劉長(zhǎng)江 王光花 李偉龍 徐杭忠 李 虹 翟旭亮 薛 洋 劉天驥 李洪琴 劉 匆 羅 莉**

(1.西南大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；2.四川新希望六和科技創(chuàng)新有限公司，成都 610000；3.重慶市水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，重慶 400400)

紫蘇(Perillafrutescens)又名赤蘇、紅蘇，系唇形科1年生草本植物，廣泛分布于我國(guó)浙江、四川、貴州、安徽及廣東等多個(gè)省份，至今已有2 000多年的種植歷史，是國(guó)家衛(wèi)生部首批頒布的“藥食同源”的60種物種之一，富含揮發(fā)油、酚酸及黃酮類等生物活性成分。紫蘇餅是紫蘇籽榨油后的副產(chǎn)物，其中殘余了許多紫蘇籽中的活性物質(zhì)，如木屑草素、迷迭香酸和亞麻油等，具有抗氧化、抑菌、抗炎等功能，且硫苷和棉酚等抗?fàn)I養(yǎng)因子極少，經(jīng)微生物發(fā)酵后，大分子蛋白質(zhì)降解為小分子多肽，易被機(jī)體消化吸收。且發(fā)酵過程中產(chǎn)生的益生菌、乳酸及未知生長(zhǎng)因子等能有效維護(hù)機(jī)體健康。

大鯢(Andriasdavidianus)是我國(guó)二級(jí)保護(hù)動(dòng)物。目前，大鯢人工養(yǎng)殖過程中常以冰鮮為主要餌料，易引發(fā)大鯢胃腸、肝臟等消化道疾病和病毒性疾病等，造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究團(tuán)隊(duì)基于大鯢產(chǎn)業(yè)中面臨的問題，經(jīng)多年研究，創(chuàng)制大鯢飼料并示范成功[1-2]。

基于此，為進(jìn)一步優(yōu)化飼料配方，促進(jìn)大鯢配合飼料的優(yōu)質(zhì)高效綠色化，提高抗病能力，同時(shí)推廣藥食性資源的利用，本試驗(yàn)以大鯢為研究對(duì)象，探討紫蘇餅和發(fā)酵紫蘇餅對(duì)大鯢生長(zhǎng)性能、消化道結(jié)構(gòu)功能、免疫及脂質(zhì)代謝部分指標(biāo)的影響，為紫蘇餅在大鯢配合飼料中的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所需大鯢(陜西種，子2代)購(gòu)買于陜西省漢中市綠源大鯢養(yǎng)殖場(chǎng)；紫蘇餅由忠縣湘楠農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供，其余原料均由重慶新希望飼料有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)飼料

根據(jù)大鯢的營(yíng)養(yǎng)需求，配合飼料以魚粉、雞肉粉和魚油等為原料配制，對(duì)照組飼喂配合飼料，微調(diào)配方，分別添加5.0%的紫蘇餅(紫蘇餅組)和發(fā)酵紫蘇餅(發(fā)酵紫蘇餅組)(發(fā)酵紫蘇餅利用乳酸菌、酵母菌和芽孢桿菌復(fù)合菌種發(fā)酵而來，試驗(yàn)開展前已篩選出適宜的發(fā)酵比例及條件，發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)成分變化見表1)，配制成3種等氮等脂的試驗(yàn)飼料。試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表2。

表1 紫蘇餅發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)成分變化(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Changes in nutritional components of perilla cake before and after fermentation (DM basis)

續(xù)表2項(xiàng)目 Items對(duì)照組Control group紫蘇餅組Perilla cake group發(fā)酵紫蘇餅組Fermented perilla cake group紫蘇餅 Perilla cake5.00發(fā)酵紫蘇餅 Fermented perilla cake5.00復(fù)合蛋白粉 Compound protein powder1)16.6014.5514.05α-預(yù)糊化淀粉 α-pregelatinized starch10.8010.8010.80魚油 Fish oil5.004.154.15磷酸二氫鈣 Ca(H2PO4)21.501.501.50羧甲基纖維素鈉 Sodium carboxymethyl cellulose0.500.500.50預(yù)混料 Premix2)4.424.424.42膨潤(rùn)土 Bentonite0.880.070.43微晶纖維素 Microcrystalline cellulose1.300.010.15合計(jì) Total100.00100.00100.00營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ)) Nutrient levels (DM basis)3)粗蛋白質(zhì) CP56.70 56.9656.73粗脂肪 EE11.62 11.69 11.60 粗灰分 Ash13.08 12.26 12.66

