異免疫系統(tǒng)的組成部分，具有分泌系列細(xì)胞因子的潛能［1-2］，其所處微環(huán)境不同，細(xì)胞因子分泌不一，而發(fā)生NK1 或NK2 型活化［3］。研究表明，NK 細(xì)胞NK2 型活化釋放Th2型因子，協(xié)調(diào)T、B 細(xì)胞等介導(dǎo)Th2型反應(yīng)，與多種變應(yīng)性疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4-5］，但其異?；罨瘍?nèi)在機(jī)制及調(diào)節(jié)因素尚不明確。

線粒體是高度動(dòng)態(tài)的網(wǎng)管狀細(xì)胞器，通過頻繁地分裂、融合以維持內(nèi)部穩(wěn)態(tài)，其分裂/融合動(dòng)態(tài)失衡、結(jié)構(gòu)紊亂與多種細(xì)胞功能紊亂密切關(guān)聯(lián)［6］。近年研究顯示，線粒體動(dòng)態(tài)失衡、分裂亢進(jìn)與NK 細(xì)胞異?；罨芮邢嚓P(guān)［7-8］。線粒體分裂抑制劑1（mitochondrial division inhibitor-1，Mdivi-1）為特異性調(diào)控線粒體動(dòng)態(tài)變化的通用分子，對(duì)線粒體過度分裂觸發(fā)的T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞功能紊亂具有重要作用［9-10］?；诖耍狙芯繑M選取Mdivi-1 這一選擇性線粒體分裂抑制劑，探討調(diào)控線粒體動(dòng)態(tài)變化對(duì)NK細(xì)胞活化的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 主要儀器 Herocell 180 型CO2培養(yǎng)箱（Thermo）；ELx 800 型酶標(biāo)儀（BioTek）；ChemiDoc XRS 型化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀和CFX96 Touch 型實(shí)時(shí)定量PCR 儀（Bio-Rad）；Accuri C6 型流式細(xì)胞儀（BD）；DMI 3000B 型倒置熒光顯微鏡和SP8 型激光共聚焦顯微鏡（Leica）。

1.2 主要藥品與試劑 Mdivi-1（貨號(hào)M0199）購自Sigma-Aldrich；重組人胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP；貨號(hào)300-62）購自PeproTech；α-MEM 培養(yǎng)基、馬血清（horse serum，HS）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和巰基乙醇（貨號(hào)11900024、16050122、10100147 和614272）購自Gibico；肌醇、葉酸和PBS 粉末（貨號(hào)A600536、A610466 和B040100）購自生工生物工程股份有限公司；Trizol（貨號(hào)15596018）購自Thermo；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)RR036A）購自TaKaRa；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（貨號(hào)11203ES03）購自上海翊圣生物科技有限公司；線粒體超氧化物熒光探針（MitoSOX Red）試劑盒（貨號(hào)40778ES50）購自上海翊圣生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、30%丙烯酰胺溶液、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和BCA 蛋白定量試劑盒（貨號(hào)ST795、ST626、ST00、ST025 和P0012）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（貨號(hào)IPVH00010）購自Millipore；兔抗人干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）單克隆抗體、兔抗人p-JAK2 單克隆抗體、抗人JAK2 單克隆抗體、兔抗人p-STAT6 多克隆抗體、兔抗人STAT6 單克隆抗體和兔抗人β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）多克隆抗體（貨號(hào)ab133566、ab32101、ab108596、ab28829、ab32520 和ab8227）均購自Abcam；小鼠抗白介素4（interleukin-4，IL-4）單克隆抗體和抗人IL-5 多克隆抗體（貨號(hào)66142-1-Ig和26677-1-AP）購自Proteintech；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG 和HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（貨號(hào)C0038、A0208 和A0216）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為純化水或超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的NK細(xì)胞系NK-92MI（貨號(hào)GOY-ATCC-0016）購自上海谷研實(shí)業(yè)有限公司。以含12.5%FBS、12.5%HS、0.2 mmol/L 肌醇、0.1 mmol/L 巰基乙醇和0.02 mmol/L 葉酸的α-MEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 方法

