蘭 聰 何 俊 李 華 湯加勇 陳代文 余 冰 何 軍 黃志清 鄭 萍 毛湘冰 虞 潔 羅鈞秋 閻 輝 羅玉衡

(四川農業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室，農業(yè)部動物抗病營養(yǎng)與飼料重點實驗室，動物抗病營養(yǎng)四川省重點實驗室，四川省畜禽營養(yǎng)與飼料工程實驗室，成都 611130)

飼糧纖維是不能被動物自身分泌的消化酶所分解的糖類聚合物，由多種糖單體通過不同的糖苷鍵鏈接而成[1]。傳統動物營養(yǎng)學除了考慮飼糧中的粗纖維含量，也通過測定中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、纖維素、半纖維素和木質素的含量來進一步剖分飼糧纖維的組成。然而，由于飼糧纖維在單胃動物前腸無法被消化利用，后腸微生物對飼糧纖維的利用就顯得尤為重要。目前研究表明，飼糧纖維的攝入對維持動物腸黏膜屏障完整性、緩解腸道炎癥有重要作用[2-3]。同時，一般認為可溶性飼糧纖維(soluble dietary fiber，SDF)比不可溶性飼糧纖維(insoluble dietary fiber，IDF)具有更高的可發(fā)酵性[4]。本課題組前期研究表明，小鼠和豬后腸均存在特異性利用SDF和IDF的核心菌群[5-7]，后腸微生物可通過改變群落結構實現對不同類型飼糧纖維的有效利用。因此，根據水溶性或可發(fā)酵性對飼糧纖維進行分類對探究纖維的作用機理更為合理。腸道主要負責營養(yǎng)物質的消化吸收，同時也是機體最大的免疫器官，腸道健康對維持動物的生長發(fā)育極其重要。腸道功能失調不僅會降低營養(yǎng)物質的消化吸收率，還會導致病原微生物、致病性抗原及有毒物質侵入機體，引起諸如腸易激綜合征、全身炎癥反應綜合征、神經性厭食嘔吐和微生態(tài)失衡等疾病，同時導致機體免疫功能低下、腹瀉及生長緩慢等癥狀[8]。隨著單胃動物“后腸營養(yǎng)”概念的提出和相關研究的深入，后腸健康在很大程度上影響動物的養(yǎng)分攝入，由此而言，深入研究飼糧纖維對后腸健康的影響機理意義重大。對生長豬的研究表明，飼糧中添加高水平天然纖維源可明顯改善豬的腸道屏障功能，并通過調控模式識別受體相關信號通路影響炎癥相關細胞因子的釋放，這一效應很可能與纖維類型有關[7]。但值得注意的是，之前的研究是以健康動物為對象，無法證明炎癥因子的變化是否處于正常范圍。從這個角度而言，腸炎模型動物比健康動物更適用于相關研究。因此，本研究以C57BL/6小鼠為研究對象，通過在其飲水中添加葡聚糖硫酸鈉(DSS)建立結腸炎模型，比較分析典型SDF(菊粉)與IDF[微晶纖維素(MCC)]對結腸炎癥相關細胞因子表達的影響，為進一步探究SDF與IDF對動物后腸免疫功能的影響機理奠定基礎，同時也為動物飼糧中纖維源的選擇和科學應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選取24只體重約為20 g(8周齡)的雄性健康C57BL/6小鼠，預飼3 d后開始正式試驗，正式試驗分為建模期(7 d)和恢復期(14 d)2個階段。建模期所有小鼠均飼喂無纖維純合飼糧，在其飲水中添加3% DSS，保持自由采食和飲水，誘導小鼠產生結腸炎，通過疾病活動指數(DAI)評判模型是否建立成功。建模成功后進入恢復期，按各組體重無差異原則將小鼠分為3組，每組8只，C組(對照組)小鼠仍飼喂無纖維純合飼糧，試驗組小鼠分別飼喂含5%菊粉(I組)或MCC(M組)的飼糧，所有小鼠自由采食和飲水。參照AIN-93標準配制飼糧，各組飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 各組飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of diets for different groups (air-dry basis) %

續(xù)表1項目 Items組別 GroupsCIM營養(yǎng)水平 Nutrient levels3)粗蛋白質 Crude protein18.3918.3418.34碳水化合物 Carbohydrate66.0766.1966.19粗脂肪 Crude fat7.507.497.49粗灰分 Ash4.194.184.18粗纖維 Crude fiber5.005.00總能 Gross energy/(MJ/kg)15.9915.2615.26鈣 Ca1.051.051.05有效磷 AP0.740.730.73

