周袁，張鵬程，方強強，喻亞群，肖娟，2

（桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1.廣西肝損傷與修復(fù)分子醫(yī)學(xué)重點實驗室2.廣西神經(jīng)鞘脂代謝相關(guān)疾病基礎(chǔ)研究重點實驗室3.肝膽胰外科，廣西桂林541001）

胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD）仍是世界范圍內(nèi)最致命的癌癥之一[1]。據(jù)2018年全球腫瘤流行病統(tǒng)計數(shù)據(jù)（GLOBOCAN）顯示，PAAD每年可導(dǎo)致432 242 例以上的患者死亡，其在男性或女性癌癥病死率中排名第七[2-3]。隨著外科手術(shù)及化療不斷發(fā)展，PAAD 患者的生存率有所提高。但在一些國家，PAAD 患者的5年生存率仍低至2%[4-5]，其主要原因在于PAAD 的早期診斷困難[6-8]。因此，研究可用于PAAD 早期診斷的指標(biāo)至關(guān)重要。

III 型磷脂酰肌醇3-激酶（PIK3C3，也稱為VPS34），在低等真核生物、植物和哺乳動物體內(nèi)保守[9-10]。PIK3C3 蛋白是一種內(nèi)體激酶，在胞內(nèi)可通過與不同的多蛋白復(fù)合物結(jié)合而行使多種功能[11]。研究發(fā)現(xiàn)，PIK3C3 在哺乳動物中的生物學(xué)功能與小泡運輸?shù)恼{(diào)節(jié)有關(guān)，包括自噬、內(nèi)吞和吞噬作用等[12]。最近，自噬被發(fā)現(xiàn)與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13]，自噬在癌癥中發(fā)揮雙重作用[14]。一方面，腫瘤發(fā)生早期，自噬可清除損傷的蛋白及細(xì)胞器以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，進而抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展；另一方面，腫瘤發(fā)生晚期，自噬可通過降解蛋白質(zhì)或細(xì)胞器為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)，從而有助于腫瘤的發(fā)展。然而，自噬關(guān)鍵分子PIK3C3 在PAAD 中的作用并不十分清楚。

SMAD4 基因編碼Smad 家族成員蛋白，該基因的產(chǎn)物可調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[15]。SMAD4 蛋白質(zhì)可充當(dāng)腫瘤抑制因子并抑制上皮細(xì)胞增殖[16]。此外，鈣蛋白還可能通過減少血管生成和增加血管通透性而對腫瘤產(chǎn)生抑制作用[17-18]。該基因的突變或缺失可能導(dǎo)致PAAD[19-20]， 但其與PIK3C3 聯(lián)合在PAAD 中的作用未知。

本研究通過生物信息學(xué)分析和相關(guān)實驗驗證以了解PIK3C3 及SMAD4 聯(lián)合是否對PAAD 患者的診斷和預(yù)后產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集及處理

利用UALCAN 在線網(wǎng)站（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）分析PIK3C3及其相關(guān)基因SMAD4在PAAD 中的表達，分析PIK3C3 及SMAD4 基因與PAAD 預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)。從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas， TCGA）數(shù)據(jù)庫（http://cancergenome.nih.gov）下載4例正常對照及178 例PAAD 的千堿基百萬片段（FPKM）樣式數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq） 數(shù)據(jù)及匹配的臨床信息數(shù)據(jù)， 生存分析時將沒有生存信息的患者剔除（1 例）。

1.2 聚類分析

基于PIK3C3 和SMAD4 聯(lián)合的mRNA 表達水平，使用“ConsensusClusterPlus”R 軟件包進行聚類分析，將178 例PAAD 分為聚類1（101 例）和2（77 例）。通過“Limma”R 軟件包進行主成分分析（PCA）以分析兩個cluster 的區(qū)分度， 所得結(jié)果通過“ggplot2”R 軟件包進行可視化。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

