胡佳妮 劉睿 郝云濤 于曉晨 李臻 劉欣然 珠娜 康家偉 李勇

摘 要：目的：研究羅非魚膠原低聚肽（TCOPs）對功能性消化不良小鼠胃腸運動與腦腸肽的影響。方法：72只成年雄性ICR小鼠按體重隨機分為空白對照組、模型對照組、乳清蛋白組（500 mg/kg BW）和膠原低聚肽低、中、高劑量組（250、500、1 000 mg/kg BW）。模型組和受試物組采用鹽酸洛哌丁胺制作小鼠功能性消化不良模型。干預(yù)14 d后，進行小腸運動和胃排空功能實驗;觀察小鼠體重、體重增重、攝食量和食物利用率，測定血清P物質(zhì)、血管活性腸肽、胃泌素、胃動素含量。結(jié)果：TCOPs能明顯增加小鼠體重和提高食物利用率，使小鼠墨汁推進率顯著增加，胃內(nèi)殘留率明顯降低，并使血清GAS、MTL、SP水平顯著提高，VIP顯著降低。結(jié)論：羅非魚膠原低聚肽能通過提高食物利用率并促進小鼠體重增長，增強小腸蠕動與加速胃排空，調(diào)節(jié)腦腸肽水平，起到改善小鼠的功能性消化不良的目的。

關(guān)鍵詞：羅非魚膠原低聚肽;消化不良;胃腸運動;腦腸肽

功能性消化不良（FD）是最常見的功能性胃腸疾病之一，影響了全球10%～30%的人口[1]。FD的主要特征是餐后飽脹，早飽或上腹痛以及燒灼感等癥狀，而沒有任何器質(zhì)性問題可以解釋癥狀。目前，已經(jīng)提出了許多病理生理機制來解釋不同的臨床癥狀，以飽腹、上腹部不適或惡心為特征的胃腸動力障礙和腦-腸相互作用異常被報道為FD患者的主要致病因素[2-3]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）或腸神經(jīng)系統(tǒng)（ENS）的失調(diào)可導致胃腸道感覺和運動障礙，影響大腦和腸道雙向通訊調(diào)節(jié)（腦腸軸）在胃腸道中起著重要的生理作用，因此腦腸軸的紊亂在FD的發(fā)病機制起著關(guān)鍵作用。腦腸肽被認為是胃腸道局部感覺神經(jīng)支配的生化標志物，可能與雙向腸腦交流有關(guān)[4]。腸蠕動依賴于根據(jù)Cajal間質(zhì)細胞（ICC）產(chǎn)生的慢電波，通過平滑肌的有節(jié)段性的收縮和松弛進行蠕動[5]。胃排空調(diào)節(jié)食糜進入十二指腸，當營養(yǎng)物質(zhì)與小腸粘膜相互作用，從而誘導大量神經(jīng)遞質(zhì)和激素的釋放，然后通過反饋作用來調(diào)節(jié)胃排空。

由于FD的發(fā)病機制尚未確定，臨床上的治療方法主要是對癥治療，包括根除幽門螺桿菌、質(zhì)子泵抑制劑（PPI）、選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑（SSRIs），三環(huán)抗抑郁藥（TCA）或促動藥[6]，但這些治療方法存在療效低、停藥后復(fù)發(fā)率高以及對人體有副作用等局限性。另一方面，尋找能夠降低或預(yù)防疾病風險的生物活性肽成為了學術(shù)熱點。許多實驗已經(jīng)報道了生物活性肽類在改善人體健康方面發(fā)揮重要作用，在胃腸系統(tǒng)表現(xiàn)為抗胃腸潰瘍[7]、潤腸通便[8]以及改善腸道菌群作用[9]，但在促消化功能方面報道甚少。膠原蛋白是重要的纖維結(jié)構(gòu)蛋白，補充膠原蛋白是保持人體健康的重要途徑，因具有出色的生化和生物相容性特征被生物醫(yī)學領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。近年來，從海洋魚類的膠原蛋白中獲得的低分子量生物活性肽由于具有良好的保濕性、溶解度、吸收率、低變應(yīng)原性和藥理活性，被廣泛應(yīng)用于化妝品、保健食品和藥品行業(yè)中[10]。我國是羅非魚的養(yǎng)殖與進出口大國，并且羅非魚營養(yǎng)價值高，魚鱗中膠原蛋白含量豐富，是制備膠原蛋白生物活性肽的優(yōu)質(zhì)原料[11]。從羅非魚鱗中利用生物酶解技術(shù)得到羅非魚膠原低聚肽（TCOPs）是一種小分子生物活性肽，因分子量低而具有良好的吸收性，且炎癥反應(yīng)極小，胃腸道耐受性好。本研究評估了不同劑量TCOPs對鹽酸諾哌丁胺誘導的FD模型小鼠的主要癥狀（包括小腸運動異常和胃排空延遲）的作用以及對腦腸肽的影響，為支持TCOPs在胃腸道健康保健與臨床促消化的應(yīng)用提供科學實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF級成年雄性ICR小鼠72只，體重18～22 g，許可證號：SYXK（京）2016-0041，由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供，分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)于SPF級動物室。實驗期間動物自由飲水、進食。

