呂 芳，王翔宇，辛美麗，詹冬梅，丁 剛，吳海一

（1.山東省海洋生物研究院，山東省大型海藻資源保護(hù)與應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，山東青島 266104；2.青島市大型海藻工程技術(shù)研究中心，山東青島 266104）

《2018年中國海洋生態(tài)環(huán)境狀況公報(bào)》顯示，我國近海海域水質(zhì)主要超標(biāo)要素為無機(jī)氮和活性磷酸鹽，呈富營養(yǎng)化狀態(tài)的海域面積達(dá)56 680 km2，氮、磷濃度在不同海域變化較大。由于大型海藻生產(chǎn)力很高，在生長過程中可大量吸收碳、氮、磷等生源要素，因此，栽培大型海藻是凈化養(yǎng)殖廢水、控制水域富營養(yǎng)化和保護(hù)生態(tài)環(huán)境的有效措施［1－3］。

海黍子（Sargassummuticum）屬褐藻門，馬尾藻科，是馬尾藻屬中一種重要的提取褐藻膠和多酚等活性物質(zhì)的主要原料之一，具有巨大的潛在經(jīng)濟(jì)價(jià)值。此外，海黍子還具有適應(yīng)性廣、生長快、營養(yǎng)儲存庫大等特點(diǎn)，對海水中的富營養(yǎng)化物質(zhì)和重金屬等有較強(qiáng)的生物吸附能力［4－5］，具有重要的生態(tài)價(jià)值和較好的應(yīng)用前景，從而成為修復(fù)富營養(yǎng)化水域和構(gòu)建海藻場的研究熱點(diǎn)。氮、磷營養(yǎng)鹽是海藻細(xì)胞生長的重要限制性營養(yǎng)元素，對海藻的生長具有顯著影響［6－8］，在一定的濃度范圍內(nèi)會使藻類的生長速率升高，光合作用增加，但濃度過低或過高時(shí)，則對藻類的生長產(chǎn)生抑制作用。大型海藻對氮、磷營養(yǎng)鹽的吸收特性不僅因海藻種類存在差異，與海藻的生長環(huán)境和發(fā)育階段也顯著相關(guān)，盡管營養(yǎng)鹽濃度對海黍子生長的影響已有一些報(bào)道［5，9］，但高濃度氮、磷對海黍子藻體內(nèi)各種生化組分的生成和消耗以及抗氧化系統(tǒng)的調(diào)節(jié)等仍鮮見報(bào)道，而這方面的研究對弄清海黍子在人工增養(yǎng)殖過程中養(yǎng)殖環(huán)境的選擇及其在富營養(yǎng)化水域中進(jìn)行生物修復(fù)所持續(xù)的時(shí)間和對環(huán)境的適應(yīng)性等具有極其重要的意義。鑒于此，本研究通過實(shí)驗(yàn)生態(tài)學(xué)方法，探討不同氮、磷營養(yǎng)條件對海黍子的生長、生理生化特性以及抗氧化能力的影響，旨在為豐富海黍子人工增養(yǎng)殖技術(shù)體系，進(jìn)而為我國近海富營養(yǎng)化等環(huán)境污染的生物治理和可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用海黍子為2019年3月采集于山東榮成俚島近岸海域（37°25′N、122°59′E）潮下帶的野生群體。藻體采集后用保溫箱迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，用海水反復(fù)清洗去除泥沙及雜質(zhì)，置于循環(huán)水箱中充氣暫養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度15℃，光照強(qiáng)度5 000 lx，鹽度30.5，光周期12L∶12D，5 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 培養(yǎng)方法

實(shí)驗(yàn)在1 L的三角瓶中進(jìn)行，選取健康藻體，每瓶放置（4.0±0.1）g。培養(yǎng)液以天然海水（海水鹽度為基質(zhì)，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，用NaNO3、NaNO2、（NH4）2SO4、KH2PO4加富氮、磷濃度，其中各試驗(yàn)組中溶解無機(jī)氮（dissolved inorganic nitrogen，DIN）的濃度比設(shè)為5∶5∶1。實(shí)驗(yàn)分組如下：T1（對 照 組，天 然 過 濾 海 水），T2P），T3（100μmol·L－1DIN＋6.25μmol·L－1L－1DIN＋37.5μmol·L－1每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)條件同1.1，每隔一天更換培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)周期為15 d，在實(shí)驗(yàn)的1、3、7、15 d分別取樣進(jìn)行測定。