PAAD 組織芯片購自上海芯超生物有限公司（貨號HPanA150Su01），PIK3C3 檢測芯片有效癌組織及癌旁組織例數(shù)分別為78 及59，SMAD4 檢測芯片有效癌組織及癌旁組織例數(shù)分別為66 及50，同時具備PIK3C3 及SMAD4 病理評分的癌組織例數(shù)為60。將組織樣本切片脫蠟再水化，然后在0.01 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）中進行熱誘導(dǎo)抗原決定簇修復(fù)，在3%過氧化氫和甲醇中封閉10 min?？筆IK3C3/VPS34 （Proteintech Group） 和抗SMAD4（Proteintech Group） 多克隆抗體分別與組織芯片4 ℃孵育過夜。孵育結(jié)束后，滴加適量反應(yīng)增強液、二抗聚合物各避光室溫下孵育20 min。DAB 染色5 min，復(fù)染，脫水，透明，封片。最后由多個病理學(xué)專家在顯微鏡下對蛋白表達水平進行評分。根據(jù)染色強度和染色面積將其分為4 個級別：0（陰性），1（弱陽性）， 2（中陽性）和3（強陽性）[21-22]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用R（版本3.6.1）進行了與R 相關(guān)的統(tǒng)計分析。使用秩和檢驗（Wilcoxon）比較癌組織和癌旁組織中PIK3C3 和SMAD4 的mRNA 表達差異。使用Kolmogorov-Smirnov 檢驗分析 了PIK3C3 及SMAD4 與PAAD 患者的臨床病理特征之間的關(guān)系。使用Kaplan-Meier 法分析兩個聚類之間的總生存期（OS）差異。采用獨立樣本t檢驗（SPSS）及ROC曲線AUC（GraphPad prism）分析PIK3C3 或SMAD4蛋白在PAAD 癌及癌旁組織的表達差異。采用Kaplan-Meier 法（Log-rank）分析PIK3C3 及SMAD4單獨及聯(lián)合在評估PAAD 患者預(yù)后中的作用。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PAAD中PIK3C3的mRNA表達分析及生存分析

UALCAN 網(wǎng)站分析得到的箱線圖表明，與正常組織相比，PAAD 組織中PIK3C3 mRNA 表達略有下降，但差異不明顯（P>0.05）（圖1A）。同時，分析結(jié)果表明PIK3C3 mRNA 表達對PAAD 患者的預(yù)后無明顯影響（P>0.05）（圖1B）。

圖1 PIK3C3 mRNA在PAAD中的表達及其對預(yù)后的影響 A：PIK3C3 mRNA在正常和PAAD組織中的表達情況；B：不同PIK3C3 mRNA表達水平PAAD患者的生存曲線Figure 1 The expression of PIK3C3 mRNA in PAAD and its effect on prognosis A:PIK3C3 mRNA expressions in PAAD and adjacent normal tissues;B:Survival curves of PAAD patients with different expression levels of PIK3C3 mRNA

2.2 與PIK3C3 mRNA表達相關(guān)的基因篩選

上述結(jié)果說明PIK3C3 mRNA 表達在癌和癌旁中的差異不明顯且其與PAAD 預(yù)后無明顯關(guān)系。PIK3C3 為自噬關(guān)鍵調(diào)控基因，且自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，故PIK3C3 可能與其他基因共同影響PAAD。利用UALCAN 分析得到在PAAD 中與PIK3C3 mRNA 共表達相關(guān)性最高的20 個基因，其中包括SMAD4（表1）。

表1 PAAD中與PIK3C3共表達最相關(guān)的前20個基因Table 1 Top 20 genes correlate to PIK3C3 in PAAD

2.3 基于PIK3C3 和SMAD4 mRNA 表達的共聚類分析

Wilcoxon 檢驗、R 熱圖分析結(jié)果顯示，PIK3C3和SMAD4 mRNA 在PAAD 中具有相似的表達模式，且兩者在PAAD 癌和癌旁中均無明顯差異（圖2）。采用基于PIK3C3 和SMAD4 mRNA 表達模式的聚類分析研究兩者聯(lián)合在PAAD 中的作用。k=2 即PAAD患者被分為聚類1 和聚類2，進一步使用主成分分析（PCA）比較聚類1 和聚類2 之間的轉(zhuǎn)錄譜，結(jié)果表明聚類1 和聚類2 之間有明顯的差別（圖3A-D）。與聚類1 比較，聚類2 中PIK3C3 和SMAD4 mRNA 表達水平更高，且65 歲以下的病例數(shù)更多（圖3E）。此外，在聚類1 中，PAAD 患者的總生存率比聚類2 中的患者明顯更短（P=0.006）（圖3F）。