2.1 細(xì)胞活力的測(cè)定 回收生長(zhǎng)良好的NK-92MI細(xì)胞，按每孔90 μL完全培養(yǎng)基，以每孔1×104細(xì)胞密度接種細(xì)胞于96 孔板中，分為對(duì)照組和Mdivi-1 組（終濃度為0.1、0.5、1、5、10、25、50 和100 μmol/L），并設(shè)置調(diào)零孔。Mdivi-1 組加入10 μL 含不同濃度Mdivi-1 的培養(yǎng)基，對(duì)照組加入含0.1% DMSO 的完全培養(yǎng)基。于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 試劑孵育1 h。450 nm 波長(zhǎng)下，酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔吸光度（A）值。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 NK-92MI 細(xì)胞分為空白組、TSLP組、1 μmol/L Mdivi-1 組、5 μmol/L Mdivi-1 組和10 μmol/L Mdivi-1 組。TSLP 組細(xì)胞以20 μg/L TSLP 刺激24 h，誘導(dǎo)NK 細(xì)胞的NK2 分化。Mdivi-1 組于20 μg/L TSLP 刺激下，同時(shí)聯(lián)合相應(yīng)濃度Mdivi-1 干預(yù)24 h。

2.3 RT-qPCR 回收干預(yù)后NK-92MI 細(xì)胞，以Trizol試劑分離各組樣本總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系：SYBR 熒光染料10 μL，正、反義引物各0.4 μL，cDNA 模板2 μL，無核酸酶水7.2 μL。正、反義引物序列見表1。反應(yīng)條件為：95°C 預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，57 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，39 個(gè)循環(huán)。以β-actin 為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法分析各樣本IL-4、IL-5和IFN-γ的mRNA表達(dá)水平。

表1 引物序列RT-gPCRTable 1. Primer sequences for RT-gPCR

2.4 Western blot 分析 回收細(xì)胞樣本，經(jīng)裂解、勻漿、靜置、離心后，獲取蛋白上清。BCA 法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整終濃度，高溫變性后-80 ℃凍存?zhèn)溆?。取蛋白樣品?jīng)SDS-PAGE并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%BSA的TBST 室溫封閉后，分別加入以1%BSA 稀釋的抗IL-4、IL-5、IFN-γ、p-JAK2、JAK2、p-STAT6、STAT6 和β-actin 抗體（稀釋比例均為1∶2 000），4 ℃孵育過夜。次日孵育HRP 標(biāo)記山羊抗兔或小鼠IgG。滴加ECL曝光液，以Bio-Rad 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀顯影，拍照保存。圖像以ImageJ 1.8.0軟件分析。

2.5 細(xì)胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）的檢測(cè) 離心收集處理后細(xì)胞，以含2 μmol/L MitoSOX Red 的α-MEM 培養(yǎng)基重懸，CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min。離心，PBS洗滌，棄上清。500 μL PBS重懸，Accuri C6流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.0.1 軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Mdivi-1對(duì)NK-92MI細(xì)胞活力的影響

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，50 μmol/L 及以內(nèi)Mdivi-1干預(yù)NK-92MI 細(xì)胞，其細(xì)胞活力無顯著下降。鑒于25 μmol/L Mdivi-1 干預(yù)后，細(xì)胞活力有一定下降傾向，我們納入1、5和10 μmol/L 濃度Mdivi-1進(jìn)行后續(xù)干預(yù)。見圖1。

Figure 1. Effects of Mdivi-1 at different concentrations on the viability of NK-92MI cells. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs 0 μmol/L group.圖1 不同濃度Mdivi-1對(duì)NK-92MI細(xì)胞活力的影響

2 Mdivi-1 對(duì)NK-92MI 細(xì) 胞IL-4、IL5 和IFN-γ mRNA和蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，TSLP組NK-92MI細(xì)胞IL-4和IL-5 的mRNA 表達(dá)顯著升高，IFN-γ 的mRNA 表達(dá)下降（P＜0.05）；與TSLP 組比較，5 和10 μmol/L Mdivi-1 組IL-4 和IL-5 的mRNA 表達(dá)降低，IFN-γ 的mRNA 表達(dá)則有所回升（P＜0.05）。Western blot 分析結(jié)果顯示，TSLP 刺激后，NK-92MI 細(xì)胞IL-4 和IL-5 的蛋白表達(dá)升高，而IFN-γ 的蛋白表達(dá)有所下調(diào)；Mdivi-1 干預(yù)后，一定程度上逆轉(zhuǎn)了TSLP刺激所誘導(dǎo)的IL-4和IL-5 蛋白水平升高及IFN-γ 水平降低，且該效應(yīng)與藥物劑量呈正相關(guān)。見圖2A、表2。

