鄭大勇，張?zhí)煲?，林源希，李真玉?，宗曉龍（通信作者）

1 天津醫(yī)科大學寶坻臨床學院 （天津 301800）； 2 天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院重癥醫(yī)學科（天津 300211）； 3 天津心臟病學研究所 （天津 300211）； 4 天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院檢驗科 （天津 300211）

2004年，Brinkmann 等[1]應用佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）、白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）和脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激中性粒細胞后，觀察到一種釋放至胞外的DNA 網(wǎng)狀結構，即中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）。此后，眾多的刺激物如細菌、真菌、活化的血小板、免疫復合物（immune complex，IC）以及高遷移速率族蛋白（high mobility group box 1，HMGB1）等損傷相關模式分子（damage-associated molecular patterns，DAMPs）被陸續(xù)報道能夠誘導NETs 形成[2]。NETs 與膿毒癥存在密切聯(lián)系，一方面在膿毒癥進程中病原相關模式分子（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）和DAMPs 分子譜是誘導NETs 形成的潛在激活物[3-4]，另一方面NETs 通過多種途徑參與膿毒癥發(fā)病機制。近年來，越來越多的研究提示NETs 是治療膿毒癥患者及其相關器官功能障礙的潛在靶點[5]?，F(xiàn)對NETs 形成的分子機制及其在膿毒癥中病理作用的研究進展進行綜述。

1 NETs 形成的分子機制

1.1 NETs 形成的上游調(diào)控

天然免疫是機體抵御感染的第一道防線，中性粒細胞是人體內(nèi)數(shù)量最多的先天免疫細胞，其主要通過吞噬或釋放NETs 的方式清除病原微生物[6]。雖然吞噬與釋放NETs 都能實現(xiàn)對病原體的捕殺，但兩者的免疫效應機制截然不同。吞噬過程依賴于細胞骨架完整，而NETs 形成伴隨著細胞骨架破壞。此外，吞噬過程將髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）和吞噬底物共同包被于吞噬小體，以實現(xiàn)對病原體的殺滅，而MPO、NE由胞漿入核驅動染色質解聚是NETs 形成的關鍵環(huán)節(jié)[7]。

面對病原微生物入侵，中性粒細胞在吞噬與釋放NETs 之間做出何種響應，以及調(diào)控這種選擇的機制尚不明確。Branzk 等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，病原體體積是影響這一過程的重要因素，中性粒細胞感受體積較大的病原體（如真菌菌絲）刺激后傾向于釋放NETs，而對于細菌和酵母等小體積病原體則優(yōu)先啟動吞噬作用；進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞模式識別受體樹突狀細胞相關性C 型凝集素受體-1（dendritic cell-associated C-type lectin-1，Dectin-1）在介導吞噬作用的同時能夠抑制NE 入核，敲低Dectin-1后NETs 生成水平顯著上調(diào)。膿毒癥免疫失調(diào)在細胞水平表現(xiàn)為淋巴細胞減少和未成熟中性粒細胞增多[9]。Taneja 等[10]發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者外周血未成熟中性粒細胞吞噬功能和鈣通道受損，而Ca2+內(nèi)流在NETs 形成中發(fā)揮重要作用，因此，推測未成熟中性粒細胞傾向于優(yōu)先形成NETs。與之類似，Abrams 等[11]最近通過體外誘導實驗發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者中性粒細胞形成NETs 水平高于對照組，且NETs 生成水平與彌散性血管內(nèi)凝血發(fā)生率和全因死亡率相關。

1.2 NETs 形成的胞內(nèi)信號傳導

NETs 形成過程涉及胞內(nèi)一系列分子事件，其中活性氧（reactive oxygen species，ROS）發(fā)揮核心作用。中性粒細胞感受內(nèi)外源刺激后，以NADPH 氧化酶（NADPH oxidase，NOX）依賴或NOX 非依賴的方式產(chǎn)生ROS 蓄積于胞漿，誘導細胞骨架重排[7]，同時破壞核膜與顆粒膜的完整性；顆粒酶MPO、NE 釋放并入核，導致組蛋白水解、染色質解聚，肽?；彼崦搧啺访?（protein-arginine deiminase type 4，PAD4）修飾組蛋白瓜氨酸化協(xié)同參與染色質解聚[12]；最終，在NE 和消皮素D（gasdermin D，GSDMD）作用下細胞膜破裂[13]，染色質與胞漿顆粒酶外排并通過靜電力聚集于胞外，形成具有殺菌活性的NETs（見圖1）。

