朱佳文 徐麒麟,2 蘇志鵬 劉瀚揚(yáng) 陳亞迎 葉思齊 楊 雪 雷春龍 鄭江蓉 許禎瑩*

(1.成都市農(nóng)林科學(xué)院，成都 611130；2.樂山市市中區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，樂山 614000；3.四川德康農(nóng)牧食品集團(tuán)股份有限公司，成都 610200；4.西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，重慶 400700)

新生仔豬由于免疫系統(tǒng)不成熟，很容易受到感染。飼喂新生仔豬益生菌可以對(duì)仔豬腸道菌群發(fā)育及其免疫系統(tǒng)產(chǎn)生短期或長(zhǎng)期的影響，從而引起仔豬生長(zhǎng)和免疫性能的改變。新生仔豬的腸道菌群最初是由母豬和周圍環(huán)境建立。腸道菌群對(duì)動(dòng)物的免疫性能非常重要，而益生菌作為飼料添加劑不僅可以促進(jìn)宿主腸道微生物的平衡[1]，還可以通過占據(jù)腸道微生物的結(jié)合位點(diǎn)或通過釋放有機(jī)酸或產(chǎn)生抗生素樣化合物來抵抗有害菌群的定植[2]。飼喂母豬益生菌可以提高母豬產(chǎn)仔數(shù)、體重以及降低腹瀉率[3]。Hayakawa等[4]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂母豬和仔豬益生菌可以提高母豬繁殖性能，降低斷奶后仔豬腹瀉發(fā)生率和改善腸道組織病理變化。動(dòng)物飼糧中常常添加乳酸菌作為益生菌來提高動(dòng)物生產(chǎn)水平。研究表明，植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)能顯著抑制大腸桿菌和沙門氏菌生長(zhǎng)，促進(jìn)斷奶仔豬小腸絨毛發(fā)育，改善腸道形態(tài)，提高斷奶仔豬平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化率[5]。乳酸菌還能影響機(jī)體的免疫性能，機(jī)體抗氧化能力及免疫性能與功能性的德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)、唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)、Lactobacillusformicilis、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)和黏膜乳桿菌(Lactobacillusmucosae)呈正相關(guān)，而與敏捷乳桿菌(Lactobacillusagilis)和龐氏乳桿菌(Lactobacilluspontis)呈負(fù)相關(guān)，添加乳酸菌復(fù)合物可以優(yōu)化仔豬腸道菌群組成，減輕斷奶應(yīng)激，提高生長(zhǎng)性能[6]。然而，關(guān)于鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)作為益生菌添加到早期斷奶仔豬飼糧中的報(bào)道還非常少。因此，本研究旨在研究飼糧中添加鼠李糖乳桿菌對(duì)早期斷奶成華黑仔豬生長(zhǎng)性能、免疫性能和腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株、動(dòng)物和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究使用的鼠李糖乳桿菌為商品化益生菌，活菌數(shù)為5×1011CFU/g。仔豬(成華黑豬，本地品種)來自四川省成都市邛崍市嘉林生態(tài)農(nóng)場(chǎng)。試驗(yàn)選用32頭體重為(7.54±0.19) kg的28日齡斷奶成華黑仔豬，隨機(jī)分為2組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4頭仔豬。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1；鼠李糖乳桿菌組在基礎(chǔ)飼糧中添加5.56 mg/kg鼠李糖乳桿菌，使每千克飼糧活菌數(shù)達(dá)到2.78×109CFU。仔豬飼養(yǎng)在完全封閉的豬圈內(nèi)，自由采食。根據(jù)豬場(chǎng)的日常操作，正常進(jìn)行免疫、驅(qū)蟲、消毒和管理等程序。試驗(yàn)預(yù)試期7 d，正試期28 d。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

1.2 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.2.1 生長(zhǎng)性能指標(biāo)

在試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)對(duì)仔豬進(jìn)行稱重，整個(gè)試驗(yàn)期間記錄采食量，計(jì)算平均日增重、平均日采食量和肉料比。

1.2.2 免疫性能指標(biāo)

