徐成辰 吳晗 呂霞 楊淑嫻

(江蘇省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗測試中心，江蘇 南京 210036)

環(huán)己二酮類(環(huán)己烯酮類)除草劑是一類低毒、高效、廣譜的內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑[1,2]，通過抑制乙酰輔酶A羧化酶而起作用，主要用于防治禾本科雜草[3,4]。其最先由日本曹達公司開發(fā)，目前共有十多個品種商品化，其中包括烯草酮、三甲基苯草酮、烯禾啶、吡喃草酮、噻草酮、環(huán)苯草酮和丁苯草酮等[1,5]。丁苯草酮是捷利康公司開發(fā)的一種環(huán)己二酮類除草劑，適用于棉花、油菜、豆類、甜菜等闊葉作物，對冬草等雜草防除活性優(yōu)異，且見效快[6,7]。

目前，在國內(nèi)登記生產(chǎn)的環(huán)己二酮類除草劑品種有烯草酮、三甲基苯草酮和烯禾啶，丁苯草酮也有部分企業(yè)在登記過程中。國內(nèi)對丁苯草酮的研究，主要在殘留檢測以及市場開發(fā)[8]方面，尚無相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布和分析方法的研究報道。為了滿足企業(yè)生產(chǎn)質(zhì)控的需求，同時為市場監(jiān)管等工作做前期準(zhǔn)備，本文采用高效液相色譜技術(shù)建立了一種適用于丁苯草酮原藥中有效成分定量分析的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

Agilent-1100型高效液相色譜儀配備二極管陣列紫外檢測器及色譜工作站(美國安捷倫科技有限公司)；超純水制備系統(tǒng)(默克密理博公司)；AS-3120B超聲波清洗機(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；針筒過濾器，0.45μm孔徑濾膜(默克密理博公司)。

1.2 試劑和溶液

乙腈，色譜純(德國Merck公司)；磷酸，分析純(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；超純水；丁苯草酮標(biāo)準(zhǔn)品，已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)含量≥97.0%(外購)；丁苯草酮原藥(外購)。

1.3 色譜操作條件

色譜柱使用Zorbax SB-C18不銹鋼柱(150mm×4.6mm，5μm)，流動相為乙腈加0.1%磷酸水溶液=75+25(V/V)；流動相流速為1.0mL·min-1；柱溫為30℃；檢測波長為254nm；進樣體積為5μL。在上述色譜操作條件下，丁苯草酮的保留時間約為6.6min。丁苯草酮標(biāo)準(zhǔn)品、丁苯草酮原藥的高效液相色譜圖分別見圖1、圖2。

圖1 丁苯草酮標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖

圖2 丁苯草酮原藥的液相色譜圖

1.4 質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定步驟

1.4.1 配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液

準(zhǔn)確稱取丁苯草酮標(biāo)準(zhǔn)品0.03g(精確至0.00001g)，置于50mL容量瓶中，添加45mL乙腈，超聲振蕩5min，使標(biāo)準(zhǔn)品完全溶解，冷卻恢復(fù)至室溫，用乙腈定容，搖勻。

1.4.2 配制原藥試樣溶液

準(zhǔn)確稱取含丁苯草酮的試樣0.03g(精確至0.00001g)，置于50mL容量瓶中，添加45mL乙腈，超聲振蕩5min，使試樣完全溶解，冷卻恢復(fù)至室溫，用乙腈定容，搖勻并用0.45μm過濾器過濾。

1.4.3 進樣測定

按照1.3中操作條件，在儀器基線穩(wěn)定后，連續(xù)進行標(biāo)準(zhǔn)品溶液的測定，直至連續(xù)兩針峰面積的變化<1.2%后，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的次序進樣并分析計算。

1.4.4 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計算

分別將連續(xù)測定兩針試樣溶液及試樣前后標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積算平均值，并按以下算式計算丁苯草酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X)：

式中，m1為丁苯草酮標(biāo)準(zhǔn)品的稱樣質(zhì)量，g；m2為試樣的稱樣質(zhì)量，g；F1為標(biāo)準(zhǔn)品溶液的丁苯草酮峰面積平均值；F2為試樣溶液的丁苯草酮峰面積平均值；r為標(biāo)準(zhǔn)品中丁苯草酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的選擇

按照1.4.1配制丁苯草酮標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，利用高效液相色譜儀的二極管陣列檢測器進行紫外光譜掃描(190～500nm)，所得丁苯草酮的紫外吸收光譜圖見圖3。由圖3可知，丁苯草酮在200nm、254nm兩處均存在紫外吸收峰值?？紤]200nm處紫外波長較短，容易產(chǎn)生紫外吸收的雜質(zhì)較多，為減少干擾選擇254nm作為檢測波長。