1.2 主要試劑與儀器

TCOPs為白色固體粉末，主要成分為分子量小于1 000 Da的低聚肽，具體分子量分布為<180 Da （9.97%）、180～500 Da （56.06%）、500～1 000 Da（26.67%），海南盛美諾生物技術(shù)有限公司;鹽酸洛哌丁胺膠囊，西安楊森制藥有限公司;印度墨水，北京寶瑞杰科技有限公司;小鼠GAS、MTL、SP、VIP試劑盒，上海藍基生物科技有限公司;高速冷凍離心機，德國EPPendorf公司;MULTISKAN MK3全自動多功能酶標儀，美國Thermo公司;DH4000A電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津泰斯特。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組與處理 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，ICR小鼠按照體重隨機分為6組：空白對照組、模型對照組、乳清蛋白組和膠原低聚肽低、中、高劑量組。每日1次灌胃給予受試樣品，空白對照組和模型對照組給予蒸餾水，乳清蛋白組和核桃肽組給予相應(yīng)濃度受試物，膠原低聚肽和乳清蛋白溶液均用蒸餾水配制。灌胃量按10 mL/kg體重計算，每周按體重調(diào)整受試樣品劑量。ICR小鼠干預(yù)周期為14 d。分別進行以下實驗。

1.3.2 體重、體重增重、攝食量和食物利用率實驗[14]干預(yù)期間每周測ICR小鼠的體重和食物攝入量，14 d干預(yù)結(jié)束后計算小鼠體重、體重增重、攝食量和食物利用率。

1.3.3 小腸運動實驗[14，16] 小鼠實驗結(jié)束前禁食不禁水16 h，實驗當天各劑量組再給予一次受試樣品，30 min后各實驗組和模型對照組給予鹽酸洛哌丁胺（劑量：5 mg/kg）[17]進行造模，空白對照組給予蒸餾水，30 min后各組再給予墨汁，25 min后麻醉狀態(tài)下脫頸處死小鼠，打開腹腔分離腸系膜，剪取自幽門至回盲部的腸管，置于托盤上輕輕拉直，測量腸管長度為“小腸總長度”，由幽門至墨汁前沿為“墨汁推進長度”。按式（1）計算墨汁推進率，以評價小腸運動功能。

墨汁推進率（%）=墨汁推進率小腸總長度×100%（1）

1.3.4 胃排空功能實驗[12-13] 暴露小鼠腹腔，結(jié)扎胃賁門和幽門取胃，用濾紙拭干后稱重胃總質(zhì)量，沿胃大彎剪開胃部，4 ℃生理鹽水沖洗去胃內(nèi)容物后拭干，稱重胃凈質(zhì)量，計算胃內(nèi)容物殘留率，以評價小鼠胃排空功能。

胃內(nèi)容物殘留率（%）=胃總質(zhì)量-胃凈質(zhì)量墨汁質(zhì)量×100%（2）

1.3.5 胃腸激素水平的測定 小鼠末次灌胃后，眼眥取血，混勻，常溫放置15 min，冷藏于4 ℃，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，即血清。按照酶聯(lián)免疫測試盒的使用方法對小鼠血清胃泌素、MTL、VIP、P物質(zhì)進行測定。