表2 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 2 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) %

1.3 飼養(yǎng)管理

正式試驗(yàn)前，先將大鯢以對(duì)照組飼料馴食15 d。馴食完成后，選擇96尾初始體質(zhì)量為(54.14±0.17) g的健康大鯢，隨機(jī)分為3組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8尾，飼養(yǎng)于西南大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院大鯢養(yǎng)殖系統(tǒng)中，單口藍(lán)色箱子規(guī)格：70 cm×45 cm×17.5 cm，水深5 cm，水源為曝氣自來水，每天早、晚各100%換水1次。因大鯢消化食物時(shí)間較長(zhǎng)，故連續(xù)投喂2 d(17:30)后停食1 d。投喂3 h后撈取殘餌，收集到殘餌杯。正式飼喂試驗(yàn)時(shí)間105 d，期間無光照，利用空調(diào)維持水溫22～25 ℃，溶解氧含量>6.0 mg/L，總氨氮含量<0.10 mg/L，亞硝酸鹽含量<0.01 mg/L，pH 6.5～7.5。

1.4 樣品采集

大鯢養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后饑餓72 h，每組每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取6尾大鯢用適量MS-222麻醉，稱重后用1 mL的1次性無菌注射器在尾靜脈處取血，4 500 r/min離心10 min制備血漿放入液氮罐中速凍后，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱內(nèi)保存，用于血漿生化指標(biāo)測(cè)定。后將大鯢于冰上解剖，取出完整內(nèi)臟團(tuán)和肝臟，分離胃、腸道和背部肌肉樣品，液氮速凍后，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

a：對(duì)照組小腸(40×)：b：紫蘇餅組小腸(40×)：c：發(fā)酵紫蘇餅組小腸(40×)；d：對(duì)照組小腸(100×)；e：紫蘇餅組小腸(100×)；f：發(fā)酵紫蘇餅組小腸(100×)。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

生長(zhǎng)指標(biāo)：養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，停食72 h(確保其空腸)，準(zhǔn)確稱量各組大鯢體質(zhì)量、飼料質(zhì)量及殘餌重，計(jì)算公式如下：

增重率(weight gain rate, WGR, %)=
100×(Wt-W0)/W0；
特定生長(zhǎng)率(specific gain rate, SGR, %/d)=
100×(lnWt-lnW0)/D；
飼料系數(shù)(feed conversion rate, FCR)=
F/(Wt-W0)；
存活率(survival rate，%)=100×Nt/N0。

式中:W0為初始尾均重(g)；Wt為終末尾均重(g)；D為養(yǎng)殖試驗(yàn)天數(shù)；F為尾均干物質(zhì)攝食量(g)；N0為初始尾數(shù)；Nt為終末尾數(shù)。

試驗(yàn)飼料及肌肉常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定：水分含量測(cè)定采用105 ℃烘箱干燥法(GB/T 6435—2006)，粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用凱氏定氮法(GB/T 6432—1994)，粗脂肪含量測(cè)定采用索氏抽提法(GB/T 6433—1994)。

血漿和組織生化指標(biāo)的測(cè)定：胃中胃蛋白酶、氫鉀ATP酶(H+-K+-ATP酶)活性；腸道胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、鈉鉀ATP酶(Na+-K+-ATP酶)活性;肝臟和腸道總抗氧化能力(T-AOC)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和丙二醛(MDA)含量；血漿二胺氧化酶(DAO)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性及內(nèi)毒素(ET)、D-乳酸(D-LA)、免疫球蛋白M(IgM)、一氧化氮(NO)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量分別采用南京建成生物工程研究所試劑盒或上海優(yōu)選生物科技有限公司酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

