陳紀(jì)平，方亞飛，李彤中，梁超

1.邯鄲市中醫(yī)院，河北 邯鄲 056001；2.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 邯鄲 056001；3.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河北 邯鄲 056038

隨著人們生活習(xí)慣和飲食的改變，便秘日漸成為影響生活質(zhì)量的重要因素[1-2]。腸腑特定穴下合穴上巨虛、募穴天樞及合募配伍是治療胃腸病的常用穴位及配伍方式。研究表明，針刺治療功能性便秘等胃腸病療效顯著[3-4]，但確切機(jī)制尚未明了。腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system，ENS）的發(fā)現(xiàn)，以及近年對其功能、結(jié)構(gòu)的深入研究，使之成為認(rèn)識相關(guān)機(jī)制的重要切入點。研究表明，針灸對ENS 調(diào)節(jié)作用明確，有助于改善ENS 異常形態(tài)和功能，促進(jìn)神經(jīng)元恢復(fù)[5-6]。我們前期研究表明，不同腧穴對ENS 不同類型神經(jīng)元具有特異性調(diào)節(jié)作用[7]。

ENS 正常生長發(fā)育及其功能完整性需多種神經(jīng)營養(yǎng)因子調(diào)控，如神經(jīng)生長因子、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）等。然而，研究發(fā)現(xiàn)，腸道內(nèi)BDNF 雖與腸動力密切相關(guān)，但并不能直接促進(jìn)結(jié)腸運(yùn)動，主要通過ENS 實現(xiàn)[8]。ENS是電針調(diào)節(jié)腸運(yùn)動的重要環(huán)節(jié)，BDNF 又與ENS 密切相關(guān)，三者的復(fù)雜關(guān)系對揭示電針調(diào)節(jié)腸運(yùn)動作用機(jī)制有重要意義?；诖耍狙芯恐苽涔δ苄员忝匦∈竽Ｐ?，觀察電針不同腧穴對腸運(yùn)動、腸道內(nèi)BDNF 及ENS 膽堿能神經(jīng)元標(biāo)志物乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）表達(dá)的影響，以腸道內(nèi)BDNF 為切入點，結(jié)合ENS，為電針調(diào)節(jié)腸運(yùn)動機(jī)制研究提供新方向。

1 材料與方法

1.1 動物

C57BL/6J 小鼠106 只，雄性，3 周齡，體質(zhì)量（20±4）g，河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（冀）2018-003，動物使用許可證號SYXK（冀）2018-008。飼養(yǎng)于溫度21～23 ℃、相對濕度40%～60%環(huán)境，12 h 明暗交替，自由攝食飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行實驗。

1.2 主要試劑與儀器

紅色碳粉（貨號TNR618B，天津市登科化學(xué)試劑有限公司），烏拉坦（貨號U0202-100G，上海青析化工科技有限公司），BDNF 抗體（貨號ab108319，英國Abcam），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（貨號AR0146，美國Thermo），電泳儀及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（貨號 1658033，美國Bio-Rad），GAPDH 抗體（貨號ab8245，英國Abcam），HRP 標(biāo)記二抗（貨號A21020，美國Abbkine），RIPA 蛋白裂解液（貨號BL504A，北京蘭杰柯科技有限公司），ChAT 抗體（貨號ab178850，英國Abcam），SDS 蛋白上樣緩沖液（貨號P0015L，南京生興生物技術(shù)有限公司）。Elx800 全自動檢測酶標(biāo)儀（美國 Bio-Tek），化學(xué)發(fā)光成像儀Bioshine ChemiQ 4800mini（上海歐翔科學(xué)儀器有限公司），HANS-100 韓式電針儀（南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司），華佗牌0.16 mm×7 mm 一次性針灸針（蘇州醫(yī)療器械有限公司）。

1.3 造模及分組

參考文獻(xiàn)[9-10]方法制備功能性便秘小鼠模型。所有小鼠單獨(dú)置于防銹鐵絲網(wǎng)籠子內(nèi)（尿液可從網(wǎng)眼間隙滲透），給予生理鹽水灌胃，首次0.2 mL/只，為防止動物機(jī)體出現(xiàn)耐受現(xiàn)象，每隔5 d 加0.05 mL/只，共14 d。為減少實驗動物本身生物節(jié)律的干擾，在固定時間段即每日9:00 開始干預(yù)刺激。根據(jù)文獻(xiàn)描述方法，觀察小鼠9～14 d 糞便質(zhì)量和性狀改變，篩選出便秘小鼠。

隨后將43 只便秘小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組。在排便時間測定中分為模型組、上巨虛組和天樞組，每組5 只；上巨虛組和天樞組各5 只用于電生理實驗。剩余18只用于Western blot 檢測，分組同上，每組6 只。各實驗中設(shè)相同數(shù)量正常小鼠為正常組。