1.4 統(tǒng)計方法

正態(tài)數(shù)據(jù)均以平均值±標準差（±s）表示，采用IBM SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析，差異顯著者進行方差齊性檢驗，方差齊者以LSD法對多組平均值之間的差異進行分析，方差不齊者以Dumnett’s T3法對多組平均值進行post-hoc分析。對方差不齊者用非參數(shù)檢驗Kruskal-allis法確定統(tǒng)計學差異。以P<0.05為差異顯著性標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 TCOPs對小鼠體重影響

在用TCOPs給小鼠連續(xù)喂養(yǎng)的14 d中，觀察到TCOPs干預(yù)組的小鼠每周的體重增長趨勢較對照組小鼠更為明顯;喂養(yǎng)結(jié)束時，TCOPs中、高劑量組小鼠體重明顯高于空白對照組（P<0.05），其中TCOPs高劑量組小鼠體重增長效果最顯著（表1）。

2.2 TCOPs對小鼠攝食量和食物利用率的影響

在用TCOPs喂養(yǎng)干預(yù)14 d后，TCOPs低、中、高劑量組體重增重呈現(xiàn)遞增趨勢，與對照組相比，TCOPs各劑量組體重增重均明顯提高（P<0.05）;在攝食量方面，各實驗組間無顯著差異（P >0.05），但TCOPs各劑量組食物利用率明顯高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表2）。

2.3 TCOPs對小鼠腸推進功能的影響

相對于空白對照組，模型對照組小鼠的墨汁推進長度和墨汁推進率顯著降低，（P<0.01），這說明小鼠造模成功。與模型對照組比較，TCOPs低劑量組小鼠墨汁推進率明顯增加（P<0.05），TCOPs中、高劑量組小鼠墨汁長度和推進率顯著增加（P<0.01）;相對于乳清蛋白組，TCOPs高劑量組小鼠墨汁推進率明顯增加（P<0.05）（表3）。

2.4 TCOPs對胃排空功能的影響

相對于空白對照組，模型對照組小鼠的胃內(nèi)殘留率顯著提高（P<0.01），這說明小鼠胃排空障礙模型構(gòu)建成功。TCOPs各干預(yù)組小鼠胃內(nèi)殘留率隨劑量的增加呈遞減趨勢;與模型對照組比較，TCOPs高劑量組胃內(nèi)殘留率明顯減低（P<0.05）（表4）。

2.5 TCOPs對小鼠腦腸肽的影響

相比于空白對照組，模型對照組小鼠血清GAS、MTL、SP含量明顯下降，VIP含量明顯上升。與模型組相比，TCOPs高劑量組小鼠血清GAS、MTL、SP含量明顯升高（P<0.05），VIP含量明顯降低（P<0.05）（表5）。

3 討論

鹽酸洛哌丁胺是一種μ阿片受體激動劑，阻斷胃腸道的μ阿片受體和拮抗鈣調(diào)蛋白是洛哌丁胺影響腸動力作用的兩個主要分子機制[14-15]。鹽酸諾哌丁胺已被用于在嚙齒動物模型中引起消化不良癥狀，在最近的研究中，洛哌丁胺可導致小鼠中的胃排空延遲和腸動力降低[16-17]。此外，本次實驗設(shè)置了乳清蛋白組作為陽性對照，以消除額外攝入蛋白質(zhì)對本研究的影響。

進入胃腸道的食物和營養(yǎng)物質(zhì)在經(jīng)機械性和酶類的化學性消化的共同作用后，變成可吸收的小分子物質(zhì)被機體利用以促進生長，因此消化功能與體重、攝食量和食物利用率密切相關(guān)[18]。觀察小鼠每周體重的變化趨勢，經(jīng)TCOPs灌胃干預(yù)的小鼠體重增速較快，喂養(yǎng)結(jié)束時，TCOPs組小鼠體重與空白對照組小鼠體重相比存在顯著差異，TCOPs可以明顯促進小鼠的體重增長與提高食物利用率。小腸運動實驗和胃排空實驗結(jié)果顯示，模型對照組小腸墨汁推進率明顯低于空白對照組，胃內(nèi)殘留率顯著高于空白對照組，說明小鼠功能性消化不良模型造模成功。胃排空是食物進入十二指腸的過程，大多數(shù)FD患者患有胃腸動力障礙，這與胃排空延遲有關(guān)[19]。一項以胃電圖為基礎(chǔ)的臨床研究發(fā)現(xiàn)，延遲的腸道運動與胃排空障礙之間存在密切聯(lián)系[20]。本次實驗中，TCOPs干預(yù)組相較于模型對照組小腸墨汁推進率明顯提高，其中高劑量組墨汁推進效果尤為顯著。胃排空方面，TCOPs高劑量組小鼠的胃內(nèi)殘留率明顯低于模型對照組，提示TCOPs不僅可以顯著增強小腸節(jié)律性蠕動，還具有增強胃排空功能的作用。

