王振華陳金亮邢媛媛郭喜喜李東飛

(1.新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院胸瘤二科，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.南通市第一醫(yī)院呼吸科，江蘇 南通 226006)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的主要類型，死亡率高[1]。目前，NSCLC根治性切除術(shù)后5年的總生存率仍低于15%[2]。因此，有必要探索NSCLC的分子機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)。法尼醇受體(Farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)是核受體超家族的成員，能對(duì)管腔膽汁酸水平進(jìn)行嚴(yán)格調(diào)控[3]。由于大約70%的膽汁酸被人體重新吸收，F(xiàn)XR可以在血漿中達(dá)到微摩爾濃度，這可能是許多其他組織中表達(dá)FXR的基礎(chǔ)[4]。先前的研究顯示，與癌周非腫瘤組織相比，人類結(jié)直腸癌組織中的FXR表達(dá)較低，并且FXR低表達(dá)與不良預(yù)后之間存在關(guān)聯(lián)[5]。最近的研究報(bào)告了FXR可作為腫瘤抑制因子，在體內(nèi)、體外激活可抑制多種細(xì)胞生長(zhǎng)[4－5]。然而，其潛在機(jī)制并不完全清楚。MicroRNAs(miRNAs)是一種單鏈非編碼RNA分子，其通過(guò)調(diào)節(jié)癌基因或抑癌基因在抑制或促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在幾種惡性腫瘤中加速癌癥進(jìn)展，包括胃癌和結(jié)直腸癌[7]。此外，miR-21在肺癌中被觀察到上調(diào)，并與肺癌侵襲能力增加有關(guān)[8]。先前的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR激動(dòng)劑可以通過(guò)抑制miR-21改善非酒精性脂肪性肝炎小鼠的脂肪變性、炎癥、氧化應(yīng)激和膽固醇積累[9]。然而，關(guān)于FXR激動(dòng)劑能否通過(guò)下調(diào)miR-21水平抑制NSCLC細(xì)胞增殖及侵襲能力尚不清楚。因此，本研究旨在觀察FXR在NSCLC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平，探討FXR在NSCLC細(xì)胞增殖和侵襲中的作用是否與調(diào)控miR-21水平相關(guān)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)組織與細(xì)胞系

在2010年至2012年間，取本院手術(shù)切除的80例NSCLC組織及配對(duì)的正常組織。所用患者經(jīng)病理證實(shí)為NSCLC。術(shù)前無(wú)局部或全身治療。所有組織樣本在液氮中新鮮冷凍，然后轉(zhuǎn)移到－80℃保存，直到使用。所有患者至少持續(xù)隨訪60個(gè)月，并收集相關(guān)臨床病理特征和生存統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

人NSCLC系(A549、NCI-H1299、H460)和正常細(xì)胞系(16HBE)購(gòu)自美國(guó)ATCC。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%FBS、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中(美國(guó)Invitrogen公司)。

1.2 主要試劑與儀器

抗人FXR的初級(jí)抗體購(gòu)自武漢Proteintech公司；TRIpure試劑、Super M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、2×Power Taq PCR MasterMix購(gòu)自北京BioTeke公司；SYBR green、RIPA緩沖液購(gòu)自北京Solarbio公司；GW3965(FXR激動(dòng)劑)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(批號(hào):NP1524)，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8購(gòu)自日本Dojindo公司；PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；PVDF膜、lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；β-actin一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Promega公司；miR-21過(guò)表達(dá)物或?qū)φ召|(zhì)粒pcDNA3.1和miR-21抑制劑或陰性對(duì)照siRNA均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

ExicyclerTM96熒光定量分析儀購(gòu)自韓國(guó)Bioneer公司；BX51顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 腫瘤組織中FXR表達(dá)的免疫組化分析

手術(shù)標(biāo)本(NSCLC組織及配對(duì)的正常組織)用10%福爾馬林固定，石蠟包埋。將載玻片與抗人FXR的初級(jí)抗體在4℃下孵育過(guò)夜，后在25℃下與二級(jí)抗體孵育1 h。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分率對(duì)每個(gè)切片進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度評(píng)分如下:0(陰性)、1(弱染色)、2(中度染色)、3(強(qiáng)染色)。陽(yáng)性細(xì)胞百分率評(píng)分如下:0(0%)、1(0%~10%)、2(10%~50%)、3(50%~80%)、4(>80%)。IHC評(píng)分通過(guò)強(qiáng)度和百分率相乘得到。取FXR組織評(píng)分中位數(shù)作為低表達(dá)和高表達(dá)判斷:<6，低表達(dá)；≥6，高表達(dá)。