圖1 NETs 形成的分子機制

NOX 依賴的NETs 形成途徑是最早被發(fā)現(xiàn)且研究較為完善的通路，PMA、細菌、LPS、真菌、活化血小板、IL-8、IC 等眾多刺激物均能經(jīng)NOX 途徑誘導NETs 形成。NOX 活化釋放ROS 是該途徑的核心環(huán)節(jié)，但不同刺激物激活NOX 的上游機制有所不同。PMA 經(jīng)纖維肉瘤蛋白（rapidly accelerated fibrosarcoma，Raf）/絲裂原活化的細胞外信號調(diào) 節(jié) 激 酶（mitogen-activated extracellular signal regulatedkinase，MEK）/細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路激活NOX[14]，而LPS 激活NOX 依賴Toll 樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）和c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）的參與[15]。

NOX 非依賴的NETs 形成途徑是近年發(fā)現(xiàn)的一種以線粒體釋放ROS 為核心的全新機制，該過程中線粒體代替NOX 提供ROS 來源[16]。Ca2+通道與NOX 非依賴的NETs 形成密切相關，離子霉素作為Ca2+載體能夠以NOX 非依賴性的方式誘導NETs 形成[16]。同時，PAD4誘導組蛋白瓜氨酸化、驅動染色質解聚是NOX 非依賴途徑的必需環(huán)節(jié)[16]。

目前并不清楚在體內(nèi)病生理條件下，中性粒細胞主要通過上述哪種途徑釋放NETs，抑或兩者協(xié)同介導NETs 形成。Lood 等[17]的研究中通過通路抑制實驗發(fā)現(xiàn)，來源于系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者中性粒細胞在IC 刺激下，單純激活NOX 不足以啟動NETs 釋放，而激活線粒體釋放ROS 能夠顯著提高NETs 水平，表明線粒體源ROS 在某些情況下是NETs 形成所必需的。后續(xù)研究應加強對特定病理條件下NETs 形成機制的解析，這不僅有助于理解不同NETs 形成機制的病理生理意義，還有助于指導精確靶向NETs 治療。

1.3 NETs 釋放與細胞命運結局

早期研究認為NETs 是中性粒細胞“自殺式”的免疫應答，在細胞壞死后幾個小時，隨著核膜和漿膜破裂，染色質DNA 以云霧狀釋放至胞外形成NETs[18]。后續(xù)研究進一步在分子水平建立了NETs 與細胞死亡的聯(lián)系。受體相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1）、RIPK3和混合譜系激酶結構域樣蛋白（mixed-lineage kinase domain-like protein，MLKL）是介導細胞壞死性凋亡的關鍵原件，Schreiber 等[19]和Desai 等[20]發(fā)現(xiàn)PMA、尿酸結晶和抗中性粒細胞胞漿抗體能夠以RIPK1/3-MLKL 信號依賴的方式誘導NETs 形成，但同時有研究指出敲除RIPK3基因或藥物抑制MLKL 雖然能夠抑制壞死性凋亡，但并不影響NETs 釋放[21]。最近Amini 等[22]發(fā)現(xiàn)，PMA 刺激中性粒細胞幾分鐘后線粒體DNA 即可釋放，而延長刺激時間會導致細胞死亡，提示NETs 形成與細胞死亡是不同機制驅動的不同過程。

實際上，已有多項研究報道細胞死亡并不是中性粒細胞釋放NETs 后的唯一結局[23-25]。2009年，Yousefi 等[23]發(fā)現(xiàn)中性粒細胞經(jīng)粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony stimulating factor，GM-CSF）和LPS 或補體C5a 刺激后能夠釋放線粒體DNA 形成NETs，但其生命周期并未改變。2010年，Pilsczek 等[24]發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的殺白細胞毒素能夠誘導中性粒細胞細胞核形成小泡，這些小泡釋放至胞外形成NETs，此過程進展迅速且不依賴NOX 激活和細胞膜破裂。2012年，Yipp 等[25]觀察到中性粒細胞釋放NETs 后仍保有趨化和吞噬能力。以上報道提示NETs 形成和細胞死亡是不同機制調(diào)控的兩種不同的細胞活動。