1.4 電針干預(yù)

腧穴定位及操作參照《實驗針灸學(xué)》[11]。上巨虛（ST 37）：小鼠脛骨外側(cè)，偏下方6 mm 區(qū)域，直刺3～4 mm。“天樞”（ST 25）：小鼠前正中線旁開5 mm，恥骨聯(lián)合以上20 mm 區(qū)域，直刺2～3 mm。電針參數(shù)為2/15 Hz，1 mA。在腸運(yùn)動變化實驗中，針刺時間為1 min；在腸功能測定實驗中，電針干預(yù)時間為15 min/d，共3 d。

1.5 排便時間測定

實驗前小鼠正常飲水，禁食12 h。給予紅色碳粉懸濁液0.3 mL 灌胃，記錄小鼠首粒糞便排出紅色指示劑時間，為首粒紅便時間。

1.6 腸運(yùn)動變化分析

實驗前小鼠正常飲水，禁食12 h，腹腔注射20%烏拉坦麻醉。打開腹腔，通過標(biāo)志性器官進(jìn)行定位，快速定位至盲腸，在其下方約1 cm 處開一個小口，將自制球囊測壓探頭放置于近端結(jié)腸內(nèi)固定。手術(shù)完成后，禁止移動或改變壓力探頭位置。球囊測壓探頭一端放置于近端結(jié)腸內(nèi)部，通過三通管連接至換能器和生物信號放大器，再至RM6240 生理信號采集系統(tǒng)[12-13]。向球囊內(nèi)注入0.1～0.2 mL 水維持基線壓力在0.1～0.8 kPa。

待腸內(nèi)壓波形出現(xiàn)，穩(wěn)定20 min 后進(jìn)行后續(xù)干預(yù)。每次電針干預(yù)前，記錄1 min 波形作為基線值，再電針刺激相應(yīng)腧穴，待波形恢復(fù)穩(wěn)定，重復(fù)上述循環(huán)。RM6240 生理信號采集系統(tǒng)及相關(guān)分析軟件記錄數(shù)據(jù)，計算腸內(nèi)壓變化率。腸內(nèi)壓基線數(shù)據(jù)和電針干預(yù)時數(shù)據(jù)均取1 min 平均壓。腸內(nèi)壓變化率（%）＝電針干預(yù)時基線÷基線×100%。若變化率絕對值＜5%視為無作用，＞5%視為加強(qiáng)/減弱結(jié)腸運(yùn)動。

1.7 Western blot 檢測

干預(yù)結(jié)束后，小鼠正常飲水禁食12 h，取等量近端結(jié)腸組織，提取蛋白。BCA 法測定蛋白濃度，取30 μg 樣品經(jīng)濃度為5%濃縮膠和12%分離膠進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜。5%BSA 封閉液中浸泡，參考蛋白Marker 對應(yīng)標(biāo)識，裁剪后分別加入BDNF（1∶1 000）、ChAT（1∶800）和GAPDH（1∶10 000）一抗，4 ℃孵育過夜。第2 日加入HRP 標(biāo)記二抗，室溫孵育2 h。加入發(fā)光液曝光以獲得目的條帶，使用凝膠成像分析儀進(jìn)行拍照，以GAPDH 內(nèi)參，計算目的蛋白相對灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS18.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以表示，電生理實驗采用配對t檢驗，其他實驗不同組間用方差分析并行兩兩比較。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電針“上巨虛”“天樞”對便秘小鼠排便時間的影響

與正常組比較，模型組小鼠首粒紅便時間明顯延長（P＜0.01）；電針治療后，與模型組比較，上巨虛組小鼠首粒紅便時間明顯縮短（P＜0.01），與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），天樞組小鼠首粒紅便時間明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但未恢復(fù)至正常水平，與上巨虛組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠首粒紅便時間比較（，每組5 只）

2.2 電針“上巨虛”“天樞”對便秘小鼠近端結(jié)腸運(yùn)動的影響

與基線比較，上巨虛組小鼠結(jié)腸腸內(nèi)壓明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且腸內(nèi)壓變化率＞5%。見圖2、圖3。

圖2 電針對2 組小鼠近端結(jié)腸腸內(nèi)壓變化的影響

圖3 2 組小鼠近端結(jié)腸腸內(nèi)壓比較（，每組5 只）

2.3 電針“上巨虛”“天樞”對便秘小鼠近端結(jié)腸組織腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組小鼠近端結(jié)腸組織BDNF和ChAT 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；電針后，上巨虛組小鼠近端結(jié)腸組織BDNF 和ChAT 蛋白表達(dá)較模型組顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），且恢復(fù)至正常，天樞組小鼠近端結(jié)腸組織BDNF 和ChAT蛋白表達(dá)無明顯變化，與正常組和上巨虛組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見圖4～圖7。

