王凱杰，周哲倫，姜茹予，王晴晴，雷玉恬，王 莎

(湖州師范學(xué)院 醫(yī)學(xué)院、護(hù)理學(xué)院，浙江 湖州 313000)

近年來，隨著廣譜抗生素、抗腫瘤藥物、腎上腺皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等的廣泛應(yīng)用甚至濫用，以及器官移植和外科介入性治療，菌群失調(diào)以致機(jī)體對(duì)真菌的抵抗力降低，侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis, IA)感染的發(fā)生呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，成為了器官移植手術(shù)、白血病等重癥免疫受損患者死亡的主要原因，病死率高達(dá)60%～100%[1-3].目前，治療深部曲霉感染的臨床應(yīng)用一線藥物是三唑類抗真菌藥物(trizoles)，如伊曲康唑(itraconazole)、伏立康唑(voriconazole)和泊沙康唑(posaconazole)[3-4].唑類藥物通過與麥角固醇合成途徑中的關(guān)鍵酶細(xì)胞色素P450羊毛甾醇14α-脫甲基酶(Erg11A/Cyp51A基因編碼)結(jié)合，以抑制麥角固醇的合成并造成毒性固醇中間體的積累，從而抑制真菌的生長(zhǎng)[5].然而，研究發(fā)現(xiàn)越來越多的臨床分離菌對(duì)唑類藥物會(huì)產(chǎn)生耐藥性[6-7].因此，煙曲霉的耐藥機(jī)制已經(jīng)成為當(dāng)前研究的一個(gè)重要領(lǐng)域.

本實(shí)驗(yàn)室前期建立了以根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的T-DNA(Transfer DNA)隨機(jī)插入的煙曲霉突變菌株庫(kù)，其中編號(hào)為T478號(hào)的煙曲霉菌株對(duì)伊曲康唑耐藥.本研究以T478號(hào)菌株為出發(fā)菌株，利用Tail-PCR技術(shù)擴(kuò)增該突變體中被T-DNA破壞的基因片段，并通過測(cè)序鑒定到該突變基因，進(jìn)一步利用基因敲除技術(shù)在野生型菌株中敲除該基因，以觀察驗(yàn)證該基因是否參與對(duì)伊曲康唑耐受性的調(diào)控.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

煙曲霉野生型菌株A1160來自FGSC(http://www.fgsc.net/)，A1160c野生型對(duì)照菌株來自本實(shí)驗(yàn)室菌庫(kù)，pim1插入突變菌株(T478)和敲除菌株(Δpim1)為本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建.本研究所用培養(yǎng)基為YAG豐富培養(yǎng)基(每升含酵母粉5 g、葡萄糖20 g、微量元素Trace elements 1 mL，固體培養(yǎng)基需加入2%瓊脂粉)和YUU培養(yǎng)基(在YAG豐富培養(yǎng)基中再添加1.1 g/L尿苷Uridine和1.2 g/L尿嘧啶Uracil).Trace elements的配方：每升含ZnSO4·7H2O 22 g、H3BO311 g、MnCl2·4H2O 5 g、FeSO4·7H2O 5 g、CoCl2·5H2O 1.6 g、CuSO4·5H2O 1.6 g、(NH4)6MO7O24·4H2O 1.1 g、EDTA 50 g，加熱并用KOH調(diào)節(jié)pH至6.5～6.8.本研究菌株的培養(yǎng)條件為37 ℃下培養(yǎng)48 h.

主要試劑：酵母抽提物(Yeast Extract)購(gòu)自O(shè)xiod公司(英國(guó))；葡萄糖購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司(中國(guó))；各種無機(jī)鹽購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)試劑化學(xué)有限公司(中國(guó))；DMSO購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(中國(guó))；伊曲康唑ITC購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司(中國(guó)).本實(shí)驗(yàn)用到的試劑均為粉末，純度>99%.分子生物學(xué)PCR和Tail-PCR相關(guān)試劑購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司(中國(guó)).

1.2 Tail-PCR

TAIL-PCR，即交錯(cuò)式熱不對(duì)稱PCR或巢氏PCR：設(shè)計(jì)3個(gè)嵌套的特異性引物(pPK2-RB1、pPK2-RB2、pPK2-RB3)分別與簡(jiǎn)并引物(AD1、AD2、AD3和AD4)組合進(jìn)行連續(xù)的PCR循環(huán)(表1)，利用不同的退火溫度選擇性地?cái)U(kuò)增目標(biāo)片段，一般通過3次巢式PCR反應(yīng)即可獲取已知序列的側(cè)翼序列，所獲得的片段可通過測(cè)序得到被插入破壞的基因序列.