1.3 相對生長速率（relative growth rate，RGR）的測定

觀察藻體表觀性狀并稱量鮮質(zhì)量，按下式計(jì)算相對生長速率：

式（1）中，Wt為實(shí)驗(yàn)中期或結(jié)束時(shí)鮮藻體質(zhì)量（g），W0為實(shí)驗(yàn)開始時(shí)鮮藻體質(zhì)量（g），t為培養(yǎng)時(shí)間（d）。

1.4 氮、磷吸收速率測定

式（2）中，V為吸收速率［μmol·（g·h）－1］，S0、St分別為取樣時(shí)間間隔的起始和結(jié)束時(shí)培養(yǎng)液中氮、磷的濃度，V0為每次取樣時(shí)間間隔起始的培養(yǎng)液體積（L），t為取樣的時(shí)間間隔（h），B為實(shí)驗(yàn)開始時(shí)鮮藻體質(zhì)量（g）。

1.5 光合色素［葉綠素a（chlorphyll a，Chl-a）和類胡蘿卜素（carotenoid，Car）］含量測定

光合色素的提取和測定參照呂芳等［10］的方法測定。取0.1 g新鮮藻體在液氮中研磨成勻漿狀，加入8 mL 80%丙酮，然后置于4℃黑暗處抽提24 h。于4℃、4 000 r·min－1離心10 min，棄沉淀，上清用80%丙酮定容至10 mL。以80%丙酮作為空白對照，分別測定665、652、510、480 nm波長處的吸光值。重復(fù)3次以上，計(jì)算平均值。按下式計(jì)算葉綠素a和類胡蘿卜素的含量：

式（3）、式（4）中，V為浸提丙酮的體積（mL），W為鮮藻體質(zhì)量（g），葉綠素a和類胡蘿卜素含量的單位為mg·g－1。

1.6 可溶性蛋白含量測定

可溶性蛋白采用南京建成蛋白檢測試劑盒-考馬斯亮藍(lán)法測定。取1.0 g新鮮藻體在液氮中研磨成勻漿狀，加蒸餾水后離心定容到10 mL，作為待測溶液。

1.7 抗氧化系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)的測定

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxidase，POD）的活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。取1.0 g新鮮藻體在液氮中研磨成勻漿狀，加入4 mL提取液（50 mmol·L－1磷酸緩沖液，pH 7.0；0.1% Triton X-100；1% PVP），離心取上清作為待測溶液。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用單因素方差分析（one-way ANOVA）的Duncan法進(jìn)行組間多重比較，當(dāng)P＜0.05時(shí)為有顯著性差異。結(jié)果采用Origin 9.0進(jìn)行分析繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮、磷濃度對海黍子生長的影響

比較不同氮、磷濃度對海黍子相對生長速率的影響發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)3 d時(shí)，藻體RGR隨著氮、磷濃度的增加，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，除T6試驗(yàn)組與對照組無顯著性差異外（P＞0.05），T2、T3、T4、T5試驗(yàn)組的RGR隨著氮、磷濃度的增加較對照組分別上升了30.7%、61.7%、47.0%和23.8%；培養(yǎng)7 d時(shí)，各試驗(yàn)組的RGR均較3 d時(shí)有所下降，其中T2試驗(yàn)組仍顯著高于對照組，T6試驗(yàn)組則顯著低于對照組（P＜0.05），而其余3組均與對照組無顯著差異（P＞0.05）；培養(yǎng)15 d時(shí)，僅T2試驗(yàn)組的RGR與對照組無顯著差異，其他試驗(yàn)組均顯著低于對照組，且隨著氮、磷濃度的增加呈逐漸下降的趨勢，其中T6試驗(yàn)組RGR出現(xiàn)負(fù)增長，這可能是因?yàn)榈?、磷濃度過高對海黍子產(chǎn)生了毒害作用，抑制了其生長代謝過程（圖1）。