2.1.2 流動相的選擇

本試驗選擇了安捷倫Zorbax SB-C18(150mm×4.6mm，5μm)色譜柱進行方法建立。流動相選擇了3種不同溶劑體系進行初步測試，乙腈/水、乙腈/0.1%磷酸水溶液、乙腈/0.1%乙酸水溶液。試驗發(fā)現(xiàn)，選擇乙腈/0.1%磷酸水溶液體系，在1.0mL·min-1流速下，丁苯草酮與雜質(zhì)可以得到較好的分離。以此為基礎(chǔ)，將不同比例的乙腈和0.1%磷酸水溶液混合并分別進行測試，當(dāng)有機相占比過大時，出峰較快，導(dǎo)致丁苯草酮和雜峰分離效果不好；而當(dāng)有機相占比過小時，出峰太慢，影響峰形和檢測效率。根據(jù)丁苯草酮和雜質(zhì)峰的出峰時間、分離效果、峰形以及峰純度進行綜合考慮，當(dāng)使用乙腈加0.1%磷酸水溶液=75+25(V/V)時，丁苯草酮色譜峰峰形及峰純度較好，且能兼顧分離度與檢測效率，保留時間約6.6min，見圖1。

2.2 方法特異性試驗

本試驗采用HPLC-DAD峰純度分析法來鑒別丁苯草酮。分別配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液和試樣溶液按1.3操作條件進行峰純度測試。測定結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品和原藥兩者中的有效成分峰純度均高于990，無其它雜質(zhì)成分干擾，滿足定量分析的要求。丁苯草酮標(biāo)準(zhǔn)品、丁苯草酮原藥的峰純度色譜圖分別見圖4、圖5。

圖4 丁苯草酮標(biāo)準(zhǔn)品HPLC-DAD峰純度色譜圖

圖5 丁苯草酮原藥HPLC-DAD峰純度色譜圖

2.3 方法線性關(guān)系的測定

按照標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制方法制備5個濃度不同的丁苯草酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并進行線性測定。按1.3操作條件，分別測定每個標(biāo)準(zhǔn)品溶液的丁苯草酮峰面積，2次測定取平均值。以有效成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積平均值為縱坐標(biāo)繪制線性關(guān)系圖，見圖6。

從圖6可知，在172.66～1753.76mg·L-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(進樣體積5μL)，丁苯草酮的質(zhì)量濃度與對應(yīng)的峰面積線性關(guān)系良好，其線性回歸方程為y=8.5577x-69.847，相關(guān)系數(shù)為0.9998，可以滿足定量分析的要求。

圖6 丁苯草酮的線性關(guān)系圖

2.4 方法精密度的測定

按照試樣溶液的配制方法制備5個丁苯草酮原藥的樣品溶液，在1.3操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，按照標(biāo)準(zhǔn)品溶液、精密度樣品溶液、精密度樣品溶液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的順序進行精密度測定，結(jié)果見表1。

從表1可知，丁苯草酮原藥中丁苯草酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果的變異系數(shù)(RSD)為0.2797%，而修改的Horwitz公式2(1-0.51ogC)×0.67=1.3465，變異系數(shù)測定結(jié)果遠(yuǎn)小于公式計算值，表明此分析方法的重復(fù)性測定結(jié)果能夠滿足定量分析的精密度要求。

表1 丁苯草酮原藥中丁苯草酮重復(fù)性試驗結(jié)果

2.5 方法準(zhǔn)確度的測定

為了驗證方法的準(zhǔn)確度，進行有效成分的回收率試驗。稱取含0.015g(精確至0.00001g)丁苯草酮的丁苯草酮原藥于50mL容量瓶中，再加入丁苯草酮標(biāo)準(zhǔn)品0.015g(精確至0.00001g)，按照試樣溶液的配制方法制備了5個有效成分準(zhǔn)確度溶液。在1.3操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，按照標(biāo)準(zhǔn)品溶液、準(zhǔn)確度樣品溶液、準(zhǔn)確度樣品溶液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的順序進行測定，準(zhǔn)確度測定結(jié)果見表2。從表2可知，丁苯草酮原藥中丁苯草酮平均回收率為100.17%，說明有效成分分析方法準(zhǔn)確度較好，測定結(jié)果符合定量分析的回收率要求。

表2 丁苯草酮原藥的準(zhǔn)確度試驗結(jié)果

3 結(jié)論

本文采用配備紫外檢測器的高效液相色譜儀建立了一種測定丁苯草酮含量的分析方法，使用Zorbax SB-C18色譜柱、流速為1.0mL·min-1的乙腈/0.1%磷酸水溶液混合溶液為流動相，在檢測波長254nm下進行分離測定。該方法具有操作簡便快速，線性關(guān)系良好，特異性、精密度、準(zhǔn)確度較高、有效成分分離效果好等特點，可用于丁苯草酮原藥常規(guī)分析和質(zhì)量控制。