2 NETs 的體內(nèi)清除

NETs 具有清除感染的作用，而過量的NETs 蓄積會導致組織損傷，因此，NETs 的及時清除對于維持組織穩(wěn)態(tài)至關重要。研究發(fā)現(xiàn)，脫氧核糖核酸酶Ⅰ（deoxyribonuclease Ⅰ，DNase Ⅰ）和巨噬細胞在NETs 清除過程中發(fā)揮關鍵作用。DNase Ⅰ能夠水解DNA 骨架，將網(wǎng)狀NETs 降解為巨噬細胞能夠吞噬的碎片底物[26]。DNase Ⅰ活性受限或巨噬細胞吞噬能力降低，體內(nèi)NETs 蓄積，已被證明與狼瘡性腎病、膿毒癥性血栓以及急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratry distress syndrme，ARDS）密切相關，應用人工重組DNase 或重塑巨噬細胞對NETs 的吞噬能力，為這些疾病的治療提供了全新思路[27-28]。

3 NETs 在膿毒癥中的病理作用

盡管驅動NETs 形成的機制是多樣的，其伴隨的細胞結局也不盡相同，但NETs 的化學本質均是以DNA 為骨架，粘附有多種顆粒蛋白的網(wǎng)狀復合物。NETs 組份的多樣性為其發(fā)揮殺菌作用提供了物質基礎，同時也為其產(chǎn)生廣泛的病理作用埋下了隱患。

3.1 調(diào)節(jié)炎癥反應

動物研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥小鼠NETs 水平上調(diào)，注射重組人脫氧核糖核酸酶（recombinant human deoxyribonuclease，rhDNase）加速NETs 降解，能夠降低趨化因子、IL-6、HMGB1水平，減少組織損傷和病死率[29]。NETs 的促炎機制可以是直接的，也可以通過調(diào)節(jié)其他免疫細胞間接實現(xiàn)。NETs 組份DNA 和組蛋白能夠作為DAMPs 分子，直接啟動或放大炎癥反應[3]。Warnatsch 等[30]發(fā)現(xiàn)NETs 經(jīng)TLR2或TLR4誘導巨噬細胞IL-6和pro-IL-1β 轉錄水平上調(diào)，加速動脈粥樣硬化進展。與之類似，國內(nèi)Song 等[31]最近發(fā)現(xiàn)NETs 能夠誘導肺組織巨噬細胞向促炎的M1型極化，從而加重肺損傷。同時，Schauer 等[32]發(fā)現(xiàn)NETs 粘附的水解蛋白酶能夠降解細胞因子和趨化因子，從而緩解局部炎癥[32]。這種局部抗炎作用在膿毒癥系統(tǒng)性炎癥反應中是否同樣發(fā)揮關鍵作用，有待進一步探討。

3.2 誘發(fā)凝血功能紊亂

凝血功能紊亂是膿毒癥的典型病理特征，NETs 的促栓機制是多樣的[33]。首先，NETs 巨大的網(wǎng)狀結構為其發(fā)揮血管占位作用提供了先天條件；其次，NETs 成份組蛋白H3/H4能夠經(jīng)接觸途徑激活凝血級聯(lián)反應以及組織因子依賴的凝血酶生成，同時NE 和MPO 抑制抗凝蛋白組織因子途徑抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）和血栓調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin，TM）；此外，NETs 可以激活血小板，形成血小板與中性粒細胞交互作用的正反饋調(diào)節(jié)網(wǎng)絡[34]。

血小板與中性粒細胞協(xié)同作用誘導NETs 形成已被證實與血栓、自身免疫病、腫瘤等多種疾病密切相關[35]。血小板和中性粒細胞在外周循環(huán)中數(shù)量豐富，膿毒癥肺損傷時兩者共同聚集于肺組織[36]，為兩者相互作用提供了空間條件，而血小板本身能夠作為調(diào)控NETs 形成的上游元件[37]。肝素/低分子肝素是ICU 最常用的預防性抗栓藥物，肝素誘導性血小板減少癥（heparin induced thrombocytopenia，HIT）是困擾臨床的藥物不良反應。既往認為HIT 是IC 介導的血小板消耗性減低伴發(fā)血栓并發(fā)癥。新近一項關于NETs 與HIT的研究帶來了HIT 概念上的突破，該研究發(fā)現(xiàn)，NETs 是HIT 伴發(fā)血栓形成的關鍵因素，且NETs 的這種促栓作用并不完全依賴于血小板的參與[38]。