圖2 在PAAD組織和正常組織中PIK3C3和SMAD4 mRNA的表達熱圖Figure 2 Heatmap of PIK3C3 and SMAD4 mRNA expres‐sion in PAAD tissues and adjacent normal tissues

圖3 一致性聚類分析 A：當(dāng)k=2 時，TCGA 隊列被分為聚類1 和聚類2；B：k=2～10 的一致性聚類累積分布函數(shù)（CDF）；C：k=2～10 CDF曲線下面積的相對變化；D：在TCGA數(shù)據(jù)集中2個亞組主成分分析（PCA）；E：每個亞組中PIK3C3和SMAD4的表達水平及臨床參數(shù)熱圖；F：聚類1與聚類2患者的OS曲線Figure 3 Consensus clustering analysis A:Two distinct clusters divided from the TCGA cohort when k=2; B:The consistency clustering cumulative distribution function(CDF)for k=2 to 10;C:Relative change in area under CDF curve for k=2 to 10;D:Principal component analysis(PCA)of 2 clusters of total RNA expression profile after consistency analysis of PAAD in the TCGA dataset;E:The heatmap for visualizing the expression levels of PIK3C3 and SMAD4,and clinical parameters in each cluster;F:OS curves of the two clusters of patients

2.4 SMAD4的mRNA表達分析及生存分析

以上結(jié)果表明SMAD4 可以與PIK3C3 聯(lián)合作用影響PAAD 的預(yù)后。從UALCAN 網(wǎng)站分析得到的箱線圖表明，與PIK3C3 類似，PAAD 組織中SMAD4 mRNA 表達下降，但不明顯（P>0.05）（圖4A）。同時，SMAD4 mRNA 表達與PAAD 患者的預(yù)后無明顯關(guān)系（P>0.05）（圖4B）。

圖4 SMAD4mRNA在PAAD中的表達及其對預(yù)后的影響 A：SMAD4 mRNA在正常和PAAD組織中的表達情況；B：不同SMAD4 mRNA表達水平PAAD患者的生存曲線Figure 4 The expression of SMAD4 mRNA in PAAD and its effect on prognosis A:SMAD4 mRNA expressions in PAAD and adjacent normal tissues;B:Survival curves of PAAD patients with different expression levels of SMAD4 mRNA

2.5 PAAD患者中PIK3C3和SMAD4蛋白表達分析

采用免疫組化的方法分析PAAD 中PIK3C3 和SMAD4 蛋白表達水平。對PAAD 及癌旁組織的免疫組化病理評分進行獨立樣本t檢驗以分析蛋白表達的差異性。結(jié)果表明，PIK3C3 和SMAD4 蛋白定位在PAAD 組織的細(xì)胞質(zhì)中（圖5A-B），且PAAD 組織中的PIK3C3 和SMAD4 的蛋白質(zhì)水平均明顯低于癌旁組織（均P<0.001）；ROC 曲線也證明PAAD 與癌旁組織中PIK3C3 和SMAD4 蛋白質(zhì)表達存在明顯差異，其AUC 分別為0.741 7 和0.799 1（圖5C-D），提示PIK3C3 和SMAD4 蛋白可能為PAAD 的診斷標(biāo)志物。

2.6 PIK3C3 和SMAD4 蛋白與PAAD 預(yù)后的關(guān)系分析

生存分析結(jié)果顯示，PIK3C3 或SMAD4 蛋白單獨均未對PAAD 患者的預(yù)后產(chǎn)生影響（圖6A 和6B）。接下來對PIK3C3 和SMAD4 蛋白聯(lián)合進行預(yù)后分析，將PAAD 病例分組（圖6C）。與PIK3C3 和SMAD4 蛋白為陰性的組相比，PIK3C3 或SMAD4 蛋白任意一個表達為陽性時，PAAD 患者的生存率更高（P=0.035 9）（圖6C）。

