胡雅+潘亮+徐辰武

摘要：玉米[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因是顯性矮化基因，由于其突變體在DELLA區(qū)的堿基缺失而使其呈組成型表達抑制GA響應(yīng)，從而表現(xiàn)出植株矮小，種子發(fā)芽率低，葉片呈暗綠色等特性。對玉米[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因在來源廣泛的96份玉米自交系中進行了目標序列重測序，并與株高和穗位高2個株型性狀以及穗長、穗粗、軸粗、穗質(zhì)量、行粒數(shù)、穗行數(shù)和粒質(zhì)量7個穗部性狀進行關(guān)聯(lián)分析。[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因在供試玉米自交系中共有66個變異位點，包括18個SNP和48個InDel。在編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)24個變異位點，包括6個SNP和18個InDel位點。關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，玉米[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因中1個非同義突變位點與株高顯著關(guān)聯(lián)，另外1個非同義突變位點與穗長顯著關(guān)聯(lián)。

關(guān)鍵詞：玉米；骨干親本基因；株高；關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號： S513.03文獻標志碼：

赤霉素是植物重要的生長調(diào)控因子[1]，其最主要的功能就是控制莖的伸長生長。大量矮稈基因的研究結(jié)果表明，株高與赤霉素生物合成和赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)。

GA信號傳導(dǎo)途徑中基因突變時，部分持續(xù)對GA響應(yīng)的突變體表現(xiàn)為徒長，植株纖細并且葉片灰綠，這和施加過量GA的植株表型一樣；而無法對GA響應(yīng)的突變體表現(xiàn)為葉片深綠、植株矮化、育性降低等，這與GA突變體合成受阻的表型相同，并且不可以通過外源施加GA得以恢復(fù)[2-3]。在植物體中，DELLA蛋白質(zhì)是GA響應(yīng)的最主要抑制因子，而GA傳導(dǎo)途徑的開啟主要是通過解除這種抑制作用得以實現(xiàn)。DELLA蛋白質(zhì)在N端的DELLA結(jié)構(gòu)域中有2個保守元件：DELLA和VHYNP，這2個元件的DELLA類蛋白能夠抑制對赤霉素的響應(yīng)。本研究中的玉米[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因，其3個突變體[WTBX][STBX]d8-1、d8-2023[WTBZ][STBZ]和[WTBX][STBX]d8-Mp1[WTBZ][STBZ]在DELLA區(qū)、VHYNP區(qū)且2個區(qū)域同時缺失氨基酸導(dǎo)致植株呈明顯矮化[4]。這些表明，[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因通過在GA轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制GA響應(yīng)，來達到調(diào)控株高的目的。

玉米是世界三大糧食作物之一，也是集糧、飼、經(jīng)“三元一體”的優(yōu)勢作物。2003年我國科學(xué)家率先提出了農(nóng)作物“骨干親本”的概念。此后，很多研究者利用分子標記技術(shù)，對玉米、小麥、大麥等作物的一些骨干親本進行了分析，認為深入研究并充分利用骨干親本有助于育種效率的顯著提高。在我國的玉米生產(chǎn)中骨干親本主要有黃早四、MO17、掖478、丹340、自330這5個骨干親本，在育種中發(fā)揮了很重要的作用[5]。此外，作物的株高與抗倒性、產(chǎn)量等性狀緊密相關(guān)，是重要農(nóng)藝性狀之一。目前，矮稈作物在生產(chǎn)上已經(jīng)顯示了巨大的增產(chǎn)潛力，矮稈基因的發(fā)掘及遺傳研究利用在育種中越來越受重視。在玉米中，已經(jīng)有大量的矮稈突變體被發(fā)現(xiàn)，其中玉米[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]是一種對外源GA響應(yīng)并發(fā)生改變的矮化突變體。研究表明，玉米[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]突變體是由于[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因的DELLA結(jié)構(gòu)域有堿基的缺失和突變，從而導(dǎo)致了矮稈的突變表型[6]。因此，[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因與株高的關(guān)聯(lián)分析研究十分重要。此前，Thornsberry等首次運用了基于候選基因關(guān)聯(lián)分析的方法研究了玉米的[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因，發(fā)現(xiàn)[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因中有9個多態(tài)性位點與玉米開花期的變化顯著相關(guān)[4]；Camus-Kulandaivelu 等選用不同的玉米自交系也得出相同結(jié)論[7]。Andersen等用另一玉米自交系群體試驗證明玉米[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因序列多樣性與開花期和株高有關(guān)[8]。本研究選用來源廣泛的96份玉米自交系（包括5大骨干親本及其衍生系及糯玉米自交系）作為試驗對象，在對目標基因測序的基礎(chǔ)上，結(jié)合株高性狀的測定結(jié)果，利用候選基因的關(guān)聯(lián)分析方法，解析自然變異群體中[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因的序列變異對株高等性狀的作用及其影響，從而篩選出一些重要的變異位點以及優(yōu)異位點組合，為我國玉米骨干自交系優(yōu)良基因的有效利用和玉米優(yōu)質(zhì)育種提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐[9]。