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，采用前腔靜脈采血法用真空管收集對(duì)照組和鼠李糖乳桿菌組所有仔豬血液10 mL，3 000 r/min離心15 min，收集上清液并儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱中。血清生化指標(biāo)：血清總蛋白(TP)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和葡萄糖(GLU)含量采用購(gòu)自南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定。血清抗氧化指標(biāo)：血清超氧化物歧化酶(SOD)活性和總抗氧化能力(T-AOC)采用購(gòu)自北京奇松生物科技有限公司的試劑盒測(cè)定，過氧化氫酶(CAT)活性采用購(gòu)自南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定。血清免疫指標(biāo)：血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、補(bǔ)體3(C3)、干擾素-γ(IFN-γ)和免疫球蛋白G(IgG)含量采用購(gòu)自北京奇松生物科技有限公司的試劑盒測(cè)定。測(cè)定方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 盲腸內(nèi)容物樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)重復(fù)任意選取2頭仔豬，注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg BW)麻醉后處死。用75%酒精擦拭所需腸道后結(jié)扎盲腸，將盲腸內(nèi)容物擠入5 mL無菌EP管中，封口后立即放入液氮中。盲腸內(nèi)容物樣品小心轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室在-80 ℃冰箱中保存，用于后續(xù)腸道菌群分析。

1.2.4 腸道菌群16S rDNA基因的高通量測(cè)序

仔豬盲腸內(nèi)容物樣品送到上海融享生物科技有限公司進(jìn)行微生物多樣性分析。提取仔豬盲腸內(nèi)容物總DNA后，用V3～V4引物擴(kuò)增16S rDNA保守區(qū)域，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測(cè)序文庫(kù)。建好的文庫(kù)先進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫(kù)用Illumina HiSeq 2500進(jìn)行測(cè)序，利用雙末端測(cè)序法，構(gòu)建小片段庫(kù)。通過對(duì)reads拼接過濾，操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)聚類，并進(jìn)行物種注釋及豐度分析，揭示樣品的物種構(gòu)成。序列之間的相似性高于97%定義為1個(gè)OTU，每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)1種代表序列。將具有代表性的OTU序列與微生物參考數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息以及從門到屬水平各樣品的群落組成情況[7]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Student’st檢驗(yàn)進(jìn)行組間數(shù)據(jù)差異顯著性分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠李糖乳桿菌對(duì)早期斷奶成華黑仔豬生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，與對(duì)照組相比，鼠李糖乳桿菌組早期斷奶成華黑仔豬末重和平均日采食量無顯著差異(P>0.05)，平均日增重和肉料比顯著提高(P<0.05)。結(jié)果表明，飼糧添加鼠李糖乳桿菌能夠提高早期斷奶成華黑仔豬的生長(zhǎng)性能。

表2 鼠李糖乳桿菌對(duì)早期斷奶成華黑仔豬生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of Lactobacillus rhamnosus on growth performance of early weaned Chenghua black piglets

2.2 鼠李糖乳桿菌對(duì)早期斷奶成華黑仔豬免疫性能的影響

由表3可知，在血清生化指標(biāo)中，與對(duì)照組相比，鼠李糖乳桿菌組早期斷奶成華黑仔豬血清TP含量極顯著提高(P<0.01)，其他血清生化指標(biāo)無顯著差異(P>0.05)；在血清抗氧化指標(biāo)中，與對(duì)照組相比，鼠李糖乳桿菌組血清CAT和SOD活性極顯著提高(P<0.01)，血清T-AOC顯著提高(P<0.05)；在血清免疫指標(biāo)中，與對(duì)照組相比，鼠李糖乳桿菌組血清TNF-α和IgG含量極顯著提高(P<0.01)，血清IL-2和C3含量顯著提高(P<0.05)，血清IFN-γ含量無顯著差異(P>0.05)。

表3 鼠李糖乳桿菌對(duì)早期斷奶仔豬成華黑仔豬免疫性能的影響Table 3 Effects of Lactobacillus rhamnosus on immune performance of early weaned Chenghua black piglets