試驗第1周每天稱重，并記錄日采食量；第1周結束后每隔3 d稱重，每天記錄采食量。試驗結束后屠宰所有小鼠，采樣備用。

1.2 試驗材料

試驗材料包括8周齡雄性C57BL/6小鼠[成都達碩實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(川)2015-03]、滅菌鼠糧(成都達碩實驗動物有限公司)、DSS[0216011080，純度：99.0%，安倍醫(yī)療器械貿易(上海)有限公司]、菊粉[A602227，純度≥90.0%，生工生物工程(上海)股份有限公司]、MCC[A600279，純度：99.0%～102.0%，生工生物工程(上海)股份有限公司]、3%雙氧水[SDS12-500，斯坦利思生物科技(杭州)有限公司]、Trizol試劑盒[Code No.9108，TaKaRa(北京)公司]、異硫氰酸熒光素(FITC)標記的CD3單克隆抗體[倉鼠抗小鼠免疫球蛋白G1(hamster anti mouse IgG1]，CAT:553061，美國BD Pharmingen公司)、別藻青蛋白(APC)標記的CD4單克隆抗體[大鼠抗小鼠免疫球蛋白G2a(rat anti mouse IgG2a)，CAT:553051，美國BD Pharmingen公司]、熒光素(PE)標記的CD8單克隆抗體[大鼠抗小鼠免疫球蛋白G2a(rat anti mouse IgG2a)，CAT:100708，美國BioLegend公司]、紅細胞裂解液(10×，CAT:349202，美國BD公司)、無水乙醇(CAS:64-17-5，成都市科隆化學品有限公司)、氯仿(CAS:67-66-3，成都市科隆化學品有限公司)、逆轉錄試劑盒[Code No.RR047A，TaKaRa(北京)公司]、全自動生化儀(TBA-40FR，日本Toshiba公司)、熒光定量PCR儀(ABI 7900，美國ABI公司)、流式細胞儀(FACSVerse，美國BD公司)等。

1.3 小鼠結腸炎模型評判方法

每天稱量小鼠體重。每天記錄糞便性狀，按肉眼觀察到的正常、松散、稀便3個級別進行評分。利用聯苯胺法[9]測定隱血情況。根據相關標準[10]對小鼠DAI進行評估。通過DAI判斷DSS誘導結腸炎模型是否建立成功。

1.4 血清生化指標測定

恢復期試驗結束后，所有小鼠經二氧化碳麻醉后進行眼球采血，每只小鼠分別采集2管(各0.5 mL)，其中一管進行肝素鈉抗凝處理，立即進行T淋巴細胞亞群檢測；另一管經室溫靜置30 min后，4 ℃、12 000×g離心10 min，取血清-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用全自動生化儀測定血清中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、免疫球蛋白G(IgG)、C反應蛋白(CRP)、補體3(C3)、免疫球蛋白M(IgM)、非酯化脂肪酸(NEFA)含量。

1.5 器官指數測定

采血后采用頸椎脫臼法處死小鼠，采集肝臟、脾臟、胸腺并稱重。按下列公式計算器官指數：

器官指數(mg/g)=器官重量(mg)/
小鼠活體重(g)。

1.6 血液與脾臟中T淋巴細胞亞群測定

將采集的小鼠新鮮靜脈血于肝素鈉抗凝管中，立即混勻，吸取100 μL抗凝血于流式管，然后加入小鼠的CD3、CD4、CD8單克隆抗體各1頭份，渦旋混勻，于4 ℃避光染色30 min，染色后用1 mL紅細胞裂解液(1×)破裂紅細胞，300×g離心5 min，棄上清，再用500 μL的預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細胞，用流式細胞儀進行檢測；取新鮮脾臟制備單細胞懸液，獲得濃度為1×106～1×107個/mL的單細胞懸液，取細胞懸液100 μL于流式管中，然后加入小鼠的CD3、CD4、CD8單克隆抗體各1頭份，渦旋混勻，于4 ℃避光染色30 min，染色后用500 μL的PBS重懸細胞，300×g離心5 min，棄上清，再用500 μL的PBS重懸細胞，使用流式細胞儀進行檢測。