4 Mdivi-1 對(duì)NK-92MI 細(xì) 胞JAK2 和STAT6 活 化的影響

與對(duì)照組比較，TSLP 組NK-92MI 細(xì)胞JAK2 和STAT6 蛋白磷酸化水平顯著升高（P＜0.05）；與TSLP組對(duì)比，5 和10 μmol/L Mdivi-1 組JAK2 磷酸化水平顯著降低，10 μmol/L Mdivi-1組STAT6磷酸化水平顯著降低（P＜0.05），見圖2B、表2。

表2 各組NK-92MI細(xì)胞IL-4、IL-5和IFN-γ mRNA和蛋白表達(dá)水平及p-JAK2和p-STAT6蛋白水平的比較Table 2. The expression of IL-4，IL-5 and IFN-γ at mRNA and protein levels，and the protein levels of p-JAK2 and p-STAT6 in each group（Mean±SD. n=3）

5 Mdivi-1對(duì)NK-92MI細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響

Figure3. The images of flow cytometry and quantitative analysis of MitoSox Red fluorescence in NK-92MI cells of each group. Mean±SD. n=4.**P＜0.05 vs control group；##P＜0.01 vs TSLP group.圖3 各組NK-92MI細(xì)胞MitoSOX Red流式細(xì)胞術(shù)分析

MitoSOX Red 探針染色顯示，與對(duì)照組比較，TSLP 組NK-92MI 細(xì)胞的ROS 水平顯著升 高（P＜0.05）；而5 和10 μmol/L Mdivi-1 干預(yù)則有效抑制了TSLP 刺 激 下 生 成ROS 水 平 的 升 高（P＜0.01），見圖3。

討 論

NK 細(xì)胞為固有免疫重要成員，其異?；罨瘏⑴c多種變應(yīng)性疾病的發(fā)生發(fā)展［5，11-12］。近年研究示，NK細(xì)胞異?；罨S著線粒體功能紊亂或過度分裂變化［8，13］，但兩者關(guān)聯(lián)尚不明確。Mdivi-1 為選擇性逆轉(zhuǎn)線粒體分裂事件的經(jīng)典化學(xué)分子［14］，已被廣泛運(yùn)用于線粒體動(dòng)態(tài)變化與腫瘤、神經(jīng)退行性、心血管和自身免疫性疾病等關(guān)聯(lián)的探索之中［14-15］。我們前期研究示，Mdivi-1可有效抑制脂多糖、谷氨酸等誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元等線粒體分裂，以逆轉(zhuǎn)過度免疫應(yīng)答及凋亡事件［16-17］。鑒于Mdivi-1 調(diào)控線粒體分裂變化，揭示線粒體動(dòng)態(tài)與諸功能細(xì)胞病理變化相因關(guān)聯(lián)的通用性，本研究選取Mdivi-1 干預(yù)異?；罨疦K 細(xì)胞，擬揭示NK 細(xì)胞異常活化的潛在機(jī)理，并為NK 細(xì)胞異?；罨恼{(diào)節(jié)尋找可能干預(yù)方案具有重要價(jià)值。

