劉寶海，劉 晴，聶守軍，劉寶民，付立新，王明泉，高世偉，劉宇強，常匯琳，張佳檸，馬 成，薛英會，白 瑞，王洪彬，唐 銘，門龍南

(1. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院綏化分院，綏化 152052; 2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，哈爾濱 150086;3. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶 163319)

中國是世界上最大水稻生產(chǎn)國[1]，稻米是中國約65%人口的主食[2]。水稻作為黑龍江省主要糧食作物，2017年種植460多萬hm2，約占全國粳稻種植面積50%以上[3]，新品種選育為黑龍江水稻單產(chǎn)提高、總產(chǎn)持續(xù)增加和綜合生產(chǎn)能力穩(wěn)定提升做出了突出貢獻[4]，對保障國家糧食安全生產(chǎn)和國計民生意義重大[5-6]。水稻品種綏粳18，2014年1月通過黑龍江省農(nóng)作物品種審定委員會審定，具有早熟、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、耐冷、抗病和抗倒伏等優(yōu)良特性[7]，種植推廣適應(yīng)性極強，2017—2019年在黑龍江省種植面積連續(xù)達到67萬hm2以上，已成為黑龍江省第二、三積溫帶主裁品種，是全國種植面積最大粳稻品種[8]。然而，根據(jù)以往黑龍江省大面積推廣品種的種植經(jīng)驗來看，隨著種植年限延長，會出現(xiàn)抗病性和抗倒伏性逐漸弱化現(xiàn)象，存在對水稻安全生產(chǎn)造成不良影響的潛在風(fēng)險，同時生產(chǎn)實踐對產(chǎn)量和品質(zhì)等遺傳累加有增效的新品種需求也較迫切，目前綏粳18種植面積較大而導(dǎo)致適應(yīng)區(qū)內(nèi)主裁品種單一和后備品種儲備不足的情況日益突顯。因此，以水稻生產(chǎn)安全且品種有益遺傳增效需求為索引，探索實用高效的育種途徑，立足替代或超越水稻品種綏粳18的育種目標，快速選育儲備出能夠遺傳綏粳18廣適性狀且綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的水稻新品種是非常必要的。

1928年，美國科學(xué)家Stadler最早進行輻射誘變育種[9]。中國輻射誘變育種研究始于1957年，起步較晚，但發(fā)展迅速[10]，截至2016年育成品種已占國際品種總數(shù)1/4強[11]。γ射線能量高、穿透力強，可以造成共價鍵斷裂，誘導(dǎo)DNA產(chǎn)生大片段缺失有效，最終導(dǎo)致植株性狀發(fā)生變異[12-13]。60Co-γ射線作為誘發(fā)源引入輻射育種，具有誘變突變率高、穩(wěn)定性好、育種周期短和可擴展遺傳基礎(chǔ)等優(yōu)點，是目前最常用輻射誘變源[14-15]，相比利用育種周期長和創(chuàng)造突變新變異類型有限的常規(guī)雜交方法[16]來講，輻射誘變水稻材料將是一個快速獲得多種突變新種質(zhì)的有效方法[17]。在育種實踐中射誘變水稻培育新品種和創(chuàng)制種質(zhì)新資源的成果最突出[18]。浙江省2000—2015年間利用輻射誘變育成245個，占省級審定品種60%以上，其中直接利用γ射線輻照育成品種16個[19]，湖南省自1985年以來誘變創(chuàng)制育成品種45個，目前有多個品種年種植面積均在6.67萬hm2以上[20]，而黑龍江省近20年間僅有五工稻1號和龍粳38號2個水稻品種是利用輻射誘變技術(shù)選育而成，僅占全省審定品種總數(shù)的0.68 %[21]。到目前為止，有關(guān)60Co-γ輻射影響黑龍江省水稻品種種子出苗及M1群體變化規(guī)律的研究還鮮有報道。因此，立足黑龍江省寒地稻作區(qū)，探索突破輻射育種研究成效差的現(xiàn)實瓶頸，助力新種質(zhì)創(chuàng)新挖掘和新品種選育具有重要實踐意義。