腸道石蠟組織切片：由武漢塞維爾生物科技有限公司代制，切片為蘇木精-伊紅(HE)染色，用MIPlus07測(cè)量腸道絨毛高度、數(shù)量和空腔面積。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)。用Duncan氏多重比較法分析組間差異顯著性程度，顯著水平為P<0.05。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)形式表示。

2 結(jié) 果

2.1 紫蘇餅與發(fā)酵紫蘇餅對(duì)大鯢生長(zhǎng)性能和飼料利用的影響

大鯢FBW、WGR和SGR趨勢(shì)均為發(fā)酵紫蘇餅組顯著高于對(duì)照組和紫蘇餅組(P<0.05)，且紫蘇餅組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；FCR和存活率各組間差異不顯著(P>0.05)(表3)。

表3 紫蘇餅與發(fā)酵紫蘇餅對(duì)大鯢生長(zhǎng)性能及飼料利用的影響Table 3 Effects of perilla cake and fermented perilla cake on growth performance and feed utilization of Andrias davidianus (n=4)

2.2 紫蘇餅與發(fā)酵紫蘇餅對(duì)大鯢胃消化吸收能力的影響

發(fā)酵紫蘇餅組胃中胃蛋白酶和H+-K+-ATP酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，較對(duì)照組分別提高了27.40%和29.96%；紫蘇餅組胃H+-K+-ATP酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，較對(duì)照組提高了19.33%(表4)。

表4 紫蘇餅與發(fā)酵紫蘇餅對(duì)大鯢胃消化吸收能力的影響Table 4 Effects of perilla cake and fermented perilla cake on stomach digestion and absorption capacity of Andrias davidianus (n=4) U/mg

2.3 紫蘇餅與發(fā)酵紫蘇餅對(duì)大鯢腸消化吸收和屏障功能的影響

發(fā)酵紫蘇餅組腸道脂肪酶和淀粉酶活性均顯著高于紫蘇餅組和對(duì)照組(P<0.05)，其中，脂肪酶活性較對(duì)照組提高了68.38%，淀粉酶活性比紫蘇餅組和對(duì)照組分別提高了21.62%和150.00%；腸道胰蛋白酶和Na+-K+-ATP酶活性均在紫蘇餅組出現(xiàn)最大值，其中胰蛋白酶活性顯著高于其余2組(P<0.05)，且較對(duì)照組提高了102.37%，腸道Na+-K+-ATP酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但與發(fā)酵紫蘇餅組相比差異不顯著(P>0.05)；血漿DAO活性、ET和D-LA含量均在發(fā)酵紫蘇餅組出現(xiàn)最小值，發(fā)酵紫蘇餅組血漿DAO活性和D-LA含量與紫蘇餅組相比差異不顯著(P>0.05)，但均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)且較對(duì)照組分別降低了42.79%和113.52%，而血漿ET含量顯著低于紫蘇餅組和對(duì)照組(P<0.05)(表5)。

表5 紫蘇餅與發(fā)酵紫蘇餅對(duì)大鯢腸道消化吸收能力和屏障功能的影響Table 5 Effects of perilla cake and fermented perilla cake on digestion and absorption capacity and intestinal barrier function of Andrias davidianus (n=4)

2.4 紫蘇餅與發(fā)酵紫蘇餅對(duì)大鯢腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)照組和紫蘇餅組、發(fā)酵紫蘇餅組的絨毛數(shù)量和絨毛高度無顯著差異(P>0.05)；發(fā)酵紫蘇餅組大鯢腸道空腔率顯著低于其他2組，較對(duì)照組降低了40.38%(P<0.05)(表6和圖1)。

表6 紫蘇餅與發(fā)酵紫蘇餅對(duì)大鯢腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Table 6 Effects of perilla cake and fermented perilla cake on intestinal structure of Andrias davidianus (n=4)

2.5 紫蘇餅與發(fā)酵紫蘇餅對(duì)大鯢肝臟和腸道抗氧化能力的影響

在肝臟中，發(fā)酵紫蘇餅組T-AOC顯著高于其余2組(P<0.05)，T-SOD活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但與紫蘇餅組差異不顯著(P>0.05)；在腸道中，紫蘇餅組T-AOC顯著高于發(fā)酵紫蘇餅組和對(duì)照組(P<0.05)；發(fā)酵紫蘇餅組T-SOD活性出現(xiàn)最大值，并顯著高于其余2組(P<0.05)；MDA含量為發(fā)酵紫蘇餅組<紫蘇餅組<對(duì)照組，3組間差異顯著(P<0.05)(表7)。