2.3 鼠李糖乳桿菌對(duì)早期斷奶成華黑仔豬腸道菌群的影響

為了評(píng)估鼠李糖乳桿菌對(duì)早期斷奶成華黑仔豬腸道菌群的影響，采集對(duì)照組和鼠李糖乳桿菌組63日齡仔豬盲腸內(nèi)容物進(jìn)行測(cè)序分析，共獲得151 919對(duì)reads，經(jīng)過濾后得到119 293 clean tags；每組樣品至少產(chǎn)生26 663 clean tags，平均獲得29 823 clean tags。對(duì)照組和鼠李糖乳桿菌組斷奶仔豬盲腸內(nèi)容物微生物16S rDNA保守片段平均片段長(zhǎng)度分別為467.0和465.5 bp。早期斷奶成華黑仔豬盲腸內(nèi)容物菌群OTU數(shù)目分布情況見圖1。由圖可知，對(duì)照組和鼠李糖乳桿菌組分別包含229和243個(gè)OTU，其中共同OTU數(shù)目為220個(gè)，對(duì)照組特有OTU數(shù)目為9個(gè)，鼠李糖乳桿菌組特有OTU數(shù)目為23個(gè)。

圖1 早期斷奶成華黑仔豬盲腸內(nèi)容物菌群OTU數(shù)目分布情況Fig.1 Distribution of OTU number in cecal contents of early weaned Chenghua black piglets

早期斷奶成華黑仔豬盲腸內(nèi)容物菌群物種分布見圖2。由圖可知，從門水平上分析，厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)3大類細(xì)菌為對(duì)照組和鼠李糖乳桿菌組斷奶仔豬盲腸內(nèi)容物菌群的優(yōu)勢(shì)菌門，且厚壁菌門和擬桿菌門占比最多，變形菌門次之。具體而言，對(duì)照組盲腸內(nèi)容物厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門的相對(duì)豐度分別為45.43%、49.10%和4.47 %，鼠李糖乳桿菌組盲腸內(nèi)容物厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門的相對(duì)豐度分別為45.16%、43.09%和10.47%。由表4可知，從屬水平上分析，對(duì)照組盲腸內(nèi)容物乳桿菌屬(Lactobacillus)、Alloprevotella、普雷沃氏菌屬9(Prevotella_9)和埃希氏菌-志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)的相對(duì)豐度分別為0.18%、6.25%、32.05%和2.11%，而鼠李糖乳桿菌組盲腸內(nèi)容物相應(yīng)菌屬的相對(duì)豐度分別為3.96%、23.71%、14.57%和0.61%，其中鼠李糖乳桿菌組盲腸內(nèi)容物乳桿菌屬和Alloprevotella相對(duì)豐度較對(duì)照組分別增加了3.78和17.46個(gè)百分點(diǎn)，即細(xì)菌相對(duì)數(shù)量分別提高了21.00倍和2.79倍，而普雷沃氏菌屬9和大腸桿菌-志賀氏菌屬相對(duì)豐度較對(duì)照組分別降低了54.54%和70.62%。

表4 早期斷奶成華黑仔豬盲腸內(nèi)容物菌群屬水平差異細(xì)菌的相對(duì)豐度Table 4 Relative abundance of differential bacteria at genus level in cecal contents of early weaned Chenghua black piglets %

Firmicutes：厚壁菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Proteobacteria：變形菌門：Euryarchaeota：廣古菌門；Actinobacteria：放線菌門；Cyanobacteria：藍(lán)藻菌門；Fusobacteria：梭桿菌門；Saccharibacteria：?jiǎn)翁蔷T；Spirochaetae：螺旋菌門；Nitrospinae：硝棘菌門；Peptoclostridium：梭菌屬；Clostridium_sensu_stricto_1：狹義梭菌屬1：Escherichia-Shigella：埃希氏菌-志賀氏菌屬；Prevotella_9：普雷沃氏菌屬9；Phascolarctobacterium：考拉桿菌屬；Lactobacillus：乳桿菌屬；Actinobacillus：放線桿菌屬；Faecalibacterium：糞桿菌屬；Others：其他；Unclassified：未分類。

