任蓉蓉，陳紅全

1.浙江醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，浙江 杭州 310013；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 杭州 310016

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是強(qiáng)大的基因編輯工具，近幾年得到廣泛的應(yīng)用[1-4]。近期，研究者將APOBECs（members of the apolipoprotein B mRNA-editing enzyme,catalytic polypeptide-like）蛋白和CRISPR系統(tǒng)緊密的聯(lián)系在了一起[5-7]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用Cas9-D10A/sgRNA進(jìn)行基因編輯時(shí)，APOBEC-3B蛋白能夠引入非目的突變[5]，因此有必要優(yōu)化Cas9-D10A/sgRNA系統(tǒng)的保真性。應(yīng)用Cas9-D10A/sgRNA進(jìn)行基因編輯時(shí)，D10A能夠切割雙鏈DNA的單鏈后形成切口樣結(jié)構(gòu)，從而暴露出DNA單鏈，而APOBECs蛋白具有胞苷脫氨酶活性，能夠攻擊單鏈DNA的胞嘧啶脫氨使其變?yōu)槟蜞奏?，使單鏈DNA發(fā)生堿基突變。本研究根據(jù)上述現(xiàn)象提出以下理論設(shè)想：對(duì)Cas9-D10A/sgRNA系統(tǒng)設(shè)計(jì)csgRNA（chaperone sgRNA），使D10A進(jìn)行基因編輯時(shí)產(chǎn)生的DNA單鏈結(jié)構(gòu)能夠與csgRNA形成堿基互補(bǔ)配對(duì)，從而形成雙鏈樣結(jié)構(gòu)，降低APOBECs的攻擊，以減少APOBECs對(duì)Cas9-D10A進(jìn)行的基因操作形成的單鏈DNA引入突變，從而降低突變率。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒構(gòu)建與引物設(shè)計(jì) Cas9（pST1374-N-NLSFlag-linker-Cas9）、D10A（pST1374-N-NLS-flaglinker-D10A）、H840A（pST1374-N-NLS-flag-linker-H840A）和dCas9（pST1374-N-NLS-flag-linker-dead Cas9）等表達(dá)載體由上海科技大學(xué)黃行許教授饋贈(zèng)，sgRNA表達(dá)載體由pGL3-U6-sgRNA-PGK-Puro（Addgene 51133）構(gòu)建完成；sgRNA4和FANCF打靶位點(diǎn)的sgRNAs序列和其各自的上下游PCR引物序列見(jiàn)表1。

表1 sgRNAs序列和引物序列

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 293FT、293FT-A3B和293FTA3Bm細(xì)胞系由上?？萍即髮W(xué)陳佳教授饋贈(zèng)，所有細(xì)胞均在DMEM（10566，美國(guó)Gibco公司）+10% FBS（16000-044，美國(guó)Gibco公司）、37 ℃條件下培養(yǎng)；細(xì)胞以2×105/孔，接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，8 h后用LipofectamineTM2000（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染試劑包括125 μL Opti-MEM+2 μg Cas9表達(dá)載體+1 μg sgRNA表達(dá)載體+3 μL Lipofectamine，24 h后加終質(zhì)量濃度為 1 μg/mL的嘌呤霉素（ant-pr-1，美國(guó)InvivoGen公司）藥篩，48 h后用酚氯仿法抽提基因組DNA。

