邢蕊，胡宗武，梁笑天，董蔚，漆倩涯

(1.蘭州中檢科測(cè)試技術(shù)有限公司，蘭州 730070；2.蘭州理工大學(xué) 石油化工學(xué)院，蘭州 730050)

醬菜是將新鮮的蔬菜經(jīng)腌漬、微生物發(fā)酵或醬漬加工而成的各種蔬菜制品[1]，因味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富而深受人們的喜愛(ài)，逐漸成為人們飯桌上不可或缺的調(diào)味副食品[2-3]。脫氫乙酸是一種低毒高效的食品防腐劑[4-5]，常用于面包、糕點(diǎn)、果蔬汁、發(fā)酵豆制品、腌漬的蔬菜等食品中[6]。但是大量地使用脫氫乙酸將會(huì)影響人體的腎臟、肝臟[7]，甚至可能引發(fā)癌癥[8]，同時(shí)GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[9]中也明確指出了脫氫乙酸在一些食品中的最大使用量，其中在腌漬的蔬菜中脫氫乙酸的最大使用量為1.0 g/kg[10]。因此，我們對(duì)食品中脫氫乙酸的使用進(jìn)行日常監(jiān)管及對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性判斷顯得尤為重要[11]。

本實(shí)驗(yàn)依據(jù)GB 5009.121-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測(cè)定》[12]、JJF 1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[13]和CNAS-GL006-2019《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[14]中規(guī)定的基本方法和程序，采用高效液相色譜法對(duì)醬菜中脫氫乙酸的含量進(jìn)行了測(cè)定，分析醬菜中脫氫乙酸含量的不確定度來(lái)源，并對(duì)其測(cè)定結(jié)果的不確定度進(jìn)行了計(jì)算和評(píng)定，從而為醬菜中脫氫乙酸含量測(cè)定方法的可行性和準(zhǔn)確性提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬菜：市售；脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品：批號(hào)B0003452，純度99.9%，北京曼哈格生物科技有限公司；乙酸銨：色譜純，Aladdin公司；甲醇：色譜純：HiPure Chem公司；硫酸鋅和氫氧化鈉：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測(cè)器) 日本島津公司；ME204E電子天平 梅特勒-托利多公司；KQ-500DE超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司；LD5-2B離心機(jī) 北京雷勃爾離心機(jī)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

參照GB 5009.121-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測(cè)定》第二法液相色譜法。

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用1 mL氫氧化鈉溶液(20 g/L)溶解在10 mL容量瓶中，用水定容，配制成1000 μg/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。分別吸取脫氫乙酸貯備液0.005，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2 mL于10 mL容量瓶中，用水定容，配制成0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品前處理

稱(chēng)取已粉碎的試樣2 g，置于50 mL離心管中，加入約10 mL水、5 mL硫酸鋅溶液(120 g/L)，用氫氧化鈉溶液(20 g/L)調(diào)pH至7.5，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。置于離心管中，超聲提取10 min，4000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜，供高效液相色譜測(cè)定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱 ZORBAX Eclipse Plus C18柱 (4.6 mm×250 mm×5.0 μm)；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：甲醇+0.02 mol/L乙酸銨溶液(10+90，體積比)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：293 nm。

1.4 數(shù)學(xué)模型的建立

樣品中脫氫乙酸含量的計(jì)算公式為：

式中：X為樣品中脫氫乙酸的含量，g/kg；C為樣品溶液中脫氫乙酸的質(zhì)量濃度，μg/mL；C0為空白樣品溶液中脫氫乙酸的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為樣品溶液總體積，mL；m為樣品的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來(lái)源分析

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法所建立的數(shù)學(xué)模型并結(jié)合相關(guān)信息，分析影響測(cè)定結(jié)果的不確定度，其主要來(lái)源于樣品的稱(chēng)量、樣品溶液的定容、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、容量瓶的校準(zhǔn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的擬合、樣品的重復(fù)性分析等過(guò)程。

通過(guò)分析以上各不確定度分量，并合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。在95%的置信水平下，得到擴(kuò)展不確定度，最終量化高效液相色譜法測(cè)定醬菜中脫氫乙酸含量的不確定度。

2.2 不確定度各分量的評(píng)定

2.2.1 樣品稱(chēng)量過(guò)程中引入的不確定度

稱(chēng)量過(guò)程的重復(fù)性和天平的準(zhǔn)確性是樣品稱(chēng)量過(guò)程中不確定度的主要來(lái)源，其中樣品稱(chēng)量過(guò)程中的重復(fù)性所引入的不確定度分量已包含在各種因素造成的重復(fù)性影響修正值不確定度分量中。

根據(jù)電子天平的檢定證書(shū)，天平的分辨率為0.1 mg，稱(chēng)樣量m≤50 g時(shí)，最大允許誤差為±0.5 mg，稱(chēng)取樣品2 g，按均勻分布，則不確定度為：

則稱(chēng)重的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2 樣品定容過(guò)程中引入的不確定度