圖1 不同氮、磷濃度對海黍子相對生長速率的影響Fig.1 Effects of different N，P concentrations on relative growth rate of S.muticum

2.2 氮、磷濃度對海黍子吸收速率的影響

加富不同氮、磷濃度培養(yǎng)3 d后，海黍子對3種形態(tài)氮和磷的吸收速率見圖2。隨著氮、磷濃度的增加，藻體對3種形態(tài)氮和磷的吸收速率均呈逐漸升高的趨勢，且均較對照組存在顯著性差異（P＜0.05）；比較3種形態(tài)氮的吸收速率發(fā)現(xiàn)，海黍子對NH＋4-N的吸收速率略高于NO－3-N，但兩者間差異不顯著（P＞0.05），而對NO－2-N的吸收速率則顯著低于NH＋4-N和NO－3-N。

圖2 海黍子對不同形態(tài)氮和磷吸收速率的比較Fig.2 Comparison of different forms of N and P absorptivity rates in S.muticum

2.3 氮、磷濃度對光合色素含量的影響

海黍子光合色素的含量均受到氮、磷濃度和培養(yǎng)時(shí)間的影響。在3 d時(shí)，T3、T4、T5、T6試驗(yàn)組葉綠素a的含量隨著氮磷濃度的升高均有增加；在7 d時(shí)，藻體葉綠素a的含量隨著氮、磷濃度的升高呈先上升后下降的趨勢，在T4試驗(yàn)組中達(dá)到最大值，氮、磷濃度較低的4個(gè)試驗(yàn)組藻體葉綠素a的含量顯著高于對照組（P＜0.05）；至15 d時(shí)，各試驗(yàn)組葉綠素a的含量均有所下降，除T1試驗(yàn)組與對照組無顯著差異外，其余4組則顯著低于對照組（P＜0.05）（圖3-A）。

在培養(yǎng)3 d時(shí)，各試驗(yàn)組類胡蘿卜素的含量均顯著升高，隨著氮、磷濃度的升高，T2、T3、T4、T5、T6試驗(yàn)組分別比對照組高22.0%、26.1%、26.2%、39.5%和35.8%；培養(yǎng)7 d時(shí)，T3、T4、T5、T6試驗(yàn)組類胡蘿卜素的含量仍顯著高于對照組，其中T4試驗(yàn)組最高；培養(yǎng)15 d時(shí)，各試驗(yàn)組變化各異，其中T2試驗(yàn)組仍顯著高于對照組（P＜0.05），T3試驗(yàn)組與對照組差異不顯著（P＞0.05），T4、T5、T6試驗(yàn)組較對照組則顯著降低（圖3-B）。

圖3 不同氮、磷濃度對海黍子光合色素含量的影響Fig.3 Effects of different N，P concentrations on photosynthetic pigments of S.muticum

2.4 氮、磷濃度對可溶性蛋白含量的影響

氮、磷濃度對海黍子可溶性蛋白含量的影響比較顯著，培養(yǎng)3 d時(shí)，T2、T3試驗(yàn)組與對照組無顯著差異，而T4、T5、T6試驗(yàn)組顯著升高，但3組間差異并不顯著（P＞0.05）；培養(yǎng)7 d時(shí)，各試驗(yàn)組可溶性蛋白含量均顯著高于對照組，且隨著氮、磷濃度的升高呈先上升后下降的趨勢，其中T5試驗(yàn)組最高；至15 d時(shí)，T2、T3、T4、T5、T6試驗(yàn)組可溶性蛋白含量分別是對照組的1.16、1.25、1.25、2.06和1.61倍，差異顯著（P＜0.05）（圖4）。

圖4 不同氮、磷濃度對海黍子可溶性蛋白含量的影響Fig.4 Effects of different N，P concentrations on soluble protein content of S.muticum