1.3 T7EN1酶切實(shí)驗(yàn) 首先用PCR方法擴(kuò)增sgRNA打靶位點(diǎn)上下游DNA序列，PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃，5 min；（98 ℃，10 s，72～62 ℃，每循環(huán)降低1 ℃，15 s；72 ℃，30 s）10個(gè)循環(huán)，（98 ℃，10 s；62 ℃，15 s；72 ℃，30 s）25個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min；4 ℃ 保持，PCR產(chǎn)物用PCR清潔試劑盒（美國(guó)Axygen公司，AP-PCR-50）純化，純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行退火（體系為：NEB Buffer2，2 μL，PCR產(chǎn)物，200 μg，純水補(bǔ)齊至20 μL。退火程序：95 ℃ 5 min；95～85 ℃，每秒降低2 ℃；85～25 ℃，每秒降0.1 ℃；4 ℃保持）。退火產(chǎn)物放于冰上，每個(gè)體系加入0.3 μL T7核酸內(nèi)切酶I，37 ℃孵育25 min，之后用2.5%瓊脂糖凝膠電泳（100 V，25 min）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用GraphPad Prism5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APOBEC-3B顯著增強(qiáng)Cas9-nickase基因編輯的突變率 有研究表明APOBEC-3B過(guò)表達(dá)可顯著增強(qiáng)Cas9-nickase基因編輯的突變率[5]。本研究首先在293FT-A3B過(guò)表達(dá)細(xì)胞系上檢測(cè)Cas9-nickase的基因編輯效率。選取sgRNA4和sgFANCF打靶位點(diǎn)，構(gòu)建載體，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293FT、293FT-A3B和293FTA3Bm細(xì)胞系，通過(guò)T7EN1酶切實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其編輯效率，結(jié)果如圖1所示，Cas9在三種細(xì)胞系上對(duì)四個(gè)位點(diǎn)均產(chǎn)生了非常明顯的切割條帶，在293FT-A3B過(guò)表達(dá)細(xì)胞系中，Cas9-D10A對(duì)兩個(gè)位點(diǎn)均產(chǎn)生了明顯的切割，Cas9-H840A的切割條帶較弱，而在293FT和293FT-A3Bm細(xì)胞系則檢測(cè)不到肉眼可見(jiàn)的切割條帶，這表明APOBEC-3B過(guò)表達(dá)顯著增強(qiáng)了Cas9-D10A進(jìn)行基因編輯時(shí)產(chǎn)生的突變。

圖1 T7EN1酶切凝膠圖顯示APOBEC-3B過(guò)表達(dá)顯著增加了Cas9-nickase/sgRNA的突變率

2.2 csgRNA降低由APOBEC-3B引起的Cas9-nickase基因編輯突變率 為降低APOBEC-3B對(duì)Cas9-D10A進(jìn)行基因編輯時(shí)引入的突變，我們擬通過(guò)csgRNA策略予以解決，其原理示意圖見(jiàn)圖2A。根據(jù)以上理論原理，本研究在sgRNA4和sgFANCF位點(diǎn)上設(shè)計(jì)csgRNA，其長(zhǎng)度為20 bp，構(gòu)建雙U6（sgRNA+csgRNA）載體、轉(zhuǎn)染293FT-A3B細(xì)胞系，T7EN1酶切實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2B，結(jié)果顯示在A3B過(guò)表達(dá)細(xì)胞系中，csgRNA降低了D10A在sgRNA4和sgFANCF打靶位點(diǎn)所產(chǎn)生的切割條帶，這表明csgRNA策略能夠降低D10A進(jìn)行基因編輯時(shí)APOBEC3B蛋白對(duì)單鏈DNA的攻擊，從而減少突變的發(fā)生。

圖2 CsgRNA策略對(duì)Cas9-D10A基因編輯效率分析

2.3 csgRNA條件的優(yōu)化 對(duì)csgRNA的長(zhǎng)短、作用位置進(jìn)行優(yōu)化。選取sgRNA4打靶位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了24個(gè)csgRNA，其長(zhǎng)度和作用位置見(jiàn)圖3A，構(gòu)建雙U6載體，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293FT-A3B細(xì)胞系，T7EN1酶切實(shí)驗(yàn)檢測(cè)基因編輯效率，結(jié)果見(jiàn)圖3B。1、2、8、9、10、13號(hào)csgRNA其D10A切割條帶顯著降低了，其csgRNA對(duì)Cas9的切割條帶無(wú)影響。對(duì)Cas9和D10A產(chǎn)生的切割條帶進(jìn)行灰度掃描，D10A/Cas9切割條帶灰度值比值見(jiàn)圖3C，其中1、11、15、21號(hào)csgRNA和S4比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其他csgRNA差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。8號(hào)（csgRNA長(zhǎng)度為16 bp、向PAM端延伸2個(gè)堿基）和9號(hào)（csgRNA長(zhǎng)度為20 bp、向PAM端延伸4個(gè)堿基）csgRNA既能確保Cas9/sgRNA4的基因編輯效率，對(duì)降低D10A/sgRNA4進(jìn)行基因編輯時(shí)APOBEC-3B蛋白引入的突變其效果相對(duì)更好一些。