1.7 結腸組織炎癥相關細胞因子mRNA表達量測定

處死小鼠后迅速打開腹腔，用預冷的生理鹽水輕輕沖洗腸道內容物后，采集2 cm的結腸中段組織，置于2 mL凍存管中-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用Trizol試劑盒提取各組小鼠結腸組織總mRNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，采用紫外-可見分光光度計檢測RNA濃度，用逆轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA后使用熒光定量PCR儀進行實時熒光定量PCR(RT-qPCR)分析，檢測結腸組織中白細胞介素IL-6(IL-6)、Toll樣受體4(TLR4)、核苷酸結合寡聚化結構域蛋白1(NOD1)、髓樣分化因子88(MyD88)、腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF6)、受體互作蛋白激酶2(RIPK2)、白細胞介素-10(IL-10)、核因子-κB(NF-κB)、白細胞介素-1β(IL-1β)的mRNA表達情況。目的基因引物信息如表2所示。以小鼠3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算結腸組織中各目的基因的mRNA相對表達量。

表2 目的基因引物信息Table 2 Primer information for targeting genes

1.8 數據分析

采用SPSS 20.0軟件的ANOVA模塊對所有數據進行單因素方差分析，同時應用最小顯著性差異(LSD)法進行多重比較。數據以平均值±標準差表示，以P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 DSS誘導小鼠結腸炎模型的建立

建模期間，每天同一時間觀察記錄小鼠的一般情況。建模前小鼠體重、采食量穩(wěn)定，反應靈敏且毛發(fā)光亮，糞便性狀正常。隨著試驗進行，小鼠出現不同程度的腹瀉、便血，攝食減少，拱背，精神萎靡，在第7天肉眼可見便血。

由表3可知，在建模期第6天，C組和M組小鼠體重顯著下降(P<0.05)，I組小鼠體重有下降趨勢(P=0.051)。由表4可知，C組和M組小鼠的平均日增重(ADG)在建模期第2、5和6天顯著下降(P<0.05)，I組小鼠的ADG在建模期第6天顯著下降(P<0.05)。由表5可知，在建模期間各組小鼠的DAI逐漸增加，在建模期第7天時，各組的DAI均顯著高于第1天(P<0.05)。

表3 建模期各組小鼠體重變化 Table 3 Change of body weight of mice from different groups during modeling period g

表4 建模期各組小鼠ADG變化 Table 4 Change of ADG of mice from different groups during modeling period g

表5 建模期各組小鼠DAI變化Table 5 Change of DAI of mice from different groups during modeling period

續(xù)表5時間 Time組別 GroupsCMI第4天 Day 41.63±0.37b1.40±0.21b1.30±0.31b第5天 Day 51.73±0.38b1.57±0.27b1.33±0.22b第6天 Day 62.23±0.47a1.93±0.22a2.07±0.44a第7天 Day 72.17±0.48a1.96±0.35a2.23±0.42aP值 P-value<0.001<0.001<0.001

2.2 各組小鼠生長性能

由表6、表7、表8可知，恢復期小鼠體重隨飼養(yǎng)時間的延長呈上升趨勢，但各組小鼠體重和ADG均無顯著差異(P>0.05)；恢復期第5～7天，與C組相比，M組小鼠平均日采食量(ADFI)顯著增加(P<0.05)。

表6 恢復期各組小鼠體重變化 Table 6 Change of body weight of mice from different groups during recovery period g

表7 恢復期各組小鼠ADG變化 Table 7 Change of ADG of mice from different groups during recovery period g

表8 恢復期各組小鼠ADFI變化 Table 8 Change of ADFI of mice from different groups during recovery period g

2.3 各組小鼠器官指數

由表9可知，各組小鼠肝臟、脾臟和胸腺指數差異均不顯著(P>0.05) 。

表9 各組小鼠恢復期結束時的器官指數Table 9 Organ indices of mice in different groups at the end of recovery period

2.4 各組小鼠血清生化指標

由表10可知，各組小鼠血清TP、ALB、IgG、C3含量均無顯著差異(P>0.05)。與C組相比，M組和I組小鼠血清CRP含量均顯著降低(P<0.05)，I組小鼠血清NEFA含量顯著升高(P<0.05)。與M組相比，I組小鼠血清NEFA含量顯著升高(P<0.05)，血清IgM含量有降低的趨勢(P=0.061)。

表10 各組小鼠恢復期結束時的血清生化指標 Table 10 Serum biochemical indexes of mice in different groups at the end of recovery period mmol/L

2.5 各組小鼠脾臟與血液中T淋巴細胞亞群的比例

由表11可知，各組小鼠血液中各T淋巴細胞亞群的比例無顯著差異(P>0.05)。由表12可知，與C組相比，M組與I組小鼠脾臟中CD3+(P=0.053)和CD4+(P=0.091)T淋巴細胞的比例有升高的趨勢。

表12 各組小鼠恢復期結束時脾臟中T淋巴細胞亞群的比例 Table 12 Percentages of T lymphocyte subsets in spleen of mice in different groups at the end of recovery period