圖4 各組小鼠近端結(jié)腸組織BDNF 蛋白免疫印跡圖

圖5 各組小鼠近端結(jié)腸組織BDNF 蛋白表達(dá)比較（，每組6 只）

圖6 各組小鼠近端結(jié)腸組織ChAT 蛋白免疫印跡圖

圖7 各組小鼠近端結(jié)腸組織ChAT 蛋白表達(dá)比較（，每組6 只）

3 討論

便秘屬陽明腑證，多表現(xiàn)為胃腸不適，排便困難。上巨虛乃大腸之下合穴，《黃帝內(nèi)經(jīng)》有“治府者，治其合”“合治內(nèi)府”，表明下合穴是治療六腑病癥主要腧穴之一。天樞作為大腸的募穴，《黃帝內(nèi)經(jīng)》記載“居陰陽升降之中，是為天樞”，可升降清濁，調(diào)脾胃、利大便?！峨y經(jīng)》提到“陽病行陰，故令募在陰”，即治療六腑病癥多取募穴。研究表明，上巨虛和天樞常用于治療便秘等胃腸疾病[14-15]?！镀⑽刚摗酚涊d“凡治腹之募，皆為元?dú)獠蛔恪?，但下合穴則常“通降腑氣”，可見，在治療過程中，二者作用不盡相同，各有側(cè)重。

本研究結(jié)果表明，電針“上巨虛”“天樞”對便秘小鼠均有恢復(fù)作用，但效果并不完全相同。在近端結(jié)腸部位，“上巨虛”可促進(jìn)腸運(yùn)動，而“天樞”無明顯作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，“上巨虛”可調(diào)節(jié)近端結(jié)腸內(nèi)低表達(dá)的BDNF 至正常水平，而“天樞”無此作用。研究表明，腸道內(nèi)BDNF 及其受體廣泛分布[16-17]。有研究發(fā)現(xiàn)，在功能性消化不良患者胃腸內(nèi)BDNF mRNA 水平顯著下調(diào)[18]。此外有報道，小鼠BDNF 基因被敲除后腸動力顯著下降[19]。可見，腸道內(nèi)BDNF 正常水平參與維持腸動力的穩(wěn)定。本研究結(jié)果也顯示，便秘小鼠近端結(jié)腸內(nèi)BDNF 表達(dá)明顯下降，“上巨虛”和“天樞”對其調(diào)節(jié)作用亦不相同，提示腸道內(nèi)BDNF 可能介導(dǎo)了二者的效應(yīng)差異。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，“上巨虛”可調(diào)節(jié)異常表達(dá)的ChAT 至正常水平，即恢復(fù)ENS 中受損的膽堿能神經(jīng)元，而“天樞”無此作用，該結(jié)果與二者調(diào)節(jié)BDNF呈相似趨勢。有研究曾提出，BDNF 并不能直接影響腸動力，而是通過聯(lián)系ENS，加強(qiáng)突觸間的傳遞，從而調(diào)節(jié)腸動力[20]。在ENS 中，膽堿能神經(jīng)元即ChAT陽性神經(jīng)元為主要的興奮性神經(jīng)元，通過釋放乙酰膽堿（Ach）促進(jìn)平滑肌收縮[21]。研究發(fā)現(xiàn)，突觸活動可活化蛋白激酶C（PKC），隨后參與調(diào)節(jié)Ach 釋放，促進(jìn)膽堿能收縮，而BDNF 與受體結(jié)合后可通過PKC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)加強(qiáng)突觸活動，進(jìn)一步影響膽堿能收縮[22]。另有研究發(fā)現(xiàn)，PKC 在發(fā)揮功能前需要被3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）激活，而PDK1 誘導(dǎo)PKC磷酸化必須由突觸活動引起，BDNF 與受體結(jié)合后無法介導(dǎo)[23]。這可能是BDNF 并不能直接發(fā)揮作用的主要原因。由此可見，電針治療便秘時，腸道內(nèi)BDNF并非“類神經(jīng)遞質(zhì)”的角色，電針可通過恢復(fù)ENS中ChAT 蛋白表達(dá)水平，從而調(diào)節(jié)Ach，促進(jìn)膽堿能收縮，而BDNF 則進(jìn)一步加強(qiáng)該作用。

腸道內(nèi)BDNF 在電針過程中，以“放大器”樣角色參與電針效應(yīng)，即腸道內(nèi)BDNF 通過聯(lián)系ENS 膽堿能神經(jīng)元介導(dǎo)了電針“上巨虛”和“天樞”的效應(yīng)差異。BDNF 與受體結(jié)合后通過何種信號通路參與PKC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)從而介導(dǎo)電針效應(yīng)，值得進(jìn)一步深入研究。