2.5 氮、磷濃度對SOD、CAT、POD活性和MDA含量的影響

各試驗(yàn)組SOD活性的變化隨氮、磷濃度的升高呈現(xiàn)差異性，其中T2試驗(yàn)組SOD活性在培養(yǎng)3 d時(shí)略有下降，7 d后與對照組無顯著性差異（P＞0.05）；T3試驗(yàn)組在培養(yǎng)3 d時(shí)，其藻體SOD活性較對照組無顯著差異，7 d時(shí)，較對照組上升了13.8%，15 d又降至對照組水平；T4、T5、T6組在實(shí)驗(yàn)期間SOD活性均保持在較高水平，15 d時(shí)分別比對照組高出15.3%、11.5%和12.8%（圖5-A）。

實(shí)驗(yàn)期間，各試驗(yàn)組藻體CAT活性隨氮、磷濃度的升高均呈先升高后下降的趨勢。T2試驗(yàn)組CAT活性僅在培養(yǎng)7 d時(shí)略低于對照組，其他時(shí)間均與對照組無顯著差異（P＞0.05）；T6試驗(yàn)組CAT活性在15 d內(nèi)均顯著低于對照組，其中15 d時(shí)僅為對照組的52.2%；T3、T4、T5試驗(yàn)組CAT活性則顯著高于對照組，至15 d時(shí)較對照組分別高10.2%、26.4%和56.8%（圖5-B）。

培養(yǎng)3 d時(shí)，POD活性試驗(yàn)組T2、T3、T4藻體與對照組無顯著差異，而T5、T6組POD活性則顯著高于對照組（P＜0.05）；培養(yǎng)7 d時(shí)，藻體POD活性隨氮、磷濃度的升高呈逐漸上升的趨勢，其中T4、T5、T6組較對照組分別升高22.2%、47.9%和56.1%；至15 d時(shí)，除T6組POD活性略有下降外，其余各試驗(yàn)組仍呈上升趨勢（圖5-C）。

MDA含量在實(shí)驗(yàn)期間均隨著氮、磷濃度的增加呈逐漸上升的趨勢，除T2、T3組在培養(yǎng)3 d時(shí)MDA的含量略低于對照組外，其余各組MDA的含量在實(shí)驗(yàn)期間較對照組均有不同程度的升高，尤其是T5、T6試驗(yàn)組MDA含量在培養(yǎng)7 d后急劇升高，至15 d時(shí)較對照組分別上升了127.1%和312.7%（圖5-D）。

圖5 不同氮、磷濃度對海黍子抗氧化系統(tǒng)的影響Fig.5 Effects of different N，P concentrations on antioxidant system of S.muticum

3 討論

3.1 氮、磷濃度對海黍子生長的影響

海藻的生長受海水中營養(yǎng)鹽的影響，其中氮、磷是主要的限制性營養(yǎng)元素。本研究結(jié)果表明，氮、磷濃度和培養(yǎng)時(shí)間顯著影響海黍子的生長。氮、磷濃度在不高于400、25μmol·L－1下，培養(yǎng)3 d時(shí)，藻體的生長速率隨著氮、磷濃度的升高而增加，這與YU和YANG［6］報(bào)道的龍須菜（Gracilarialemaneiformis）在氮、磷濃度較高的情況下生長速率增大的結(jié)果一致，其原因是海水中營養(yǎng)鹽濃度的上升可使藻體利用營養(yǎng)生長的一系列生理過程的底物濃度升高，從而使海藻的同化作用增加，促進(jìn)藻體生長。而當(dāng)海水中氮、磷含量超過一定濃度后，其對藻類的生長則產(chǎn)生抑制作用，本研究也進(jìn)一步證實(shí)了海藻生長存在臨界營養(yǎng)鹽濃度［11］，超過該臨界值反而不利于海藻的生長。當(dāng)繼續(xù)培養(yǎng)至7 d時(shí)，氮、磷濃度超過100、6.25μmol·L－1，隨著氮、磷濃度的升高藻體生長速率有下降的趨勢，可見該臨界營養(yǎng)鹽濃度與海藻的營養(yǎng)狀態(tài)有關(guān)，當(dāng)海藻處于營養(yǎng)虧損狀態(tài)下，營養(yǎng)鹽加富會導(dǎo)致海藻出現(xiàn)超補(bǔ)償生長［12］，當(dāng)海藻處于營養(yǎng)過剩條件下，營養(yǎng)的持續(xù)加富會由促進(jìn)作用轉(zhuǎn)為抑制作用。因此海黍子在人工增養(yǎng)殖過程中養(yǎng)殖海區(qū)的選擇尤為重要，氮、磷濃度在不超過400、25μmol·L－1時(shí)海黍子生長良好，當(dāng)?shù)?、磷濃度上升?00、37.5μmol·L－1時(shí)，海黍子的生長在比較短的時(shí)間內(nèi)就會受到抑制。此外，氮磷比也是影響藻類生長的重要影響因素，這些都有待進(jìn)一步的研究。