3 討 論

3.1 鼠李糖乳桿菌對(duì)早期斷奶成華黑仔豬生長(zhǎng)性能和免疫性能的影響

鼠李糖乳桿菌是一種耐胃酸、耐膽汁并能有效定植在人體和動(dòng)物腸道的乳酸菌屬益生菌，因此被應(yīng)用于人和動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、腸胃調(diào)理和腹瀉病的預(yù)防等方面。在畜牧業(yè)中，鼠李糖乳桿菌能夠改善雞的生長(zhǎng)性能和肉品質(zhì)[8]，還能影響健康豬只糞便微生物的組成和功能[9]。在本研究中，飼糧添加鼠李糖乳桿菌顯著提高早期斷奶成華黑仔豬平均日增重和肉料比，說明鼠李糖乳桿菌可以提高斷奶仔豬生長(zhǎng)性能，這與Bocourt等[10]研究發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌能夠提高仔豬平均日增重的結(jié)果一致。同時(shí)，本試驗(yàn)中，飼糧添加鼠李糖乳桿菌顯著提高斷奶仔豬血清TP、TNF-α、IL-2、C3和IgG含量、CAT和SOD活性以及T-AOC，說明鼠李糖乳桿菌可以提高斷奶仔豬的免疫性能。血清TP含量反映了動(dòng)物機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和蛋白質(zhì)利用率，TP含量的升高暗示了蛋白質(zhì)吸收能力增加。血清CAT、SOD活性和T-AOC是血清抗氧化能力的重要指標(biāo)，其在機(jī)體的內(nèi)臟組織器官中發(fā)揮著重要的抗氧化功能，可以清除機(jī)體內(nèi)多余的自由基。有研究報(bào)道，益生菌枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)可以提高機(jī)體抗氧化酶的活性[11]，提高動(dòng)物免疫能力。動(dòng)物的氧化應(yīng)激易引發(fā)消化道疾病，導(dǎo)致動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育緩慢、生產(chǎn)性能低下、飼料轉(zhuǎn)化率降低以及抵抗疾病的能力下降等[12]，而本研究中，上述抗氧化指標(biāo)的增強(qiáng)說明飼喂了添加鼠李糖乳桿菌飼糧的仔豬具有更強(qiáng)的抗氧化能力，更能抵御機(jī)體內(nèi)的有害物質(zhì)。TNF-α是腫瘤壞死因子的一種類型，由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，其作用是刺激T和B淋巴細(xì)胞協(xié)同作用，降低機(jī)體炎癥反應(yīng)，殺死機(jī)體的腫瘤細(xì)胞[13]。本研究中，鼠李糖乳桿菌組斷奶仔豬血清TNF-α含量顯著提高，這與Gastillo等[14]研究發(fā)現(xiàn)新生仔豬口服乳酸菌能夠上調(diào)TNF-α分泌的結(jié)果一致，說明鼠李糖乳桿菌能夠調(diào)控仔豬黏膜抗炎細(xì)胞因子基因的表達(dá)。IL-2由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子等，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力[15]。IgG是血清中主要的抗體成分，補(bǔ)體是存在于人或動(dòng)物體液中的一組與免疫有關(guān)且具有酶活性的球蛋白，C3是補(bǔ)體系統(tǒng)中含量最多、最重要的一個(gè)組分，是補(bǔ)體激活的經(jīng)典途徑、旁路途徑以及甘露聚糖結(jié)合凝集素途徑三者的交匯點(diǎn)，有著重要的生物學(xué)功能，如抗病毒、殺菌以及免疫調(diào)節(jié)作用[16]，本研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌組斷奶仔豬血清IgG和C3含量顯著提高，說明鼠李糖乳桿菌能夠有效提高仔豬機(jī)體免疫性能，對(duì)機(jī)體抵抗外來病菌的侵襲有很好的防御作用。這可能是由于鼠李糖乳桿菌作為抗原進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，刺激腸道，通過抗原遞呈給T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)IL-2釋放，分泌大量IgG來介導(dǎo)體液免疫，使動(dòng)物獲得免疫保護(hù)力。