1.3 基因敲除

本研究采用PCR方法擴(kuò)增,用于轉(zhuǎn)化入菌株的DNA片段.其中，引物Pim1 P1和Pim1 P3擴(kuò)增pim1基因的上游同源臂，引物Pim1 P4和Pim1 P6擴(kuò)增pim1基因的下游同源臂，引物Pim1 P2和Pim1 P5將上下游同源臂片段和篩選標(biāo)記基因進(jìn)行整合.本研究使用的所有引物見表1，均由金斯瑞生物科技股份有限公司(中國(guó))合成.

表1 本研究所用引物

2 結(jié) 果

2.1 伊曲康唑耐藥突變菌株T478號(hào)的篩選

本研究前期以野生型親本A293為出發(fā)菌株，建立了一個(gè)大于2 000株根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA隨機(jī)插入的煙曲霉突變菌株庫(kù)，并利用瓊脂稀釋法對(duì)該突變菌株庫(kù)中的菌株進(jìn)行了伊曲康唑的耐藥篩查，最終得到8株伊曲康唑耐藥菌株.本文從8株伊曲康唑耐藥菌株中選取1株比較典型的T478號(hào)菌株作為出發(fā)菌株.如圖1所示,在正常的培養(yǎng)條件下，T478號(hào)菌株的菌落直徑比其野生型親本Af293要小，但經(jīng)伊曲康唑處理后，其菌落直徑明顯大于野生型菌株，表明T478號(hào)菌株對(duì)伊曲康唑耐藥.

圖1 伊曲康唑耐藥T478號(hào)菌株Fig.1 Itraconazole-resistant T478 strains

2.2 T478號(hào)菌株突變基因的鑒定

將T478號(hào)菌株作為候選目標(biāo)菌株，設(shè)計(jì)引物利用Tail-PCR技術(shù)對(duì)T478號(hào)菌株基因組上T-DNA的側(cè)翼序列進(jìn)行分離測(cè)序鑒定，結(jié)果在該菌株的基因組中，T-DNA左臂的側(cè)翼序列擴(kuò)增測(cè)序未得到目的基因，而T-DNA右臂的側(cè)翼序列擴(kuò)增測(cè)序得到一個(gè)未被研究的新基因，該基因的登錄號(hào)為locus_tag="AFUA_2G11740".圖2為T-DNA右臂的插入模式：插入到AFUA_2G11740基因開放閱讀框內(nèi)的一個(gè)外顯子區(qū)域內(nèi)，即插入到從起始密碼子開始的第1 586個(gè)堿基處.因此，推測(cè)T478號(hào)菌株對(duì)伊曲康唑耐藥可能與該基因功能被破壞存在密切關(guān)系.

據(jù)研究報(bào)道，該基因在酵母菌中的同源蛋白被預(yù)測(cè)為線粒體絲氨酸蛋白酶Pim1(mitochondrial serine protease Pim1, putative).Pim1蛋白酶是存在于酵母菌線粒體基質(zhì)中的Lon類蛋白酶的另一種命名(Pim1 refers to mitochondrial ATP-dependent protease protein).

注：斜體字母為T-DNA右邊界序列,斜體字母和粗體GA為T-DNA 右邊界斷裂位點(diǎn),帶有下劃線的字母為基因AFUA_2G11740的片段.圖2 T478號(hào)菌株的T-DNA插入模式推測(cè)圖Fig.2 Speculative diagram of T-DNA insertion pattern of strain T478

注：(a)為左(泳道2)右(泳道3)同源臂和中間的pyr4片段(泳道1)， (b)為融合的全長(zhǎng)片段(泳道1).圖3 pim1基因敲除的融合片段電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of pim1 knockout fusion fragment

2.3 Δpim1菌株的構(gòu)建

本文通過融合PCR技術(shù)，根據(jù)同源重組替換目的基因的原理構(gòu)建煙曲霉pim1敲除菌株.首先用引物Pim1 P1/P3和Pim1 P4/P6分別擴(kuò)增長(zhǎng)度約為0.8 kb的pim1基因上下游同源臂，然后用引物pyr4 F/R從質(zhì)粒pAL5上擴(kuò)增2.2 kb篩選標(biāo)記pyr4基因(圖3(a))，再將上述3個(gè)片段混合作為模板，用引物Pim1 P2/P5將左同源臂、篩選標(biāo)記和右同源臂整合成一個(gè)3.9 kb的融合片段(圖3(b))，最后將融合片段轉(zhuǎn)入野生型A1160菌株的細(xì)胞中，經(jīng)基因同源重組后，pim1基因被pyr4基因替換，在篩選培養(yǎng)基上得到煙曲霉pim1缺失的敲除菌株.