2.6 各組小鼠結腸組織中炎癥相關細胞因子mRNA相對表達量

由圖1可知，與C組相比，M組小鼠結腸組織中TLR4、RIPK2的mRNA相對表達量顯著下降(P<0.05)。與I組相比，M組小鼠結腸組織中TLR4、RIPK2、TRAF6的mRNA相對表達量顯著下降(P<0.05)。

“*”表示組間差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

飼糧纖維作為一種重要的營養(yǎng)素，其對宿主腸道生理和微生態(tài)平衡的特殊作用已被證實[12-13]。除了添加濃度以外，飼糧纖維的理化特性也是決定其生理功能的一個重要因素[14-16]。菊粉是典型的SDF，關于菊粉對小鼠生長性能影響的研究目前多集中于代謝疾病模型。研究發(fā)現，每天攝入2.5和10.0 g/kg菊芋菊粉均可降低高脂飲食誘導的肥胖小鼠的體重[17]，且在高脂、高糖誘導的肥胖小鼠飼糧中添加5%短鏈菊粉也能有效降低小鼠體重[18]。對于便秘模型小鼠而言，菊粉對小鼠體重無顯著影響[19]。但有限的研究表明，在腸道炎癥情況下，菊粉對小鼠體重的影響不盡一致。例如，在2.5%DSS誘導的結腸炎小鼠的普通飼糧中添加200 g/kg菊粉對其體重無顯著影響[20]，而在另外一項DSS誘導的結腸炎小鼠的試驗中，添加3%菊粉可顯著提高小鼠體重[21]。本研究結果顯示，當小鼠發(fā)生結腸炎后，飼糧中添加5%菊粉不影響其生長性能。與菊粉相反，MCC在人和模式動物的相關研究中常被作為一種典型的IDF，但其與小鼠生長性能關系的相關研究極為有限。本課題組前期研究表明，在飼糧中短期添加MCC對健康小鼠的終末體重和全期ADG均無顯著影響[6]。但本試驗結果表明，在小鼠發(fā)生結腸炎的情況下，在其飼糧中添加5%MCC可提高小鼠恢復期的階段采食量，且其作用效果略優(yōu)于菊粉，暗示MCC可能對結腸炎小鼠的生長性能有潛在的促進作用。

已有研究證實，適宜添加濃度的飼糧纖維對動物的系統免疫機能可能有促進作用[22-23]。胸腺和脾臟分別是機體的中樞和外周免疫器官，而肝臟中存在大量參與免疫應答與免疫反應的細胞，上述器官指數在一定程度上反映了機體免疫功能的強弱[24-25]。本試驗結果表明，在DSS誘導小鼠產生結腸炎后，飼糧中添加5%菊粉或MCC對小鼠胸腺、脾臟、肝臟指數均未產生顯著影響。本課題組前期對另一種SDF(燕麥β-葡聚糖)與MCC的研究也表明，即使這2種飼糧纖維在健康小鼠飼糧中添加濃度高達20%也不影響其器官指數[6]。除器官指數外，血清生化指標也常被用于衡量機體的免疫功能[26]。CRP是由肝臟合成的急性期蛋白，也是機體炎癥反應的一項敏感指標，在正常血清中含量甚微，而在炎癥情況下其含量增高。血清CRP含量通常作為評價炎癥活動性及其嚴重程度的有效指標[27]。前人研究發(fā)現，菊粉和一些合生元可改善人術后腸道功能[28-29]。同時，高劑量菊粉可降低代謝綜合征大鼠血清中的超敏CRP含量[30]。本研究發(fā)現，當飼糧中缺乏飼糧纖維時，結腸炎小鼠血清中CRP含量在恢復期下降緩慢。反之，飼糧中添加5%菊粉或MCC則可使結腸炎小鼠恢復期血清CRP含量快速下降，說明這2種類型的飼糧纖維均可有效緩解機體炎癥。但是，血清NEFA含量的分析結果暗示菊粉與MCC緩解機體炎癥的效果可能存在差異。血清中高含量的NEFA不僅干擾正常糖代謝，還會誘發(fā)輕度炎癥及胰島素抵抗[31]。本研究發(fā)現，在結腸炎小鼠飼糧中添加5%菊粉可顯著提高其血清NEFA含量，且與攝入5%MCC的小鼠相比，其血清IgM含量降低。作為免疫球蛋白，血清IgM含量能在一定程度上反映機體的整體免疫狀態(tài)[32-33]。就此而言，本試驗結果暗示，飼糧中添加5%MCC對結腸炎小鼠免疫功能的改善程度可能大于菊粉。