NK 細(xì)胞于不同環(huán)境刺激下，可向多個(gè)細(xì)胞亞型分化。其中NK1 型活化，分泌INF-γ 等標(biāo)志性因子，促進(jìn)Th1 型反應(yīng)；NK2 型分化，則高表達(dá)IL-4 和IL-5等經(jīng)典Th2 型細(xì)胞因子，介導(dǎo)變應(yīng)性炎癥反應(yīng)［18］。TSLP 則為誘導(dǎo)變應(yīng)性炎癥、T 細(xì)胞Th2 型分化及NK細(xì)胞NK2 型活化的重要化學(xué)試劑，且對(duì)多種免疫細(xì)胞線粒體功能蛋白表達(dá)及形態(tài)變化具有重要影響［19-20］。我們研究顯示，與對(duì)照組比較，TSLP 組NK-92MI細(xì)胞的IL-4和IL-5蛋白表達(dá)顯著提高，IFN-γ的水平相應(yīng)下調(diào)，其符合NK2 型活化表征。與TLSP 組對(duì)比，5 和10 μmol/L Mdivi-1 組IL-4 的表達(dá)水平降低，IFN-γ 的表達(dá)水平有所回升，10 μmol/L Mdivi-1組IL-5 的表達(dá)下調(diào)。RT-qPCR 結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了Mdivi-1 對(duì)TSLP 刺激下NK 細(xì)胞IL-4 和IFN-γ 表達(dá)偏移的調(diào)節(jié)作用，提示Mdivi-1 能有效抑制TSLP 刺激所誘導(dǎo)的NK細(xì)胞NK2型分化。

JAK2 和STAT6 為調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、膠原合成及免疫應(yīng)答等生命活動(dòng)的重要信號(hào)分子，其活化參與變應(yīng)性炎癥的進(jìn)展，與變應(yīng)性鼻炎、哮喘和特異性皮炎等疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［21-22］。大量研究表明，T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、肥大細(xì)胞和NK 細(xì)胞等異常分化，釋放促Th2 型反應(yīng)因子，常伴隨著內(nèi)部JAK2 和STAT6 信號(hào)分子磷酸化水平升高［23-25］，而抑制JAK2和STAT6 信號(hào)分子活化則能有效逆轉(zhuǎn)其異?；罨纳谱儜?yīng)性炎癥反應(yīng)進(jìn)程［25-27］。我們的Western blot結(jié)果顯示，在20 μg/L TSLP 刺激下，NK-92MI 細(xì)胞的p-JAK2 和p-STAT6 蛋白水平顯著升高，符合其NK2型活化內(nèi)在表現(xiàn)［28］。而Mdivi-1干預(yù)后，TSLP誘導(dǎo)的NK-92MI細(xì)胞p-JAK2 和p-STAT6 蛋白水平的升高得到一定程度下調(diào)，且該效應(yīng)隨著藥物劑量上調(diào)呈增強(qiáng)趨勢(shì)。線粒體過度分裂等所致的ROS大量生成是JAK2 和STAT6 等分子活化的重要上游信號(hào)，其與變應(yīng)性反應(yīng)相關(guān)免疫細(xì)胞功能紊亂關(guān)聯(lián)密切［29-30］。MitoSOX Red 染色顯示，在TSLP 刺激下，NK-92MI 細(xì)胞ROS 水平明顯升高，5 和10 μmol/L Mdivi-1 干預(yù)則能有效逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。上述結(jié)果表明，Mdivi-1 抑制TSLP 誘導(dǎo)的NK 細(xì)胞NK2型活化可能與其對(duì)ROS 及JAK2/STAT6信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用相關(guān)。

由于原代NK 細(xì)胞培養(yǎng)難度較大，本研究以NK92MI細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能存在一定偏倚。本研究中，Mdivi-1 為選擇性發(fā)動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）抑制劑，其通過抑制Drp1 活性實(shí)現(xiàn)抑制線粒體分裂，若能選擇Drp1基因沉默技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果則可提高結(jié)論的可靠性。另鑒于Mdivi-1 為線粒體形態(tài)調(diào)控的經(jīng)典試劑，本研究未對(duì)NK 細(xì)胞線粒體形態(tài)變化進(jìn)行復(fù)核，或?qū)Y(jié)果可靠性產(chǎn)生一定影響。于后續(xù)進(jìn)一步機(jī)制研究中，我們擬采用電鏡及共聚焦技術(shù)對(duì)該指標(biāo)全面檢測(cè)。

綜上所述，Mdivi-1能有效抑制TSLP刺激所誘導(dǎo)的NK 細(xì)胞NK2 型分化，該效應(yīng)可能與其對(duì)ROS 及JAK2/STAT6 信號(hào)分子的調(diào)節(jié)作用相關(guān)。線粒體異常分裂可能是NK細(xì)胞異常分化的重要機(jī)制。