1.3.2 qRT-PCR分析

使用TRIpure試劑從組織或培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總RNA。使用Super M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用2×Power Taq PCR MasterMix和SYBR green在ExicyclerTM96熒光定量分析儀上進(jìn)行Quantitative Real-time PCR(qRT-PCR)。使用U6小核RNA(U6 snRNA)作為內(nèi)源性對(duì)照。依據(jù)NCBI上登錄的靶基因序列并通過(guò)primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)特異性引物序列如下:miR-21，正向5’-GCGGCAGGGGGAAAGTTCTA-3’，反向5’-GTG CAGGGTCCGAGGTATTC-3’；U6，正向5’-TGGAGT TGATCCTAGTCTGG-3’，反向5’-GTGCAGGGTCCG AGGTATTC-3’。經(jīng)過(guò)qRT-PCR后，使用2－△△CT方法計(jì)算目的基因的表達(dá)變化。

1.3.3 CCK-8法

將A549細(xì)胞(5×103)接種到96孔板中，分為:對(duì)照組和不同濃度的GW3965處理組。不同濃度的GW3965組加入不同濃度的GW3965(1~5μmol/L)或?qū)φ战M加入相同體積的二甲基亞砜處理48 h。然后，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.3.4 細(xì)胞侵襲試驗(yàn)

使用Transwell方法進(jìn)行細(xì)胞侵襲分析。將1.3.3項(xiàng)下經(jīng)不同分組處理的A549細(xì)胞以每孔4×105的密度接種到24孔Transwell小室中，并在上室中加入200μL無(wú)FBS的培養(yǎng)基。使用500μL含30%胎牛血清培養(yǎng)基填充底部孔。培養(yǎng)24 h后，用70%乙醇處理和0.5%結(jié)晶紫染色。在BX51顯微鏡下量化侵襲細(xì)胞的數(shù)量。隨機(jī)選擇五個(gè)區(qū)域，并在每個(gè)區(qū)域中統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)。

1.3.5 Western blot分析

用RIPA緩沖液裂解細(xì)胞提取總蛋白。通過(guò)BCA試劑盒評(píng)估蛋白質(zhì)含量。采用10%SDS-PAGE電泳將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜用5%脫脂牛奶封閉1 h，然后在4℃下用以下一抗封閉過(guò)夜:FXR(1∶1000)和β-actin(1∶1000)。將PVDF膜與二抗在室溫下孵育1 h。使用蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)化學(xué)發(fā)光試劑盒觀察目標(biāo)條帶。

1.3.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取A549細(xì)胞，以每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種于24孔板。然后用lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，分別將miR-21過(guò)表達(dá)物(pcDNA-miR-21，50 nmol/L)或?qū)φ召|(zhì)粒pcDNA3.1(pcDNA)和miR-21抑制劑(si-miR-21，100 nmol/L)或陰性對(duì)照siRNA(si-NC)轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，收集細(xì)胞并分為8組:pcDNA＋DMSO組、pcDNA＋GW3965組、pcDNA-miR-21＋DMSO組、pcDNA-miR-21＋GW3965組、si-NC＋DMSO組、si-NC＋GW3965組、si-miR-21＋DMSO組、si-miR-21＋GW3965組。將細(xì)胞用 5 μmol/L GW3965或DMSO處理0、24、48和72 h，收集細(xì)胞進(jìn)行CCK-8法、Transwell法分析。

1.3.7 雙熒光素酶報(bào)告分析

合成含有miR-21靶點(diǎn)的FXR野生型(WT)或突變型(MUT)，然后克隆到pmir-GLO載體中。將1.5μg pmirGLO-FXR-WT或pmirGLO-FXR-MUT分別與pcDNA-miR-21和/或si-miR-21共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，孵育24 h后，用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)測(cè)定熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS軟件17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)。使用t檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)評(píng)估組之間的差異。使用卡方檢驗(yàn)、Fisher’s精確檢驗(yàn)和Kaplan-Meier方法(對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn))進(jìn)行相關(guān)分析和生存數(shù)據(jù)分析。NSCLC組織中FXR與miR-21表達(dá)之間相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FXR低表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后不良相關(guān)

FXR蛋白位于細(xì)胞膜上(圖1A)。與鄰近的非腫瘤正常組織相比，F(xiàn)XR在NSCLC組織中的表達(dá)顯著降低(P<0.001，圖1B)。80例患者中，有27例FXR高表達(dá)，53例FXR低表達(dá)。Kaplan-Meier分析顯示FXR低表達(dá)預(yù)示NSCLC患者預(yù)后較差(χ2＝4.496，P＝0.033，圖1C)，提示FXR可能作為一種致癌因子參與NSCLC的發(fā)生和發(fā)展。研究進(jìn)一步分析了FXR的表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果顯示，F(xiàn)XR高、低表達(dá)的NSCLC在臨床分期、腫瘤大小、T分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N分期)上有顯著性差異(P<0.05)(表1)。