1材料與方法

1.1試驗材料

本研究選取具有廣泛代表性的玉米自交系96份，包括我國溫帶玉米的5個雜種優(yōu)勢群的代表性種質(zhì)、熱帶/亞熱帶種質(zhì)、糯玉米自交系和來源于國外的種質(zhì)材料（表1）。供試材料于2014年夏季種植于青島基地，田間試驗采用完全隨機設(shè)計，重復(fù)2次。每個材料種植2行，每行10株，常規(guī)水肥田間管理。授粉20天后，每行選取5株，分別測量株高和穗位高。果穗收獲后晾干，考察穗部性狀，包括穗長、穗粗、軸粗、穗質(zhì)量、行粒數(shù)、穗行數(shù)、穗粒數(shù)。

1.2DNA的提取和基因重測序

采用改良的CTAB 法[10]完成DNA提取。用分光光度計檢測DNA濃度，并以B73的[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因（GRMZM2G144744）序列為模板，在供試材料中采用NimbleGen[11]平臺技術(shù)進行目標基因區(qū)段序列捕獲并重測序?；虻哪繕诵蛄卸c捕獲和重測序委托華大基因有限公司完成。NimbleGen定點序列捕獲主要是利用雜交和DNA微陣列技術(shù)基因分離原理來捕獲目標區(qū)域，與目前被廣泛采用的基因組重測序技術(shù)相比，該方法具有高特異性和高覆蓋度、捕獲區(qū)域可按需設(shè)計和省時省力等優(yōu)點。

1.3數(shù)據(jù)分析

2.3群體結(jié)構(gòu)分析

為了解關(guān)聯(lián)作圖群體的遺傳結(jié)構(gòu)，基于前期3 072個SNP分析自交系多樣性的數(shù)據(jù)，采用STRUCTURE軟件中基于數(shù)學(xué)模型的方法對96份自交系進行群體結(jié)構(gòu)分析，將每個自交系細分到相應(yīng)的亞群，通過分析比較發(fā)現(xiàn)，當K=3時，獲得了穩(wěn)定的α值，基于模型的亞群，大都與自交系的系譜來源和系統(tǒng)聚類結(jié)果一致（圖1）。在自交系不是完全血緣純和的情況下，群體結(jié)構(gòu)分析對關(guān)聯(lián)分析篩選特定準確等位變異位點起到了關(guān)鍵性的矯正作用。

2.4[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因的連鎖不平衡

連鎖不平衡（LD）是不同基因座位上等位基因的非隨機組合現(xiàn)象。關(guān)聯(lián)分析是利用等位基因間LD的統(tǒng)計特性預(yù)測染色體某個區(qū)段與表型性狀的關(guān)聯(lián)程度。r2則是一種與等位頻率相關(guān)的度量參數(shù)，被用來衡量2個位點間的LD水平（圖2）。在[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因的序列上分散分布著一些較強的LD結(jié)構(gòu)。基因[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]的多態(tài)性位點221、407和116、117、196、202，246和44、53、55，44和53、55，60和61、62，280和239，2 760 和66，816和813等之間均存在較強的連鎖不平衡結(jié)構(gòu)（r2>0.9）；如圖3，對[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因分析區(qū)LD的衰退程度進行檢測，以位點距離和連鎖不平衡參數(shù)r2作散點圖，發(fā)現(xiàn)玉米[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因的連鎖不平衡隨距離的增加而快速衰減，在500 bp左右就衰退至0.1水平。

2.5[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因與表型的關(guān)聯(lián)分析

分別對株高、穗位高、穗長、穗粗、軸粗、穗質(zhì)量、行粒數(shù)、穗行數(shù)和粒質(zhì)量共9個玉米產(chǎn)量性狀進行測定，方差分析結(jié)果表明，這9個農(nóng)藝性狀均在供試玉米自交系間存在極顯著差異（表4），這說明各性狀在不同自交系中具有較高的遺傳多樣性。利用變異系數(shù)表示每一性狀的絕對變異度，發(fā)現(xiàn)每一性狀均具有較高的變異度，但不同性狀的變異系數(shù)也存在較大差異。變異系數(shù)最高的為粒質(zhì)量，達到45.22%，變異系數(shù)最低的為穗粗，僅為12.59%。

利用TASSEL3.0 軟件中的MLM模塊對株高性狀與[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因序列多態(tài)性位點進行關(guān)聯(lián)分析。在編碼區(qū)內(nèi)共檢測到2個SNP位點與玉米株高存在顯著關(guān)聯(lián)（表5），這2個[CM（25]變異位點處于完全連鎖不平衡狀態(tài)，對株高的貢獻率為[CM）]