GAS是幽門腺某些細胞分泌的多肽激素，強烈刺激胃酸和胃蛋白酶的分泌，并輕度刺激胰酶的分泌和膽囊的收縮[21]。MTL的主要功能是增加GI運動的遷移的肌電復(fù)合物成分、刺激胃蛋白酶的分泌并促進腸道蠕動，并且MTL水平的變化與胃排空異常密切相關(guān)[22-23]。所有這些表明，MTL水平降低會通過減弱胃腸道的運動性誘發(fā)消化不良。VIP是一種從ENS釋放到許多胃腸道區(qū)域的重要腦腸肽，它參與胃腸的分泌和運動，并具有血管舒張作用，可以通過放松平滑肌，抑制圓形平滑肌層的蠕動反射，延遲胃排空并減慢小腸蠕動[24-25]。SP是速激肽神經(jīng)肽家族的成員，不平衡的速激肽能系統(tǒng)會導致胃腸運動和分泌紊亂。有研究顯示，在FD患者中，胃竇SP濃度與胃脹時的不適和痛覺閾值呈顯著負相關(guān)[26]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TCOPs通過增加GAS、MTL、SP和降低VIP等腦腸肽的產(chǎn)生，以調(diào)節(jié)對胃腸道運動和分泌，緩解FD癥狀。

4 結(jié)論

綜上所述，本項研究通過建立功能性消化不良小鼠模型探討TCOPs對FD小鼠胃腸運動和腦腸肽的影響，結(jié)果顯示TCOPs能明顯促進小鼠體重和食物利用率增長，增進小腸推進率，減少胃內(nèi)殘留率。同時，TCOPs對功能性消化不良小鼠GAS、MTL、SP與VIP具有調(diào)節(jié)作用，通過影響腦腸肽上調(diào)腦腸軸，糾正胃腸道激素紊亂。TCOPs通過以上機制具有增強胃腸蠕動與促消化的作用，表明TCOPs具有治療FD的潛力，但相應(yīng)的效果需要在人群試驗中進行更為深入的探討與驗證。◇

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Effect of Tilapia Collagen Oligopeptide on Gastrointestinal Motility

and Brain Intestinal Peptide in Mice with Functional Dyspepsia

HU Jia-ni，LIU Rui，HAO Yun-tao，YU Xiao-chen，LI Zhen，LIU Xin-ran，ZHU Na，KANG Jia-wei，LI Yong

（Department of Nutrition and Food Hygiene，School of Public Health，Peking University，Beijing 100191，China）

Abstract：Objective To evaluate the effects of tilapias collagen oligopeptide（TCOPs）on gastrointestinal motility and brain intestinal peptide in mice with functional dyspepsia.Method Totally 72 adult male ICR mice were randomly divided into blank control group，model control group，whey protein group （500 mg/kg BW）and low，medium and high dose group （250，500，1 000 mg/kg BW）.The functional dyspepsia model of mice was made by loperamide hydrochloride in the model group and the subjects group.After 14 days of intervention，the small intestine movement and gastric emptying function were tested to observe the weight，weight gain，food intake and food utilization of mice，and determine serum P substances，vasoactive intestinal peptide，gastrin，motilin content.Result TCOPs could significantly increase the weight and the food utilization rate of mice，and significantly increase the ink propulsion rate，significantly reduce the gastric residual rate，and significantly increase the serum GAS，MTL，SP levels while VIP levels reduced in the TCOPs group.Conclusion TCOPs can improve food utilization and increase weight gain in mice，enhance small intestinal motility and accelerate gastric emptying，and regulate the level of brain-gut peptide，to improve functional dyspepsia in mice.

Keywords：tilapia collagen oligopeptide;dyspepsia;gastrointestinal motility;braingut petide