3.2 氮、磷濃度對海黍子吸收速率的影響

在培養(yǎng)3 d時(shí)，海黍子對氮、磷的吸收速率隨著外界營養(yǎng)鹽濃度的升高而增大，而同期藻體的生長速率卻呈先升高后下降的趨勢，原因可能是當(dāng)?shù)?、磷濃度達(dá)到海藻生長所需的臨界營養(yǎng)鹽濃度時(shí)，藻類生長達(dá)到飽和狀態(tài)，而營養(yǎng)鹽濃度過高則導(dǎo)致營養(yǎng)鹽在藻體內(nèi)積累［6］。研究表明，海藻從環(huán)境中吸收的氮主要是形式，其中首先要被還原為才能為藻體所同化，所以當(dāng)環(huán)境中和等氮源共存時(shí)，絕大多數(shù)藻類總是優(yōu)先選擇吸收本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)和等量存在時(shí)，海黍子對兩種氮源的吸收無顯著差異，這可能與海黍子的生理狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)條件有關(guān)，也可能是不同形態(tài)氮之間的相互影響所致［14］，具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

3.3 氮、磷濃度對海黍子生化特性的影響

海水中氮、磷濃度的高低在影響?zhàn)B殖海藻生長的同時(shí)，也對藻體內(nèi)的各種生化組分（如色素、蛋白質(zhì)等）的含量進(jìn)行著調(diào)節(jié)。葉綠素作為藻類進(jìn)行光合作用的主要色素，其含量的多少直接影響光合速率和光合能力，此外葉綠素也是藻體內(nèi)一種重要的氮貯藏庫。研究表明，在外界氮源豐富的條件下，藻體細(xì)胞可以將外界的氮源合成葉綠素積累于葉綠體中，而在缺氮情況下，葉綠素就會降解釋放出氮以供應(yīng)細(xì)胞的生長，進(jìn)而起到調(diào)節(jié)氮源的作用［15］，因此養(yǎng)殖海藻葉綠素含量的變化對研究海藻的生長特征具有重要意義。本研究中氮、磷加富培養(yǎng)3 d時(shí)，可促進(jìn)海黍子藻體內(nèi)葉綠素a的生成，但繼續(xù)培養(yǎng)至15 d，氮、磷濃度高于100、6.25μmol·L－1時(shí)反而阻止了葉綠素a的生成，在其他一些大型海藻中也得到類似的結(jié)果［6，16］，推測其原因可能是高濃度的氮、磷抑制了葉綠素相關(guān)合成酶的活性，從而阻礙了葉綠素的合成，導(dǎo)致藻體內(nèi)葉綠素含量的顯著下降。類胡蘿卜素是光合作用的輔助色素，也是一種光氧化保護(hù)劑，本研究顯示其含量在氮、磷加富3 d時(shí)顯著升高，至15 d，氮、磷濃度高于200、12.5μmol·L－1時(shí)則顯著降低，進(jìn)一步說明過高濃度的氮、磷在長時(shí)間作用下會抑制海藻的生長。