表7 紫蘇餅與發(fā)酵紫蘇餅對(duì)大鯢肝臟和腸道抗氧化能力的影響Table 7 Effects of perilla cake and fermented perilla cake on liver and gut intestinal antioxidant of Andrias davidianus (n=4)

2.6 紫蘇餅與發(fā)酵紫蘇餅對(duì)大鯢免疫和肝功能指標(biāo)的影響

紫蘇餅組血漿IgM含量與發(fā)酵紫蘇餅組差異不顯著(P>0.05)，但均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)且紫蘇餅組較對(duì)照組提高了31.48%；血漿NO含量和AST活性各組間差異不顯著(P>0.05)；發(fā)酵紫蘇餅組血漿ALT活性顯著低于其余2組(P<0.05)(表8)。

表8 紫蘇餅與發(fā)酵紫蘇餅對(duì)大鯢免疫和肝功能指標(biāo)的影響Table 8 Effects of perilla cake and fermented perilla cake on immunity and liver function indexes of Andrias davidianus (n=4)

2.7 紫蘇餅與發(fā)酵紫蘇餅對(duì)大鯢脂質(zhì)代謝部分指標(biāo)的影響

血漿TC和TG含量均在發(fā)酵紫蘇餅組出現(xiàn)最小值，且均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；各組血漿HDL-C含量差異不顯著(P>0.05)；紫蘇餅組血漿LDL-C含量與發(fā)酵紫蘇餅組差異不顯著(P>0.05)，但均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(表9)。

表9 紫蘇餅與發(fā)酵紫蘇餅對(duì)大鯢脂質(zhì)代謝部分指標(biāo)的影響Table 9 Effects of perilla cake and fermented perilla cake on some lipid metabolism indexes of Andrias davidianus (n=4) mmol/L

3 討 論

3.1 紫蘇餅和發(fā)酵紫蘇餅提高了大鯢生長(zhǎng)性能

紫蘇類原料因富含黃酮類、酚酸類等活性成分，對(duì)促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、改善肉質(zhì)有一定效果，這在小鼠[4]、肉雞[5]等動(dòng)物的試驗(yàn)中已得到證實(shí)。本試驗(yàn)所采用紫蘇餅是紫蘇籽榨油后的副產(chǎn)物，其中殘余了許多紫蘇籽中的活性物質(zhì)，如木屑草素、迷迭香酸和亞麻油等，具有抗氧化、抑菌、抗炎等功能。發(fā)酵紫蘇餅是利用復(fù)合菌種發(fā)酵而來的，富含有益菌、乳酸、小肽及多種促生長(zhǎng)因子。本研究表明，紫蘇餅和發(fā)酵紫蘇餅均促進(jìn)大鯢的生長(zhǎng)性能，其中發(fā)酵紫蘇餅促進(jìn)效果更佳，與發(fā)酵工藝的產(chǎn)物相關(guān)，具體單一功能成分和復(fù)合功能成分組合有待進(jìn)一步探討。

3.2 紫蘇餅和發(fā)酵紫蘇餅改善了大鯢胃腸功能

大量營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究表明，飼料成分會(huì)影響消化酶活性[6-7]。胃H+-K+-ATP酶是胃酸分泌的關(guān)鍵酶，Na+-K+-ATP酶則與腸道的吸收能力呈正相關(guān)，胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶是消化三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要酶,DAO、ET和D-LA活性三者均能評(píng)價(jià)腸道屏障功能，本研究中，可能是因?yàn)樽咸K餅中的多種天然活性物質(zhì)及發(fā)酵加入的有益菌具有改善胃腸內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)胃腸組織生長(zhǎng)發(fā)育的作用，大鯢胃腸消化吸收功能及腸道屏障功能在發(fā)酵紫蘇餅組及紫蘇餅組有較大提升，其中發(fā)酵紫蘇餅經(jīng)過發(fā)酵后，硫苷等抗?fàn)I養(yǎng)因子及有害物質(zhì)減少，且富含有機(jī)酸、可溶性肽、氨基酸等小分子物質(zhì)，添加后效果更佳。