本研究以廣適性水稻品種綏粳18為供試材料，利用220 Gy、250 Gy和280 Gy3個60Co-γ射線輻射劑量誘變其成熟種子，探索輻射誘變對其種子活力緩沖期、出苗限制因子以及M1群體遺傳變異規(guī)律的影響，以期為開展替代或超越廣適性品種綏粳18的新種質(zhì)創(chuàng)新以及寒地水稻輻射育種可能有效途徑的探索提供一定的種質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為黑龍江省第二積溫帶廣適性主栽水稻品種綏粳18，種子來源于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院綏化分院。60Co-γ射線為輻射源，來源于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所輻射研究室。試驗于2019年在黑龍江省農(nóng)科院綏化分院水稻育種試驗基地進行。

1.2 試驗方法

分別于2019年2月27日、4月2日進行干種子輻射處理2，輻照劑量為220 Gy、250 Gy和280 Gy，劑量率為1.1 Gy·min-1，以0 Gy處理為對照（CK），每個處理200 g種子。

1.2.1 發(fā)芽試驗 選取2019年2月27日輻射處理和對照種子各500粒，分5期進行種子活力測定試驗，時期（D）相隔5 d，第1期為3月4日（D1、5 d）、第2期為3月9日（D2、10 d）、第3期為3月14日（D3、15 d）、第4期為3月19日（D4、20 d）。3次重復(fù)。

1.2.2 出苗試驗 選取4月16日（輻射后15 d）處理和對照種子育秧苗床播種，苗床上各選擇500粒行出苗試驗，3次重復(fù)。5月10日，各處理和對照秧苗本田栽插，每個處理10行，行長3 m，行距30 cm，株距13 cm，每穴1苗，生育期不防控稻瘟病，其他栽培管理與生產(chǎn)大田相同。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 發(fā)芽試驗 種子用蒸餾水浸泡1 d，取出種子置入鋪有一層濾紙發(fā)芽皿中，放置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱（上海新苗qxh300）中培養(yǎng)。3次重復(fù)。以胚芽長度大于1 mm即視為發(fā)芽，每天觀察其發(fā)芽數(shù)以計算發(fā)芽勢和發(fā)芽率，共觀測6 d。以培養(yǎng)箱中3 d發(fā)芽種子數(shù)計算發(fā)芽勢，以6 d發(fā)芽種子個數(shù)計算發(fā)芽率。隨機選取發(fā)芽后第6天芽苗30株，用游標卡尺分別測量其芽長和根長。發(fā)芽勢（GP）(%)＝3 d發(fā)芽種子數(shù)/試驗種子數(shù)×100 %；發(fā)芽率（GR）(%)＝6 d發(fā)芽種子數(shù)/試驗種子數(shù)×100 %；發(fā)芽指數(shù)（GI）＝ΣGt/Dt(Gt指時間t發(fā)芽數(shù)，Dt指相應(yīng)發(fā)芽日數(shù))；根活力指數(shù)（RAI）＝S×ΣGt/Dt(S指發(fā)芽苗根長)。

1.3.2 出苗試驗 4月24日（播種后8 d）調(diào)查出苗率，5月23日（播種后29 d）調(diào)查成苗率。成苗率(%)(SSR)＝成苗數(shù)/播種種子數(shù)×100。

1.3.3 本田調(diào)查考種 隨機選擇M1群體及對照處理各收獲100個單株，選擇分蘗數(shù)有代表性的10穗單株進行考種，調(diào)查成熟期、株高、分蘗穗數(shù)、穗實粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重及穗頸瘟、倒伏情況。數(shù)據(jù)調(diào)查采集按照黑龍江省種子管理局下發(fā)的《水稻田間調(diào)查標準與技術(shù)規(guī)程》執(zhí)行。