表1 根據(jù)NSCLC中FXR蛋白表達(dá)的臨床病理特征Table 1 Clinicopathologic characteristics according to FXR protein expression in NSCLC

圖1 FXR低表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后不良相關(guān)Figure 1 Low FXR expression is associated with poor prognosis in NSCLC patients

2.2 FXR抑制NSCLC細(xì)胞增殖和侵襲

使用Western blot方法檢測(cè)了3種NSCLC細(xì)胞系中的FXR蛋白，發(fā)現(xiàn)FXR在A549細(xì)胞中的表達(dá)最低(圖2A)，因此，研究選擇A549細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn)。Western blot顯示，GW3965以劑量依賴方式促進(jìn)了A549細(xì)胞中FXR的表達(dá)(圖2B)。功能實(shí)驗(yàn)表明，GW3965以劑量依賴方式顯著抑制了A549細(xì)胞的增殖和侵襲(圖2C、D)。所有這些結(jié)果表明FXR受體對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲具有很強(qiáng)的抑制作用。

圖2 FXR抑制NSCLC細(xì)胞體外增殖Figure 2 FXR inhibited the proliferation of NSCLCcells in vitro

2.3 FXR的激活通過(guò)下調(diào)miR-21抑制NSCLC細(xì)胞增殖和侵襲

使用PCR方法檢測(cè)了3種NSCLC細(xì)胞系中的miR-21，發(fā)現(xiàn)miR-21在A549細(xì)胞中的表達(dá)最高(圖3A)。利用GW3965激活FXR可劑量依賴性地降低miR-21(圖3B)。功能實(shí)驗(yàn)表明，miR-21過(guò)表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)了FXR對(duì)NSCLC細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的抑制作用(P<0.05)，并且miR-21沉默顯著增強(qiáng)FXR對(duì)NSCLC細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的抑制作用(P<0.05)(圖3C~H)。為了證實(shí)FXR與miR-21之間的關(guān)系，研究進(jìn)行了雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因檢測(cè)。圖4A顯示了分別包含預(yù)測(cè)的miR-21野生型和突變體結(jié)合位點(diǎn)的FXR mRNA的3’-UTR(FXR 3’-UTR WT和FXR 3’-UTR MUT)(帶突變的堿基標(biāo)有下劃線)。在FXR 3’UTR WT組中，與陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，pcDNA-miR-21顯著抑制FXR 3’UTR WT的熒光素酶活性(P<0.001)，si-miR-21可顯著減輕該抑制作用(P<0.01)(圖4B)。這些結(jié)果表明，F(xiàn)XR通過(guò)靶向miR-21來(lái)抑制NSCLC細(xì)胞增殖和侵襲。

圖3 FXR通過(guò)下調(diào)miR-21抑制NSCLC細(xì)胞的增殖和侵襲Figure 3 FXR inhibits the proliferation and invasion of NSCLC cells by down-regulating miR-21

圖4 FXR直接與miR-21相互作用Figure 4 FXR directly interacted with miR-21

2.4 FXR過(guò)表達(dá)與NSCLC中miR-21呈反相關(guān)

研究進(jìn)一步利用qRFPCR分析了miR-21在同一標(biāo)本中的表達(dá)，以闡明FXR和miR-21在NSCLC中的關(guān)系。結(jié)果顯示，NSCLC組織中miR-21的水平顯著高于鄰近組織(P<0.01，圖5)。將80例NSCLC組織分為兩組:miR-21高表達(dá)組(高于miR-21表達(dá)中位數(shù)，n＝40)和低表達(dá)組(低于miR-21表達(dá)中位數(shù)，n＝40)。Spearman分析顯示，NSCLC標(biāo)本中FXR與miR-21的表達(dá)呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)(P<0.001，表2)。Kaplan-Meier分析顯示，“FXR低表達(dá)”和“miR-21”高表達(dá)共存模式預(yù)測(cè)了NSCLC患者最差的預(yù)后(χ2＝8.201，P＝0.004，圖6)。

圖6 Kaplan-Meier分析顯示FXR低表達(dá)和miR-21高表達(dá)患者的預(yù)后最差Figure 6 Kaplan Meier analysis showed that patients with low FXR expression and high miR-21 expression had the worst prognosis

表2 NSCLC中FXR與miR-21表達(dá)的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of FXR and miR-21 expression in NSCLC