3.3 紫蘇餅和發(fā)酵紫蘇餅提高了大鯢抗氧化能力

紫蘇屬植物富含酚酸、黃酮類抗氧化活性物質(zhì)，其抗氧化功效得到了中外學(xué)者的廣泛關(guān)注[8]。SOD活性、T-AOC和MDA含量可以綜合評(píng)價(jià)機(jī)體的抗氧化能力，本試驗(yàn)中采用的紫蘇餅經(jīng)發(fā)酵后，紫蘇餅中多糖、脂肪和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)會(huì)被降解，生成有機(jī)酸、可溶性肽、氨基酸等小分子物質(zhì)，紫蘇餅中富含的活性物質(zhì)可以更好地在機(jī)體內(nèi)釋放，用以清除各種氧化自由基。所以本研究發(fā)現(xiàn)，大鯢的腸肝抗氧化能力總體趨勢(shì)表現(xiàn)為“發(fā)酵紫蘇餅組>紫蘇餅組>對(duì)照組”。因此，可得出紫蘇餅和發(fā)酵紫蘇餅均具有提高大鯢對(duì)有氧代謝過程產(chǎn)生的超氧陰離子自由基的清除能力，這種自由基可侵犯細(xì)胞膜、血管壁、蛋白質(zhì)、脂肪，甚至細(xì)胞核中的DNA。也有助于實(shí)現(xiàn)氧化與抗氧化系統(tǒng)達(dá)到平衡，促進(jìn)細(xì)胞在受到各種有害刺激時(shí)的損傷后的修復(fù)，從而有益于腸肝的健康。

3.4 紫蘇餅和發(fā)酵紫蘇餅提高了大鯢肝臟和免疫功能

紫蘇籽中含有豐富的α-亞麻酸、紫蘇醛、木犀草素和迷迭香酸等活性成分，這些活性成分在提高機(jī)體免疫力，降低脂質(zhì)過氧化及保護(hù)肝臟方面效果顯著[9-12]。宋代軍等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在肉仔雞基礎(chǔ)飼糧中添加紫蘇籽提取物可以顯著增強(qiáng)肉仔雞的免疫能力，并推測(cè)與紫蘇籽提取物中多種活性成分密切相關(guān)。而紫蘇餅是紫蘇籽榨油后的副產(chǎn)物，紫蘇籽中多種活性成分殘余至其中。本試驗(yàn)中，紫蘇餅和發(fā)酵紫蘇餅添加后大鯢血漿IgM含量有顯著提升，轉(zhuǎn)氨酶活性顯著降低，NO(氮自由基)含量差異不顯著。這說明紫蘇餅對(duì)大鯢同樣具有提高特異性免疫力，維護(hù)肝臟健康的作用。

3.5 紫蘇餅和發(fā)酵紫蘇餅優(yōu)化了大鯢脂質(zhì)代謝部分指標(biāo)

動(dòng)物機(jī)體脂質(zhì)代謝的紊亂對(duì)機(jī)體健康存在巨大威脅。中醫(yī)藥學(xué)方面的研究已證實(shí)，紫蘇餅中富含的黃酮類化合物具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的能力[14]。本試驗(yàn)中，紫蘇餅組和發(fā)酵紫蘇餅組的大鯢血漿TC、TG和LDL-C含量顯著降低，脂質(zhì)代謝狀況得到明顯改善。這說明在大鯢飼料中添加適量紫蘇餅，可減少膽固醇在血管中的積累，提高鯢體健康水平。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下，飼料中添加5%的紫蘇餅或發(fā)酵紫蘇餅?zāi)艽龠M(jìn)大鯢生長(zhǎng)性能，且發(fā)酵紫蘇餅的綜合效果優(yōu)于紫蘇餅。二者均具有增強(qiáng)胃腸消化吸收能力及腸道屏障功能，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化、免疫能力和降低膽固醇的作用。