1.3.4 性狀權(quán)重分析 基于熵權(quán)法的方案優(yōu)選方法[22]，對M1群體及對照收獲考種的材料進行綜合熵權(quán)分析，具體實施步驟：

（1）設(shè)有m個待評單株、n個評價指標，評價各指標原始數(shù)據(jù)矩陣可表示為（1）式，標準化數(shù)據(jù)計算如式（2），確定標準化數(shù)據(jù)P：

式中Rij表示第i個評價對象第j個指標值。

式中Pij表示第i個評價對象第j個指標的綜合標準化值，m為評價單元數(shù)量。

（2）對于第i個評價單株，第j個指標，其信息熵eij可表示為（3）式：

式中ej表示第j個指標的信息熵。

（3）第j個指標的客觀權(quán)重，可表示為（4）式：

式中wj表示第j個指標的權(quán)重（熵權(quán)）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用IBM SPSS Statistics25.0 統(tǒng)計分析軟件進行方差和多重比較等分析，建立最優(yōu)擬合度曲線估算回歸方程。利用MATLAB（R2017a）軟件編輯源代碼，運行公式（1）—（3）求解。運用Origin2018數(shù)據(jù)分析軟件繪圖。本田試驗中各處理均沒有發(fā)生穗頸瘟和倒伏情況，280 Gy輻射處理M1群體生育期極晚無結(jié)實，這些指標及處理不進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻射對種子活力的影響

2.1.1 輻射緩沖期對種子活力影響 受不同緩沖期（輻射至播種時的間隔時間）影響，綏粳18種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率達到顯著差異水平，芽長和根活力指數(shù)未達顯著差異水平（圖1）。D3處理發(fā)芽勢92.0 %，發(fā)芽率97.8 %，與其他處理間差異水平趨勢相同，均表現(xiàn)為D3處理大于D2和D1處理且達極顯著差異水平，D4處理小于D3處理但未達顯著差異水平；D3處理芽長19.7 mm，根活力指數(shù)155.1均大于其他處理。說明，緩沖期在D3處理時，60Co-γ輻射綏粳18種子活力最強。

圖1 不同輻射緩沖期對綏粳18種子活力性狀影響多重比較Figure 1 Multiple comparison of radiation buffer period on seed vitality traits of Suijing18

2.1.2 不同輻射劑量對種子活力影響 D3處理條件下，綏粳18種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、芽長和根活力指數(shù)受不同輻射劑量處理影響，均達到顯著差異水平（圖2）。280 Gy處理發(fā)芽勢94.0%大于其他處理，發(fā)芽勢280 Gy與250 Gy處理間未達顯著差異水平，但與0 Gy和220 Gy處理達極顯著差異水平。250 Gy發(fā)芽率95.0 %，與其他處理達差異顯著水平，隨輻射劑量增加呈現(xiàn)先下降再升高趨勢。280 Gy處理芽長12.6 mm，根活力指數(shù)50.0均為最小值，與0 Gy和220 Gy處理達極顯著差異水平，與250 Gy處理未達顯著差異水平，0 Gy處理芽長33 mm和根活力指數(shù)406.1均大于220 Gy處理且達極顯著差異水平。說明D3處理的綏粳18種子，在0～280 Gy劑量范圍內(nèi)，輻射劑量增加對發(fā)芽勢具有促進作用，對發(fā)芽率具有先抑制后促進作用，而對芽長和根活力指卻具有抑制作用。

圖2 D3緩沖期不同輻射劑量對綏粳18種子活力性狀多重比較Figure 2 Multiple comparison of different dosages of radiation on seed vigor traits in Suijing18 during the buffer period of D3