樣品定容過(guò)程中的不確定度主要是容量瓶的準(zhǔn)確性和溫度變化兩個(gè)方面引入的。

2.2.2.1 容量瓶的準(zhǔn)確性引入的不確定度

經(jīng)計(jì)量校準(zhǔn)，本次實(shí)驗(yàn)所用的25 mL容量瓶合格，根據(jù)校準(zhǔn)證書(shū)可得其容量的允許誤差為±0.03 mL，按均勻分布，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2.2 溫度變化引入的不確定度

玻璃器具出廠校準(zhǔn)溫度與實(shí)驗(yàn)室使用溫度的差異是溫度變化引入的不確定度，已知玻璃器具的校準(zhǔn)溫度為20 ℃，本實(shí)驗(yàn)室實(shí)際使用溫度變化范圍為±3 ℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，則不確定度分量為：

2.2.2.3 定容過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.2.3 由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得結(jié)果引入的不確定度

脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過(guò)程和擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)非線(xiàn)性所引入的不確定度是標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得結(jié)果引入的不確定度主要來(lái)源。

2.2.3.1 脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度

由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)可知，本實(shí)驗(yàn)所用的脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度為99.9%，其相對(duì)擴(kuò)展不確定度為2%，k=2，則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中稱(chēng)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

由本實(shí)驗(yàn)所用電子天平的檢定證書(shū)可知，天平的分辨率為0.01 mg，稱(chēng)樣量m≤5 g時(shí)，最大允許誤差為±0.05 mg，稱(chēng)取標(biāo)品9.68 mg，按均勻分布，則不確定度為：

則標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中所用容量瓶準(zhǔn)確性引入的不確定度

本實(shí)驗(yàn)采用10 mL A級(jí)容量瓶配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，其允許誤差為±0.020 mL，假設(shè)為均勻分布，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中溫度變化引入的不確定度

水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，本實(shí)驗(yàn)室使用溫度與校準(zhǔn)溫度變化范圍為±3 ℃，則不確定度分量為：

2.2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的擬合引入的不確定度

本實(shí)驗(yàn)采用6個(gè)濃度水平點(diǎn)的脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一濃度點(diǎn)測(cè)定2次，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 脫氫乙酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定結(jié)果Table 1 The determination results of standard curves of dehydroacetic acid

本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品測(cè)定液進(jìn)行了6次測(cè)定，由直線(xiàn)方程求得各次測(cè)量值，計(jì)算其平均質(zhì)量濃度為C=9.834 μg/mL，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

將以上各計(jì)算值帶入公式，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合的不確定度：

=0.00788。

即得由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得結(jié)果引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

=0.0131。

2.2.4 各種因素造成的重復(fù)性引入的不確定度

在整個(gè)處理過(guò)程中，因樣品前處理的不確定度有溫度、時(shí)間、加入試劑的量、提取效率、容器附著的量等引入的不確定度分量，可通過(guò)平行測(cè)定來(lái)評(píng)估不確定度分量。

在重復(fù)性條件下，對(duì)樣品進(jìn)行了6次獨(dú)立測(cè)試，脫氫乙酸含量分別是0.122，0.123，0.123，0.121，0.122，0.123 g/kg，則脫氫乙酸含量的平均值為0.122 g/kg，則樣品測(cè)試的重復(fù)性所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成及擴(kuò)展

2.3.1 各不確定度分量匯總

各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量見(jiàn)表2。

表2 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量表Table 2 The relative standard uncertainty components

2.3.2 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

對(duì)上述各不確定度分量進(jìn)行分析，合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

=0.0135。

2.3.3 相對(duì)擴(kuò)展不確定度

取置信概率95%，k=2，得高效液相色譜法測(cè)定醬菜中脫氫乙酸的相對(duì)擴(kuò)展不確定度為：

Urel=k×Urel(y)=2×0.0135=0.0270。

2.3.4 擴(kuò)展不確定度

由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知樣品中脫氫乙酸含量為0.122 g/kg，其擴(kuò)展不確定度為：

U=0.122×0.0270=0.003 g/kg。

2.3.5 結(jié)果表示

通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定醬菜中脫氫乙酸含量，測(cè)定結(jié)果為：

X=(0.122±0.003) g/kg，k=2。

3 結(jié)論

參照GB 5009.121-2016中的方法，采用高效液相色譜法對(duì)醬菜中脫氫乙酸的含量進(jìn)行了測(cè)定，并根據(jù)JJF 1059.1-2012和CNAS-GL006-2019中規(guī)定的方法和程序，對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中影響脫氫乙酸含量的各不確定度進(jìn)行分析和評(píng)定。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)測(cè)定結(jié)果影響最大的是由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所求得的濃度，其次是測(cè)定的重復(fù)性。而樣品稱(chēng)量和樣液定容所引入的不確定度較小。因此，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們應(yīng)選擇質(zhì)量穩(wěn)定、準(zhǔn)確度等級(jí)較高的標(biāo)準(zhǔn)品，嚴(yán)格把控標(biāo)準(zhǔn)品的配制過(guò)程，其次可增加標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度點(diǎn)和測(cè)定次數(shù)，加強(qiáng)操作人員的培訓(xùn)，檢測(cè)儀器的校準(zhǔn)等措施減小測(cè)定結(jié)果的不確定度，從而提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。