2.4 Δpim1菌株耐藥表型的驗(yàn)證

前期研究發(fā)現(xiàn)，pim1基因被T-DNA插入破壞后會(huì)導(dǎo)致突變菌株對(duì)唑類藥物耐藥.由圖4可以看出，在正常情況下，野生型菌株的菌落直徑大于Δpim1基因敲除菌株，當(dāng)加入0.5 μg/mL伊曲康唑后，野生型菌株生長(zhǎng)明顯受到抑制，Δpim1基因敲除菌株的菌落直徑遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于野生型菌株.由此表明，Δpim1基因敲除菌株具有與T478號(hào)菌株相同的耐藥表型，這進(jìn)一步證實(shí)了前期菌株篩選和基因分離鑒定的準(zhǔn)確性，也驗(yàn)證了pim1基因參與煙曲霉耐藥功能的調(diào)控.

圖4 Δpim1對(duì)唑類藥物耐藥的菌落表型Fig.4 Colony phenotypes of Δpim1 resistant to azole drugs

3 討 論

本文從T-DNA隨機(jī)插入的煙曲霉突變菌株庫(kù)中篩選出T478號(hào)耐唑類藥物突變菌株，并通過Tail-PCR技術(shù)鑒定到一個(gè)煙曲霉新基因pim1.為驗(yàn)證pim1基因的缺失是否與煙曲霉的耐藥性存在直接關(guān)系，本研究在煙曲霉野生型親本A1160株中敲除pim1基因，獲得了Δpim1敲除菌株，并通過菌落表型鑒定發(fā)現(xiàn)，Δpim1具有與突變菌T478號(hào)相同的耐伊曲康唑表型.后期進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，pim1基因的缺失并沒有引起對(duì)棘白菌素類藥物卡泊芬凈的耐受，僅表現(xiàn)為對(duì)伊曲康唑耐藥.

Lon類蛋白酶的基因名稱最早來自大腸桿菌Lon基因的突變表型(These mutants tend to grow in long forms)，該表型是由細(xì)菌在紫外線照射后形成的不分裂的長(zhǎng)線狀結(jié)構(gòu)[8].Lon蛋白酶在原核生物的胞質(zhì)及真核生物的線粒體中都高度保守，在高溫、缺氧、損傷等應(yīng)激情況下，Lon蛋白酶都呈高表達(dá).許多研究表明，Lon蛋白酶定位于線粒體基質(zhì)中參與線粒體DNA代謝,以維持前體mRNA穩(wěn)定性，能夠通過介導(dǎo)異?；驌p傷的蛋白和短暫調(diào)控蛋白的降解來維持細(xì)胞線粒體的正常生理功能和細(xì)胞自身的體內(nèi)平衡[9].它也是一種分子伴侶，參與線粒體蛋白的折疊和去折疊[10].關(guān)于煙曲霉耐藥的最新研究發(fā)現(xiàn)，線粒體呼吸鏈復(fù)合體結(jié)構(gòu)中的Cox10蛋白突變后，線粒體有氧呼吸能力減弱，同時(shí)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)鈣離子震蕩，鈣離子信號(hào)通路被激活，并進(jìn)一步激活下游細(xì)胞壁整合通路和藥物外排泵基因表達(dá)，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)唑類藥物耐受.因此，推測(cè)Pim1蛋白在煙曲霉中參與唑類藥物耐受的調(diào)控可能是通過類似Cox10的作用機(jī)制實(shí)現(xiàn)的，后期可圍繞該蛋白對(duì)線粒體功能的影響展開研究.

目前，人們對(duì)臨床菌株耐藥機(jī)制的認(rèn)知還很淺，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)臨床上分離的耐藥菌株存在多種未知機(jī)制，而絲狀真菌中pim1基因參與耐藥調(diào)控的功能還沒有被研究，后期的研究可利用成功構(gòu)建的Δpim1菌株，進(jìn)一步深入研究pim1在煙曲霉細(xì)胞中參與唑類藥物耐藥的分子調(diào)控機(jī)制，為理解和控制真菌的耐藥性提供依據(jù).