2.2 輻射對種子出苗的影響

綏粳18種子出苗率和成苗率受不同輻射劑量處理影響而表現(xiàn)出差異性（圖3）。出苗率和成苗率隨輻射劑量增加而呈現(xiàn)相似的減少趨勢，其中280 Gy處理時最小，均僅有7.0%，且與其他劑量處理達極顯著差異水平；其次是250 Gy處理時出苗率25.0%、成苗率24.0%，與220 Gy、0 Gy處理達極顯著差異水平；第3位是220 Gy處理時出苗率93.3%、成苗率92.0%，出苗率與0 Gy處理未達差異顯著水平，成苗率與0 Gy處理達差異極顯著水平。說明，在0～280 Gy60Co-γ輻射劑量范圍內(nèi)，綏粳18種子能夠出苗即可成苗，輻射劑量增加對二者均具有抑制作用且達顯著水平。

圖3 不同輻射劑量對綏粳18種子出苗影響多重比較Figure 3 Multiple comparison of different radiation doses on seedling emergence of Suijing 18 seeds

2.3 輻射對M1群體主要農(nóng)藝性狀的影響

2.3.1 M1群體主要農(nóng)藝性狀遺傳變異 綏粳18種子M1群體主要農(nóng)藝性狀表型值呈現(xiàn)不同差異（表1、圖4）。主要農(nóng)藝性狀表型變異系數(shù)平均值大小依次為：穗實粒數(shù)（43.2%）＞結(jié)實率（40.7%）＞分蘗數(shù)（28.6%）＞株高（5.7%）＞成熟期（0.5%）＞千粒重（0.4%）。除千粒重變異系數(shù)各處理間未達顯著水平外，其他農(nóng)藝性狀變異系數(shù)各處理間均達極顯著水平。輻射處理間達顯著差異水平的各性狀中，0 Gy處理變異系數(shù)在0%～4.4 %之間，呈現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性；220 Gy處理變異系數(shù)在0.5%～47.0%之間，穗實粒數(shù)（47.0%）＞結(jié)實率（39.6%）＞分蘗數(shù)（39.0%）＞株高（6.3%）＞成熟期（0.5%）；250 Gy處理變異系數(shù)在0.9%～79.1%之間，穗實粒數(shù)（79.1%）＞結(jié)實率（78.1%）＞分蘗數(shù)（42.9%）＞株高（8.6%）＞成熟期（0.9%）。說明，輻射綏粳18水稻種子，在M1代出現(xiàn)了廣泛的性狀差異，可能存在可遺傳變異，有利于育種選擇。

圖4 輻射M1群體主要農(nóng)藝性狀及變異系數(shù)多重比較Figure 4 Multiple comparison of main agronomic characters and coefficient of variation in population of radiation M1 population

表1 輻射M1群體主要農(nóng)藝性狀值比較Table 1 Comparison of main agronomic traits in population irradiated M1

成熟期隨輻射劑量增加而延長，各輻射處理間達極顯著差異水平，250 Gy處理成熟期平均值144 d，較0 Gy處理成熟期平均值134 d晚了11 d，田間試驗280 Gy處理未成熟而沒有收獲籽粒，這種成熟期延長變異對受積溫限制嚴格的寒地水稻育種是極其不利的；分蘗數(shù)有隨輻射劑量增加而增多的趨勢，且各輻射處理間達顯著差異水平，250 Gy處理分蘗數(shù)多于220 Gy處理且達顯著差異水平，多于0 Gy處理但未達顯著差異水平，220 Gy處理分蘗數(shù)少于0 Gy處理但未達顯著差異水平，并獲得代號2501904、2501908、2501903、2501905和2201909分蘗數(shù)達42、37、32、32和31株的高分蘗突變株，說明高劑量輻射對植株分蘗能力有促進作用。株高、穗實粒數(shù)和結(jié)實率性狀各輻射處理間達極顯著差異水平，且呈現(xiàn)隨輻射劑量增加而有減少趨勢，其中株高平均值220 Gy、250 Gy時達101.1 cm、101.0 cm未達顯著差異水平，但均低于0 Gy株高平均值109.7 cm且達極顯著差異水平，說明輻射有抑制植株長高的作用，穗實粒數(shù)平均值0 Gy、220 Gy和250 Gy時為105.5粒、37.0粒和19.1粒且達極顯著差異水平，結(jié)實率平均值0 Gy、220 Gy和250 Gy時為92.3 %、49.0 %和25.2 %且達極顯著差異水平，說明輻射有抑制植株穗實粒結(jié)實的作用。