圖3 csgRNA長(zhǎng)度和位置的優(yōu)化

2.4 8 號(hào)csgRNA在Cas9 nickase上的作用效果 選取8號(hào)csgRNA，以sgRNA4和sgFANCF為打靶位點(diǎn)，在293FT-A3B細(xì)胞系上進(jìn)一步驗(yàn)證8號(hào)csgRNA的保護(hù)性效果，并看其在Cas9-D10A和Cas9-H840A上的作用效果。轉(zhuǎn)染293FT-A3B細(xì)胞系，T7EN1酶切結(jié)果和D10A/Cas9切割條帶灰度值比值見(jiàn)圖4，8號(hào)csgRNA在sgRNA4和sgFANCF位點(diǎn)上均顯著降低Cas9-D10A的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。以上結(jié)果表明在sgRNA4和sgFANCF打靶位點(diǎn)上，8號(hào)csgRNA可明顯降低APOBEC-3B對(duì)D10A進(jìn)行基因編輯時(shí)產(chǎn)生的突變。

圖4 csgRNA在Cas9 nickase上的作用效果

3 討論

自從CRISPR/Cas9 系統(tǒng)被研究者成功開(kāi)發(fā)出來(lái)，其廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究[8-11]，但其臨床應(yīng)用（如基因治療）一直受限于嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)[12-14]，因此進(jìn)一步提高特異性是其臨床應(yīng)用的前提。本研究結(jié)果顯示，在sgRNA4和sgFANCF位點(diǎn)上，csgRNA 策略對(duì)D10A/sgRNA系統(tǒng)有明顯保護(hù)作用，而對(duì)H840A/sgRNA保護(hù)性無(wú)效果，這是因?yàn)镠840A蛋白只有RuvC切割活性結(jié)構(gòu)域，RuvC切割DNA非互補(bǔ)鏈，隨后的缺口過(guò)程暴露的DNA互補(bǔ)鏈和sgRNA結(jié)合的雙鏈結(jié)構(gòu)占據(jù)主要部分，因此csgRNA策略主要降低APOBECs對(duì)D10A/sgRNA系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯時(shí)產(chǎn)生的突變；在對(duì)csgRNA條件進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，發(fā)現(xiàn)較短的csgRNA保護(hù)性效果不佳，可能是因?yàn)镈10A蛋白切割DNA單鏈后暴露的缺口過(guò)大造成的，這需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

科學(xué)家們?cè)谔岣逤RISPR/Cas9系統(tǒng)保真性方面付出了巨大的努力，如通過(guò)優(yōu)化sgRNA的設(shè)計(jì)來(lái)提高CRISPR系統(tǒng)的保真性[15]、高保真性Cas9蛋白的開(kāi)發(fā)[16]、利用Cas9-D10A結(jié)合雙sgRNAs策略降低的脫靶效應(yīng)的研究[17]等，但這些方法均不能有效抑制APOBECs對(duì)Cas9-D10A/sgRNA系統(tǒng)進(jìn)行基因操作時(shí)引入的突變[5]。最近研究者將CRISPR-Cas9系統(tǒng)融合ArIIA4-Cdt1 表達(dá)元件，其在確?；蚓庉嬓实耐瑫r(shí)，可降低脫靶效應(yīng)[18]，這是學(xué)者們?cè)谔岣逤RISPR系統(tǒng)保真性上的又一大進(jìn)步。我們?cè)O(shè)想，將融合ArIIA4-Cdt1的CRISPR系統(tǒng)與csgRNA策略相結(jié)合，對(duì)APOBECs高表達(dá)的細(xì)胞進(jìn)行基因編輯時(shí)，其保真性會(huì)進(jìn)一步提高。

免疫細(xì)胞基因編輯在治療人類各種疾病方面具有廣闊的潛力[12，19-21]，然而免疫細(xì)胞中APOBECs高水平表達(dá)并且在細(xì)胞激活過(guò)程中APOBECs的表達(dá)持續(xù)上調(diào)[5，22]，這就使人們對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行基因編輯時(shí)更需謹(jǐn)慎。本研究為降低APOBECs對(duì)Cas9-D10A/sgRNA系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯時(shí)產(chǎn)生的突變提供了csgRNA策略，為其進(jìn)一步向臨床應(yīng)用，尤其是對(duì)APOBECs高表達(dá)的初始T細(xì)胞進(jìn)行基因編輯時(shí)，做出了一定的貢獻(xiàn)。

綜上，本研究通過(guò)csgRNA策略成功降低了 APOBECs對(duì)Cas9-D10A/sgRNA進(jìn)行基因編輯時(shí)引入的突變，為提高CRISPR系統(tǒng)保真性提供參考。