3 討 論

目前，仍缺乏有效的生物標(biāo)志物以預(yù)測PAAD發(fā)病風(fēng)險和預(yù)后[23-26]。本項研究發(fā)現(xiàn)PAAD 癌組織中PIK3C3 和SMAD4 蛋白較癌旁組織顯著下調(diào)。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)PIK3C3 及SMAD4 mRNA 同時升高，PIK3C3 或SMAD4 蛋白上調(diào)的PAAD 患者可以獲得更好的預(yù)后。

本研究中，PAAD 癌組織中PIK3C3 mRNA 表達變化不明顯。但PAAD 癌組織中，PIK3C3 蛋白表達顯著降低。由此可以推測，PAAD 組織中PIK3C3 蛋白水平的降低很可能與其降解增加有關(guān)，而與轉(zhuǎn)錄無關(guān)。

研究證實，PIK3C3 的已知生物學(xué)功能均與囊泡運輸?shù)恼{(diào)節(jié)有關(guān)，包括參與自噬，內(nèi)吞和吞噬作用等[9-10,27]。具體而言，PIK3C3 是自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。同時，部分實驗已經(jīng)證實，通過抑制PIK3C3 降低自噬可促進膀胱癌細(xì)胞的死亡，說明自噬促進膀胱癌細(xì)胞存活[28-29]。與膀胱癌不同的是，在本研究中PIK3C3 與PAAD 負(fù)相關(guān)，而VPS34為正向關(guān)鍵調(diào)控因子，由此推測自噬在不同的癌癥類型中所起的作用可能不同。

本研究發(fā)現(xiàn)SMAD4 在PAAD 癌組織中低表達，與早期的一項研究相符[30]。同時，SMAD4 在PAAD存在突變[19]，結(jié)合其蛋白在PAAD 中降低的現(xiàn)象可推斷出SMAD4 突變可導(dǎo)致其自身蛋白的不穩(wěn)定性。近期研究發(fā)現(xiàn)，SMAD4 可抑制PAAD 類器官的侵襲能力[20]，本研究并沒有發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象。

PIK3C3 或SMAD4 mRNA 單獨表達并不影響PAAD 患者的預(yù)后情況。然而，PIK3C3 和SMAD4 的組合可以很好地預(yù)測PAAD 患者的預(yù)后。SMAD4 高表達可體外抑制胰腺癌細(xì)胞的存活[31]，而抑制PIK3C3 可抑制癌癥發(fā)生[32]。兩基因單獨對癌癥的影響相反，但兩者聯(lián)合對PAAD 的影響卻是一致的，基于兩者的共表達關(guān)系推測，PIK3C3 在一定范圍內(nèi)的高表達可以促進SMAD4 的抑癌作用進而更加有助于PAAD 患者的存活。

本研究根據(jù)PIK3C3 及SMAD mRNA 表達高低將PAAD 患者分為兩個聚類：聚類1 與聚類2，聚類2中兩基因mRNA 表達較高且PAAD 患者預(yù)后更好。值得注意的是，聚類2 的PAAD 患者年齡顯著低于聚類1，而年齡大小可以影響PAAD 患者的預(yù)后，故PIK3C3 及SMAD mRNA 表達量影響PAAD 預(yù)后可能與年齡因素相關(guān)，此部分內(nèi)容有待進一步研究。同時，PIK3C3 及SMAD mRNA 表達量也有可能受年齡因素的影響。

PIK3C3 及SMAD 的mRNA 表達在PAAD 癌組織與癌旁組織中沒有明顯差異，可能由公共數(shù)據(jù)庫中PAAD 患者的正常樣本數(shù)量有限所導(dǎo)致[33]。此外，本研究存在一定的局限性，即僅使用TCGA 數(shù)據(jù)庫進行分析。

總而言之， PIK3C3 和SMAD4 蛋白可作為PAAD 潛在的診斷標(biāo)志物，PIK3C3 和SMAD4 聯(lián)合可成為PAAD 預(yù)后評估的新指標(biāo)。