2.3.2 M1群體主要農(nóng)藝性狀的相關(guān)性 對3個輻射劑量6個農(nóng)藝性狀的相關(guān)性分析顯示（表2），相關(guān)系數(shù)達顯著水平有6個，約占16個相關(guān)關(guān)系的37.5 %。成熟期與株高、穗實粒數(shù)和結(jié)實率相關(guān)系數(shù)為–0.449、–0.846和–0.849，呈極顯著負相關(guān)；株高與穗實粒數(shù)和結(jié)實率相關(guān)系數(shù)為0.612和0.570，呈極顯著正相關(guān)；穗實粒數(shù)與結(jié)實率相關(guān)系數(shù)為0.963，呈極顯著正相關(guān)，且為相關(guān)系數(shù)中最大值。以輻射劑量為自變量，以主要農(nóng)藝性狀為因變量，進行線性、二次、復(fù)合和Ligistic等11種函數(shù)最優(yōu)擬合度曲線估算，獲得擬合度極好的最優(yōu)回歸曲線方程（表3）。分蘗數(shù)和千粒重的11種擬合曲線F值不顯著。株高最優(yōu)二次函數(shù)P值為0.006達極顯著水平，但R2最大值僅為0.314，其擬合度不好。成熟期、穗實粒數(shù)和結(jié)實率的二次函數(shù)擬合度R2值為0.958、0.895和0.767，其擬合度極好，說明，可以根據(jù)輻射劑量對這3個農(nóng)藝性狀進行擬合推測。

表2 輻射M1群體主要農(nóng)藝性狀的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of main agronomic characters in irradiated M1 population

表3 M1群體主要農(nóng)藝性狀對輻射劑量的回歸分析Table 3 Regression analysis of main agronomic traits of M1 population to radiation dose

2.3.3 M1群體農(nóng)藝性狀分析 對3個輻射劑量6個農(nóng)藝性狀進行熵權(quán)分析（表4），權(quán)重值大小依次為：穗實粒數(shù)（0.528 01）＞結(jié)實率（0.352 72）＞分蘗數(shù)(0.113 87)＞株高（0.004 62）＞成熟期（0.00077）＞千粒重（0.000 01）。說明，穗實粒數(shù)、結(jié)實率和分蘗數(shù)的遺傳變異程度，將直接影響收獲單株的綜合性狀的表現(xiàn)。

表4 主要農(nóng)藝性狀指標權(quán)重值Table 4 Weight value of main agronomic traits

3 討論與結(jié)論

高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)及多抗是水稻育種永恒的主題[23]，種質(zhì)資源是遺傳改良及新品種培育的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[24-25]。實踐證明誘變育種可以打破基因連鎖，提高重組率，誘發(fā)產(chǎn)生自然界原來沒有的或一般常規(guī)方法難以獲得的新基因和新種質(zhì)[26]。目前，黑龍江省稻種質(zhì)資源相對匱乏且遺傳基礎(chǔ)相對狹窄[27-28]，嚴重制約著突破性水稻新品種選育，引入60Co-γ射線輻射源，探索廣適性品種綏粳18輻射誘變效應(yīng)規(guī)律，挖掘利用起源頭作用的優(yōu)異種質(zhì)資源，將是目前黑龍江選育突破性水稻新品種的可能有效途徑。

3.1 不同輻射后緩沖期對種子活力的影響

耿興敏等[29]研究表明，60Co-γ輻射處理后的砂藏期對桂花種子萌發(fā)狀況有影響。呂秀珍等[30]研究發(fā)現(xiàn)，大豆種子輻射后隨著貯藏日數(shù)增加而生長受抑制。作者查閱文獻關(guān)于水稻輻射后貯藏的緩沖期研究還鮮見報道。本研究通過綏粳18種子輻射后到播種時的緩沖期試驗室種子活力測定方法，獲得種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、芽長和根活力指數(shù)在輻射后15 d時最佳，明確了緩沖期15 d時為輻射種子最適宜土壤苗床播種期，規(guī)范統(tǒng)一有效的苗床播種時間，將有助于輻射后代材料表型遺傳性狀的充分表達。