4.98%。這2個SNP中，SNP_2825為非同義突變，能引起蛋白質(zhì)序列的改變，位于編碼區(qū)的 SNP_1525變異位點也為非同義突變，并與穗長有關(guān)，貢獻率為10.94%。此外，在啟動子區(qū)SNP_286和SNP_301也處于完全連鎖不平衡狀態(tài)，并與穗位高顯著關(guān)聯(lián)，貢獻率為8.18%。除株高，穗位高和穗長之外，本研究中所鑒定的其他農(nóng)藝性狀不與[WTBX][STBX]Dwarf8基因序列變異存在顯著關(guān)聯(lián)。

3討論

豐富的變異是作物遺傳改良的基礎(chǔ)。作物種質(zhì)材料的變異包括表型特征的變異和遺傳基礎(chǔ)的變異。豐富的表型變異和核苷酸多樣性也是通過連鎖和關(guān)聯(lián)分析進行遺傳作圖的重要基礎(chǔ)[20]。本研究中的供試群體在表型性狀上存在明顯的差異，估計這些性狀大部分是由遺傳基礎(chǔ)起到主要作用。對目的基因進行核苷酸多態(tài)性分析，并進而通過遺傳轉(zhuǎn)化等途徑，為在分子水平上有目的的進行作物遺傳改良創(chuàng)造條件。SNP和InDel是基因核苷酸變異中最常見的，往往能引起表型的變異。這其中SNP是基因組中發(fā)生頻率最高、數(shù)量最多而且密度最大的變異。本研究中，我們對[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因進行了序列變異分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該基因位點上存在著豐富的變異。與非編區(qū)相比，編碼區(qū)的核苷酸變異頻率較低，主要是受到更多選擇壓力引起的，這種趨勢在其他許多基因的核苷酸變異研究中得到證實。Ching等對36個玉米自交系的18個基因進行了研究，發(fā)現(xiàn)每41 bp會有1個多態(tài)性位點，每47.7 bp處會有1個SNP，85 bp處會有1個InDel[21]。相比較而言，本研究中的SNP和InDel頻率都偏低，造成上述基因間變異頻率差異的主要原因是人工選擇、自然選擇以及遺傳漂變等。

玉米產(chǎn)量的形成是一個復(fù)雜的過程，受多個基因及基因網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，也受到各個性狀的影響。株高作為一個重要的農(nóng)藝性狀，對產(chǎn)量的作用有著深遠的影響[22-23]。育種家將半矮基因?qū)胱魑镆l(fā)了谷物產(chǎn)量飛躍的“綠色革命”。但綠色革命在提高谷物產(chǎn)量的同時，也帶來了許多不利的影響，如肥料濫用使得土壤變得貧瘠，殺蟲劑的大面積推廣造成了空氣、水源和土壤污染，農(nóng)民種植品種過于單一化導(dǎo)致遺傳多樣[JP3]性急劇降低。這些弊端嚴重影響了谷物的可持續(xù)發(fā)展，也使得運用新的品種改良理念和采取行之有效的舉措顯得更加重要。

矮稈玉米相對于高稈來說，有著不可比擬的優(yōu)勢，有著更高的干物質(zhì)轉(zhuǎn)化率，適宜密植，能實現(xiàn)高產(chǎn)，生產(chǎn)上具有巨大潛能。但矮源的遺傳多樣性低不利于玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)提高，大部分矮稈基因與某些不良性狀基因緊密連鎖，一因多效，使得這些基因的個體大多畸形，不便于繁殖利用。因此，創(chuàng)造或篩選新的矮源和矮稈基因?qū)τ衩子N和生產(chǎn)都具有重要的意義。本研究中在的目的基因[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]就是一個顯性矮化基因，由于其突變體在DELLA區(qū)的堿基缺失而使其呈組成型表達抑制GA響應(yīng)，使得突變體植株表現(xiàn)出植株矮小。本研究中在對其進行序列分析的基礎(chǔ)上，進一步對其變異位點與[CM（25][KG*8]株高、穗位高、穗長等9個產(chǎn)量相關(guān)性狀進行了關(guān)聯(lián)分析，[CM）]

4結(jié)論

玉米基因的全長序列在96個常用玉米自交系中共發(fā)現(xiàn)了48個SNP和18個InDel。該基因編碼區(qū)含有6個SNP，可將96個自交系劃分成20種單倍型，玉米[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因符合中性進化模型假設(shè)，沒有發(fā)生純化選擇，基于候選基因的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，該基因在編碼區(qū)的1個非同義突變與株高顯著關(guān)聯(lián)，另外1個非同義突變與穗長顯著關(guān)聯(lián)。研究結(jié)果表明，玉米[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因的變異位點可用于分子標記輔助選擇改良現(xiàn)有種質(zhì)，對中國玉米株型改良的分子設(shè)計育種具有一定的指導(dǎo)意義。

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