3.2 鼠李糖乳桿菌對(duì)早期斷奶成華黑仔豬腸道菌群的影響

在本研究中，厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門為對(duì)照組和鼠李糖乳桿菌組早期斷奶成華黑仔豬盲腸內(nèi)容物菌群的優(yōu)勢(shì)菌門。然而，在屬水平上，2組的菌群構(gòu)成發(fā)生了變化，特別是乳桿菌屬、Alloprovotella、普雷沃氏菌屬9和埃希氏菌-志賀氏菌屬，其中，與對(duì)照組相比，鼠李糖乳桿菌組盲腸內(nèi)容物乳桿菌屬相對(duì)豐度明顯提高。近幾年，乳桿菌屬被公認(rèn)為是對(duì)人類和動(dòng)物機(jī)體有益的常用益生菌。斷奶仔豬盲腸內(nèi)容乳桿菌屬相對(duì)豐度提高可能是由于飼糧中添加鼠李糖乳桿菌后，增加了其在腸道菌群中的比例。普雷沃氏菌屬9屬于擬桿菌門中非常重要的菌屬，研究發(fā)現(xiàn)，隨著仔豬日齡增加，腸道中普雷沃氏菌屬9的相對(duì)豐度會(huì)逐漸降低[17]。本研究中，鼠李糖乳桿菌組盲腸內(nèi)容物普雷沃氏菌屬9相對(duì)豐度較對(duì)照組有所降低，可能是由于鼠李糖乳桿菌促進(jìn)了同齡仔豬的腸道發(fā)育。Alloprevotella亦屬于擬桿菌門，可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸，而短鏈脂肪酸在胃腸道中具有調(diào)控脂肪儲(chǔ)備的作用[18]，本研究中，鼠李糖乳桿菌組斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的提高也可能受到了Alloprevotella相對(duì)豐度提高的間接調(diào)控。變形桿菌門包含了很多腸道致病菌，如埃希氏菌-志賀氏菌屬能夠引起腹瀉。與對(duì)照組比較，鼠李糖乳桿菌組盲腸內(nèi)容物埃希氏菌-志賀氏菌屬相對(duì)豐度明顯降低，可能是由于鼠李糖桿抑制了致病微生物的生長(zhǎng)。另外，鼠李糖乳桿菌組盲腸內(nèi)容乳桿菌屬相對(duì)豐度的提高也可能會(huì)搶占腸道菌群的空間，降低pH，從而讓乳桿菌屬更易生長(zhǎng)，而埃希氏菌-志賀氏菌屬更難生存。有文獻(xiàn)也證實(shí)了有些乳桿菌屬益生菌具有抑制腸道致病菌的能力，如鼠李糖乳桿菌DR20和乳酸雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis)DR10對(duì)產(chǎn)毒素大腸桿菌(Escherichiacoli)有拮抗作用[19]；Lactobacillusfrumenti能夠提高腸道中有益微生物[Lactobacillusfrumenti、格氏乳桿菌 (Lactobacillusgasseri)和碲糖酵母(Kazachstaniatelluris)]的相對(duì)豐度，同時(shí)降低致病菌脫硫脫硫弧菌(Desulfovibriodesulfuricans)和腐殖假絲酵母(Candidahumilis)的相對(duì)豐度[20]。這可能是由于鼠李糖乳桿菌能夠穩(wěn)定黏附在豬腸上皮細(xì)胞上[16]，并抑制腸道內(nèi)埃希氏菌-志賀氏菌屬等病原菌的黏附；也可能是由于添加鼠李糖乳桿菌導(dǎo)致仔豬腸道內(nèi)乳桿菌屬和Alloprevotella相對(duì)豐度提高，埃希氏菌-志賀氏菌屬相對(duì)豐度降低，從而間接影響到豬的生長(zhǎng)和免疫性能。

4 結(jié) 論

綜上所述，飼糧添加鼠李糖乳桿菌能夠提高早期斷奶成華黑仔豬平均日增重和肉料比，提高血清抗氧化能力和機(jī)體免疫性能，提高盲腸內(nèi)容物乳桿菌屬和Alloprevotella相對(duì)豐度，降低盲腸內(nèi)容物埃希氏菌-志賀氏菌屬相對(duì)豐度，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腸道健康，從而提高其生長(zhǎng)性能和免疫性能。