相關研究表明，機體細胞免疫在腸道炎癥發(fā)病過程中起重要作用，其中T淋巴細胞是介導細胞免疫應答的主要免疫細胞，根據其細胞表面分化抗原的不同，可以將其分為CD4+細胞和CD8+細胞。CD4+細胞為輔助型T細胞，通過合成與分泌細胞因子，協助其他淋巴細胞發(fā)揮免疫功能。CD8+細胞又稱細胞毒性T細胞，能直接殺傷或抑制病毒等胞內感染病原體的靶細胞[34]。本研究發(fā)現，飼糧中添加5%菊粉或MCC均能提高結腸炎小鼠脾臟中CD3+和CD4+T淋巴細胞的比例，說明菊粉和MCC或可能通過改善細胞免疫功能來緩解小鼠的結腸炎。

值得注意的是，前人研究表明，飼糧纖維對機體免疫功能的影響可能主要集中在腸道[35-39]。攝入纖維能降低DSS誘導的結腸炎小鼠腸道促炎因子的表達量、上調抗炎因子的表達量，并通過改變腸道微生物的組成來調節(jié)腸系膜淋巴結中的Treg細胞數量，從而緩解結腸炎[40-41]。研究表明，飼糧添加菊粉和MCC能顯著提高生長豬的結腸杯狀細胞數量，從而促進其腸道免疫功能[42]，然而在肥胖模型小鼠中，MCC并不影響腸形態(tài)和炎癥因子水平[43]。本課題組前期的研究結果顯示，SDF與IDF含量不同的天然纖維對生長豬結腸免疫功能的改善與模式識別受體信號通路的調控有關[7]，他人研究也有類似結果[44]。TLR4和核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(NLR)都屬于模式識別受體，相關信號通路對調節(jié)機體的先天免疫反應有重要作用[45-48]。TLR4和TRAF6是TLR4信號通路的關鍵基因。TLR4能激發(fā)一系列信號通路，促進炎癥的發(fā)生及加重[49-50]。NOD1和RIPK2是NOD信號通路的關鍵基因。TLR4和NLR與配體(如病原微生物)結合后，可激活通過下游信號分子，最終導致NF-κB的激活，從而啟動炎癥相關細胞因子表達[51]。IL-10是由免疫細胞分泌的白細胞介素，IL-6是由單核巨噬細胞產生的多向性的促炎細胞因子，其在潰爛性結腸炎中表達上升[52-53]。IL-10有抗炎和抗過敏作用，能抑制促炎細胞因子的釋放和抗原遞呈[54]。因此，本試驗進一步測定了小鼠結腸組織中上述通路關鍵基因的表達情況。結果發(fā)現，與自然恢復的結腸炎小鼠相比，當飼糧中含有5%MCC時，小鼠結腸組織中TLR4、TRAF6、RIPK2的mRNA相對表達量與對照組和菊粉組相比均有不同程度的下降，暗示MCC主要通過調控TLR4和NLR相關信號通路，降低促炎細胞因子的表達量和提高抗炎細胞因子的表達量來改善炎癥小鼠的結腸免疫功能，并且其效果可能優(yōu)于菊粉。由此可見，雖然SDF和IDF這2種類型飼糧纖維的添加均有助于增強炎癥小鼠結腸的免疫功能，但二者緩解小鼠結腸炎癥的途徑很可能存在差異。由于微生物是模式識別受體的主要配體，故推測上述2種類型飼糧纖維促進小鼠結腸免疫功能的機制應與結腸菌群的調節(jié)有關，但具體機制還需進一步研究論證。

4 結 論

① 飼糧中添加5%菊粉或MCC對DSS誘導的結腸炎小鼠恢復期生長性能均無顯著影響。

② 飼糧中添加5%菊粉或MCC對結腸炎小鼠恢復期胸腺、脾臟和肝臟指數均無顯著影響。

③ 飼糧中添加5%菊粉或MCC均可促使結腸炎小鼠血清CRP含量快速下降，加速炎癥緩解，且MCC的作用較菊粉更為顯著。

④ 飼糧中添加5%菊粉或MCC均可提高結腸炎小鼠脾臟中CD3+和CD4+T淋巴細胞的比例，提高細胞免疫功能，從而緩解結腸炎；此外，MCC主要通過下調促炎細胞因子和上調抗炎細胞因子的表達改善結腸炎小鼠腸道免疫功能，且效果優(yōu)于菊粉，可能與TLR4和NLR相關信號通路的調控有關。