圖5 80例患者NSCLC組織中miR-21表達(dá)與配對(duì)相鄰組織的比較Figure 5 Comparison of miR-21 expression in NSCLC tissues of 80 patients with paired adjacent tissues

3 討論

NSCLC約占肺癌的85%，預(yù)后差，5年總生存率低[1]。因此，迫切需要提高NSCLC的早期診斷水平。FXR是核受體超家族的成員，在膽汁酸、膽固醇、脂質(zhì)和葡萄糖代謝中起著關(guān)鍵作用[10]。最近，人們發(fā)現(xiàn)FXR的功能超出了新陳代謝，包括炎癥和致癌作用[11]；如Hotta等[5]發(fā)現(xiàn)FXR在體外和體內(nèi)對(duì)包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種癌癥具有重要的抗癌作用；Alasmael等[4]發(fā)現(xiàn)FXR的激活會(huì)導(dǎo)致四種不同表型乳腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞死亡:MCF-10A(正常)、MCF-7(受體陽(yáng)性)、MDA-MB-231和MDA-MB-468(三重陰性)。本研究發(fā)現(xiàn)FXR在多個(gè)NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá)低于16HBE正常細(xì)胞，在NSCLC組織中的表達(dá)較鄰近組織下調(diào)，并且FXR低表達(dá)與NSCLC臨床分期、腫瘤大小、T分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N分期)顯著相關(guān)。先前研究報(bào)道，F(xiàn)XR激動(dòng)劑GW3965治療通過(guò)激活不同荷瘤小鼠MDSCs表面的ApoE-LRP8受體引起MDSCs凋亡，從而降低MDSCs對(duì)T細(xì)胞的抑制作用，發(fā)揮抗腫瘤作用[12]。本研究功能分析表明，利用GW3965上調(diào)NSCLC細(xì)胞中FXR的表達(dá)抑制了A549細(xì)胞的增殖和侵襲，提示FXR可能參與了NSCLC的發(fā)生發(fā)展，并可作為治療NSCLC的一種新的臨床分子標(biāo)記物。

接下來(lái)，本研究試圖揭示FXR在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控機(jī)制。大量研究表明，miRNA在癌癥發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[2]。miRNA作為小的非編碼RNA，可以通過(guò)靶向mRNAs來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[13]。因此，miRNAs通過(guò)參與多種與癌癥相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程，如細(xì)胞增殖和凋亡，被證明是腫瘤的癌基因和抑制因子[14]。先前在NSCLC的miRNA研究表明，miRNA具有獨(dú)特的致癌作用，如miRNA-615-3p通過(guò)抑制IGF2抑制NSCLC的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[15]；miR-129通過(guò)靶向SOX4抑制A549細(xì)胞的遷移和侵襲[16]。最近，F(xiàn)XR被報(bào)道通過(guò)與3’UTR結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)miR-21的表達(dá)[9]。miR-21在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞行為和惡性腫瘤中起著重要作用，并且還可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞抗凋亡特性[17]。此外，miR-21在NSCLC細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和凋亡中起重要作用[2]。為了解釋FXR的異常表達(dá)，預(yù)測(cè)miR-21可能是FXR的候選調(diào)控因子。結(jié)果表明，miR-21在人NSCLC中過(guò)度表達(dá)，而利用GW3965激活FXR可降低miR-21，并且miR-21過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了FXR對(duì)NSCLC細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的抑制作用。進(jìn)一步通過(guò)熒光素酶報(bào)告顯示miR-21與FXR的3’UTR結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，證實(shí)了本研究發(fā)現(xiàn)。以上證據(jù)表明，miR-21是一種致癌的miRNA，F(xiàn)XR通過(guò)靶向miR-21來(lái)抑制NSCLC細(xì)胞增殖和侵襲。本研究還發(fā)現(xiàn)NSCLC標(biāo)本中FXR和miR-21的表達(dá)呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)，并且“FXR低表達(dá)”和“miR-21高表達(dá)”共存模式預(yù)測(cè)了NSCLC患者最差的預(yù)后?；谶@些研究結(jié)果，F(xiàn)XR激動(dòng)劑GW3965在miR-21過(guò)度表達(dá)的NSCLC患者中具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，以減輕miR-21的有害影響。需要進(jìn)一步的臨床前和臨床研究證實(shí)這一觀點(diǎn)。

綜上所述，本研究揭示了FXR通過(guò)下調(diào)miR-21抑制NSCLC細(xì)胞的生長(zhǎng)，提示調(diào)控FXR/miR-21可能是治療NSCLC的潛在策略。本研究為FXR參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展提供了一個(gè)新的視角。