3.3 介導組織損傷

NETs 具有細胞毒性，在體外能夠直接殺傷內(nèi)皮細胞和上皮細胞，體內(nèi)過量的NETs 蓄積導致上皮組織和內(nèi)皮組織損傷[39]。組蛋白通過破壞細胞膜發(fā)揮細胞毒作用[40]，其他NETs 成份如防御素和NE 能夠水解細胞間基質蛋白，導致細胞間連接破壞[41]。肺血管內(nèi)皮屏障損傷是ARDS 的核心發(fā)病機制，血管內(nèi)皮細胞鈣粘連蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin）是構成肺血管內(nèi)皮粘附連接的核心蛋白，血清VE-cadherin 水平對膿毒癥ARDS 具有預測價值和預后意義[42]。已經(jīng)有研究建立了NETs 上調(diào)與VEcadherin 分子重排的聯(lián)系[43]，后續(xù)研究應深入對該過程調(diào)控機制以及潛在干預靶點的探討。

4 靶向NETs 治療膿毒癥

隨著臨床前研究證據(jù)的積累，NETs 有望成為治療膿毒癥的全新靶點?？偟膩碚f，靶向NETs 策略可分為抑制NETs 形成、加速NETs 降解以及拮抗NETs 毒性成份3方面。

DNase 是一類能夠消化DNA 的核酸內(nèi)切酶，體內(nèi)DNase Ⅰ和DNase Ⅲ是降解NETs 的重要成份[28]，人工重組DNase Ⅰ已被臨床用于治療囊性纖維化。DNase 能夠降解NETs 的DNA 骨架，動物水平研究顯示，注射rhDNase 能夠改善肺損傷，降低病死率[44]。國內(nèi)Li 等[45]發(fā)現(xiàn)，抗瓜氨酸化組蛋白H3抗體能夠提高盲腸結扎穿孔術（cecal ligation and peferation，CLP）模型小鼠的生存率。NE 是強效的蛋白水解酶，應用NE 抑制劑能夠降低膿毒癥腎損傷風險[46]。

循環(huán)DNA 和組蛋白不僅來源于NETs，也可能源自壞死的組織細胞，因此，靶向抑制NETs 形成的上游環(huán)節(jié)是更加特異的策略。PAD4在驅動染色質解聚環(huán)節(jié)發(fā)揮關鍵作用，PAD4脫氨活性抑制劑（Cl-amidine）能夠特異性抑制PAD4的活性。膿毒癥造模前預注射Cl-Amidine 能夠抑制體內(nèi)H3瓜氨酸化和NETs 水平，提高模型動物生存率[47]。重要的是，Martinod 等[48]發(fā)現(xiàn)敲除PAD4基因在抑制NETs 形成的同時并不影響CLP 模型小鼠體內(nèi)細菌荷載量增加，提示PAD4可能是比較安全的干預靶點。

5 總結與展望

NETs 是中性粒細胞發(fā)揮免疫防御功能的重要方式，而過量的NETs 會產(chǎn)生廣泛的病理作用。NETs 的形成機制復雜多樣，NETs 組份中DNA 的來源、NETs 與細胞死亡的聯(lián)系和區(qū)別、不同NETs 形成機制在生理病理條件下如何調(diào)控并發(fā)揮作用等問題，有待后續(xù)研究闡明。NETs 參與膿毒癥及其相關器官功能障礙的發(fā)病機制，靶向NETs 是治療膿毒癥的潛在策略。然而，在膿毒癥復雜病理條件下，驅動NETs 形成的關鍵上游機制仍不明確，加之NETs 本身具有清除感染和局部抗炎的作用，因此，干預靶點以及干預時機的選擇和評價，是實現(xiàn)基礎向臨床轉化前需要解決的關鍵問題。