3.2 不同輻射劑量對種子活力和出苗的影響

前人研究表明，隨著輻射劑量的加大，水稻種子發(fā)芽率明顯降低[17,31]。劉春貴等[32]研究表明，適宜劑量可以有效打破種子休眠，提高種子發(fā)芽率。謝崇華等[33]研究發(fā)現(xiàn)，輻照對水稻種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率影響不明顯，對水稻存活率有明顯影響。吳茂力等[34]研究表明，隨著γ射線輻照處理劑量的加大，供試陳種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)呈先升高，后又逐漸下降的趨勢。本研究表明，在0～280 Gy60Co-γ輻射劑量范圍內(nèi)，輻射劑量增加會對綏粳18種子發(fā)芽勢有顯著促進作用，發(fā)芽率有先抑制后促進的顯著作用，對芽長和根活力指數(shù)有顯著抑制作用，對土壤苗床出苗率和成苗率具有顯著抑制作用。結(jié)合試驗室種子活力和土壤苗床出苗率測定分析，明確了根活力指數(shù)和芽長成為了限制輻射種子出苗和成苗的主要因子，這可能與品種種子拱土能力有關(guān)，但還待進一步研究。

3.3 不同輻射劑量對M1群體遺傳變異的影響

本研究通過綏粳18種子輻射后M1群體主要農(nóng)藝性狀遺傳變異規(guī)律統(tǒng)計分析表明，在0～250 Gy60Co-γ輻射劑量范圍內(nèi)，隨著輻射劑量增加成熟期延長、分蘗數(shù)增加、株高變短、穗實粒數(shù)變少、結(jié)實率變小且達顯著差異水平，千粒重變化小未達顯著差異水平。成熟期延長與吳世長等[35]研究結(jié)果相同，但分蘗數(shù)增加卻與其研究結(jié)果不同。株高變短與富昊偉[36]研究結(jié)果相同，但與李偉等[17]研究結(jié)果不同。結(jié)實率變小與前人[17,35-36]研究結(jié)果相同。千粒重變化不顯著與李偉等[17]研究結(jié)果不同。這些不同表現(xiàn)，可能是不同品種基因型受輻射影響效應(yīng)不同所致，但還需要進一步探索。本研究表明，60Co-γ射線輻射能夠使M1群體主要農(nóng)藝性狀產(chǎn)生變異系數(shù)在0.4%～79.1%范圍內(nèi)的遺傳變異突變體材料，高輻射劑量對成熟期和分蘗數(shù)有促進作用達極顯著差異水平，對株高、穗實粒數(shù)和結(jié)實率有抑制作用達極顯著差異水平。M1群體主要農(nóng)藝性狀間存在相關(guān)性，表現(xiàn)為成熟期與株高、穗實粒數(shù)和結(jié)實率呈極顯著負相關(guān)，株高與穗實粒數(shù)和結(jié)實率呈極顯著正相關(guān)，穗實粒數(shù)與結(jié)實率相呈極顯著正相關(guān)，同時穗實粒數(shù)、結(jié)實率和分蘗數(shù)的遺傳變異權(quán)重較大，將直接影響收獲單株的綜合性狀的表現(xiàn)，為此可明確今后輻射世代育種材料選擇，要注重早熟、分蘗力強、植株較高、穗粒數(shù)多和結(jié)實率高等遺傳變異性狀的篩選。這些輻射材料后代能否遺傳相關(guān)性狀還待進一步研究。本研究結(jié)果為開展替代或超越廣適性品種綏粳18的新種質(zhì)創(chuàng)新以及寒地水稻輻射育種途徑的探索提供了一定的種質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)參考。