藻體內(nèi)可溶性蛋白是衡量藻類代謝水平的重要指標(biāo)之一，其含量的升高有助于維持藻細(xì)胞的正常代謝，提高其抗逆性。NH＋4或NO－3是藻體內(nèi)蛋白質(zhì)合成的底物，因此海水中氮濃度的變化對蛋白質(zhì)的合成具有顯著影響。培養(yǎng)7 d后，各試驗(yàn)組可溶性蛋白含量均顯著升高，說明海黍子可能通過提高可溶性蛋白的含量來增加細(xì)胞滲透濃度和功能蛋白的數(shù)量，而啟動自身保護(hù)機(jī)制以維持藻細(xì)胞的正常代謝，其中當(dāng)?shù)?、磷濃度?00、25μmol·L－1培養(yǎng)15 d時(shí)，藻體可溶性蛋白含量達(dá)到峰值，提示海水中氮、磷濃度超過該值后，進(jìn)入藻體的氮、磷不能參與蛋白的合成和生長。

3.4 氮、磷濃度對海黍子抗氧化能力的影響

藻類在生長過程中，活性氧的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)。當(dāng)藻類處于逆境脅迫下，動態(tài)平衡被破壞，造成活性氧自由基的大量累積，由此啟動抗氧化酶類防御系統(tǒng)。SOD、CAT和POD是藻類細(xì)胞內(nèi)清除活性氧的主要抗氧化酶，其活性被認(rèn)為是藻類抗逆性的重要指標(biāo)［17－18］。本研究表明，氮、磷濃度和培養(yǎng)時(shí)間可顯著影響海黍子藻體的抗氧化酶系統(tǒng)。氮、磷濃度為50、3.13 μmol·L－1加富培養(yǎng)3 d時(shí)，CAT和POD活性沒有顯著變化，而SOD活性略有下降，表明該處理沒有造成藻細(xì)胞活性氧的積累。當(dāng)?shù)?、磷濃度升高?00、12.5μmol·L－1以上時(shí)，SOD活性顯著升高，而CAT的活性則在氮、磷濃度為600、37.5 μmol·L－1的試驗(yàn)組中顯著降低，推測發(fā)生此種變化的原因可能是藻體受脅迫后產(chǎn)生活性氧（ROS）的量上升，從而激活更多的SOD來清除活性氧，而產(chǎn)生的超氧化物進(jìn)一步歧化為H2O2，H2O2的大量積累導(dǎo)致CAT代謝失衡，活性下降。培養(yǎng)7 d后，SOD、CAT和POD 3種抗氧化酶活性變化各異，表明海黍子對海水中不同氮、磷營養(yǎng)條件的響應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜過程。對于作為衡量細(xì)胞膜脂損傷程度重要指標(biāo)的MDA含量，氮、磷濃度在低于200、12.5μmol·L－1的試驗(yàn)組中培養(yǎng)3 d時(shí)出現(xiàn)了短暫的下降，進(jìn)一步說明藻體內(nèi)活性氧可能沒有大量積累，膜脂過氧化程度較低，而持續(xù)培養(yǎng)7 d后，各氮磷加富試驗(yàn)組藻體MDA含量較之對照組均明顯升高，表明藻體內(nèi)活性氧增多，造成膜脂過氧化程度增強(qiáng)。這一現(xiàn)象說明，長期富營養(yǎng)化環(huán)境會使海黍子的抗逆性受到抑制，不但不能起到生物修復(fù)作用，反而受其脅迫，海黍子生長受到抑制。

4 小結(jié)

本研究探討了不同氮、磷營養(yǎng)條件下海黍子的生長、生理生化特性以及抗氧化能力的變化情況，表明氮、磷濃度在一定濃度范圍和培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)對海黍子生長起到明顯的促進(jìn)作用，而當(dāng)?shù)⒘诐舛瘸^一定值或培養(yǎng)時(shí)間時(shí)，海黍子的生長及藻體的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)開始受到抑制，并逐漸發(fā)生過氧化損傷，抗逆性受到抑制，該結(jié)果可為進(jìn)一步完善海黍子的健康養(yǎng)殖技術(shù)和對富營養(yǎng)化污染水域的修復(fù)機(jī)制研究提供一定的理論參考。